Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
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カーラ・J・シャッツ博士の助言と支援、バーバラ・K・ブロット博士、ミシェル・K・ドリューズ博士の原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。この作品はNIH EY02858とマザーズ慈善財団がCJSに助成金を提供しています。

このプロトコルは、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用のためのガイドに従って行われ、スタンフォード大学の施設動物ケアと使用委員会によって承認されています。方法は、神経科学研究における動物と人間の使用に関する神経科学学会の方針にも従っています。
注:すべてのマウスは病原体のない環境で維持された。C57Bl/6 x SV/129J遺伝的背景を組み合わせた野生?...

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

ここで説明するプロトコルは、成体および老化マウスから得られた海馬スライスが切断後何時間も健康で生存可能であり続けることができることを示している。このプロトコルを使用して作成されたスライスは、パッチクランプの記録だけでなく、CA1リージョンでの長時間のフィールド記録に適しています。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。最初のス?...

哺乳動物急性脳スライス製剤の出現は、以前はAplysia1のような無脊椎動物製剤でのみ可能であった細胞およびシナプスレベルでの実験を促進した。急性海馬スライスの開発は、ワーキングメモリとコンテキスト形成を担当する構造であり、容易な生理学的操作に適した特殊なトライシナプス回路を有するため、特に重要であった。しかし、急性脳スライスの大部分は、健康なニューロンおよび回路を維持する方が容易であり、スライスは22、3、43,4の長い期間生存可能なままであるため、比較的若いマウスおよびラットからまだ調製される。ここでは、成体および老化マウスからの急性海馬スライスの生存率を高める標準的なスライスプロトコルの変更を紹介する。
哺乳類の脳実質の長期的なex vivo生存率への主要な障害は、切断後に脳への血流が止まると急速に起こる最初の低酸素損傷である。酸素の損失は、ホスホクレアチン(P-クレアチン)の損失が最も急速である脳内の主要なエネルギー資源の速い代謝消費をもたらし、次いでグルコース、アデノシン三リン酸(ATP)、およびグリコーゲン4が続く。ATPの保存は、脳スライスの長期的な健康にとって特に重要であり、NA-K ATPaseを介して膜電位を維持するためにATPが必要であり、その結果、神経活動55、6。6成人げっ歯類脳のATPレベルは〜2.5mMであり、約1分の切断後4,4、7、8,8で基底定常状態(約0.5mM)に達するために切断の20s以内に急激に低下する。若い動物では、ATPの同じ低下を観察するのに時間がかかります(〜2分)。フェノバルビタール麻酔では4分4までさらに遅くなる。これらの考慮事項は、ATPおよび他のエネルギー資源の損失を防ぐことは、脳への低酸素損傷を防ぎ、特に成虫動物においてより長い期間にわたって脳スライスの健康を維持するために必要な戦略であることを示している。
低温は代謝を遅くする。その結果、控えめな低体温は脳エネルギー埋蔵量を保護することが実証されている:若い動物では、体温を6度下げ、37°Cから31°Cに、制御された低酸素の4時間にわたって正常レベルの約80%にATPレベルを維持する9。Pクレアチンレベルも同様に保存され、全体的なリン酸化電位9.これは、切断前の体温を下げることは、スライス切断およびスライス回復期間を通じてATPのほぼ正常レベルを維持することができるので、神経保護であり得ることを示唆している。
切断時にATP低下を完全に防止できない程度に、Na-K ATPaseの部分的に障害のある機能が期待され、続いて受動ナトリウム流入による脱分極化が予想される。受動的なナトリウム流入が続いて細胞への水の侵入が続くにつれて、細胞毒性の浮腫と最終的にピクノーシスを引き起こす。成虫ラットでは、スライス切断液中でNa+イオンをスクロースに置き換えることは、細胞傷害性浮腫10,11,11の負担を軽減する戦略として成功している。最近では、ナトリウムチャネル透過率,12を減少させるメチル化有機カチオンは、特に成体マウスからのスライスにおいて、特に成人マウスからのスライスにおいて、N-メチル-D-グルカミン(NMDG)が13、14、15、16の異なる13,14,15年齢および脳領域にわたって最も広く適用可能である、スクロースよりも効果的な保護を提供することが示されている。16
多くの脳スライスプロトコルは、スライス切断ステップ中にのみ冷たい温度を使用することを含み、時にはNa+イオン置換戦略16、17,17と組み合わせて。若い動物では、頭蓋骨はまだ薄く、取り除きが簡単なので、脳は切断後に迅速に抽出することができるので、これらのプロトコルは十分な神経保護を提供するように見える。しかし、この戦略は、成虫の動物から健康的なスライスを生成しません。時間が経つにつれて、成虫のげっ歯類を研究する多くの研究室は、動物の体温を低下させ、したがって切断前に脳に低酸素損傷を与えるために氷冷溶液で経心輸を導入してきた。この手順は、小脳スライス18、中脳スライス19、新皮質スライス11、20、20海中11皮質21、ラット海馬10、22、23、22,23嗅球10球24、腹側線条体25、視覚皮質26を生成するために正常に適用された。
ラットおよびマウスのいくつかの脳領域でのスライスを調製する術後灌流およびNa+イオン置換によって提供される利点にもかかわらず、マウス海馬は低酸素13、20,20から保護する最も困難な領域の1つである。現在までに、老化したマウスおよび神経変性のマウスモデルから海馬をスライスする最も一般的なアプローチの1つは、孤立した海馬27の古典的な高速スライスを伴う。ここで説明するプロトコルでは、動物に氷冷Na+-無料のNMDGベースの人工脳脊髄液(NMDG-aCSF)を経線的に浸透させることによって、切断前に低体温症を導入することにより、成人脳におけるATPの損失を最小限に抑える。スライスは、氷冷Na+-free NMDG-aCSFでカットされます。この強化されたプロトコルにより、スライス後最大10時間健康で、長期的なフィールドレコーディングやパッチクランプ研究に適した成体および老化マウスから急性海馬スライスを取得します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

急性海馬スライスは、神経科学者の世代がシナプス、神経細胞、および回路特性を詳細かつ高忠実に探求することを可能にしました。LTPとLTDのメカニズムの探査、単一ニューロン樹状計算、回路の経験依存的変化は、この古典的な準備なしには不可能でした。しかし、いくつかの例外を除いて、シナプスおよび本質的な興奮性メカニズムがP60を過ぎて到達する長い発達尾を有するにもかかわらず、急性海馬スライスを使用してほとんどの基礎研究は、比較的若い年齢のげっ歯類からのスライスを使用して行われてきた〜P20-P40。若い海馬スライスを使用する主な魅力は、低酸素損傷に対する耐性の高い助けとなる神経細胞の健康の維持です。しかし、発達のより成熟した段階での神経機能を理解する必要があり、加齢脳準備を必要とする神経変性疾患の様々な動物モデルの開発によってさらに強調される。ここでは、成人および老化したマウス海馬から健康的なスライスを確実に送達する急性海馬スライス調製物の変更について説明する。プロトコルの重要なステップは、経心面灌流と氷冷ナトリウムフリーNMDG-aSCFによる切断です。これらのステップは、切断時のATPにおける低酸素低下と、受動ナトリウムフラックスによって引き起こされる細胞傷害性浮腫を減衰させる。振動マイクロトームを用いて海馬と皮質の横切りスライスをカットする方法を実演します。この方法で得られた急性海馬スライスは、記録の多くの時間にわたって確実に健康であり、蛍光標識ニューロンのターゲティングを含むフィールドレコーディングとターゲットパッチクランプ記録の両方に適しています。

上記のプロトコルを適用して、CamKIIa-Cre+から海馬スライスを生成しました。混合遺伝的背景C57Bl/ 6 x SV / 129J上のWTマウス、P > 120で。CA1フィールド(図2A)およびsubiculum(図2B)の多数の錐体細胞は、薄いコントラストで観察すると低コントラストで現れる(IR-DIC)、スライス調製における健康な細胞の特徴である。この準備により、ギガオームシールの高率(...

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Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

ここで提示されるプロトコルは、成人および老化したマウス海馬スライスの調製中に過度の低酸素損傷を減少させ、成熟したおよび老化した神経回路の機能を研究するための主要な障害を取り除く。ナトリウムフリー溶液中の低体温の導入は、切断後最大10時間健康で、長期的なフィールド録音とパッチクランプ研究の両方に適した海馬スライスをもたらす。海馬スライスを調製するこの方法は、定義上老化脳製剤を必要とする神経変性疾患の動物モデルに特に関連する可能性がある。このプロトコルの最も重要なステップは、氷冷溶液を用いた経心拡散を介した低体温症の導入である。いくつかの練習で、研究者はこのステップを確実に実行することができます。回復チャンバーとその後の記録のためのaCSF溶液の1リットルを準備することで始めます。次に、経心拡散および切断工程用に300ミリリットルのNMDG-aCSFを調製します。振動するミクロトーム切断トレイと取り付けディスクをマイナス20°Cの冷凍庫に入れます。回収チャンバーを準備するには、メッシュを保持するスライスのすぐ上にそれを充填し、室温でベンチにチャンバーを維持バブラーを開始します。氷の結晶が表面とボトルの壁に形成され始めるまで、冷凍庫でNMDG-aCSFの全体の300ミリリットルを冷やします。冷やしたNMDG-aCSFを入れたボトルを氷の上に置き、溶液を0°Cと2°Cの間に保ちます。ティッシュ取り付けディスクを冷凍庫から取り出し、必要に応じて乾かします。マウスの脳の大きさについて5%寒天のブロックを切り取り、シアノアクリル接着剤の薄い層を使用してディスクの中央に接着します。氷の上に接着した寒天でディスクを置き、使用する準備ができるまでペーパータオルで覆います。カッティングトレイを冷凍庫から取り出し、ミクロトームに入れ、氷で囲んでブレードを積みます。脳解剖のために事前にすべてのツールを準備します。心筋灌流用の蠕動ポンプを設置します。ポンプチューブの片側をアイスNMDG-aCSFでボトルに挿入し、もう一方の側に27ゲージの針を装着します。ポンプ速度を毎分約3.5ミリリットルに設定します。この速度では、NMDG-aCSFの流出は高速なトリップであり、連続的なフローではありません。おむつの上にマウスを背の上に置きます。続行する前に、つま先ピンチを行うことにより、マウスが麻酔の外科面にあることを確認した。マウスは反応せず、胸と腹部が露出するように前脚と後ろ足をテーピングする必要があります。胸骨の下から喉に行く、胸の皮膚の大きなパッチを切り取ります。胸骨を鉗子でつかみ、そっと持ち上げ、胸腔が露出するまで両側のリブケージを切り抜け始めます。横隔膜を切り抜き、肋骨ケージのフラップを細い筋肉を介して取り付けたままにします。露出した胸腔にフォールバックすることなく、それを脇に置くことも可能であるはずです。心臓がまだ鼓動していることを確認し、肝臓のほとんどが見えるようにしてください。左心室に針を挿入し、右よりも明るく見えます。針を安定させるために、体の左側の残りの肋骨を通してそれを駆動します。暗い赤い色の右心房を見つけ、小さいはさみでそれを切り取ります。血液が流れ出し始めるはずです。ポンプを起動し、赤から茶色に色を変更する肝臓を観察します。肝臓の色を監視し、肝臓が淡い茶色になるまで灌流を続けます。ポンプを数分間実行します。動物の体温は摂氏28〜29度に下がる必要があり、その鼻は触れるに冷たいはずです。大きな切断ハサミでマウスの首を切り落とし、10番の刃を持つメスを使って頭蓋骨の上の皮膚を切り開きます。小さな斜められたはさみで、真中線で頭蓋骨を切ります。次に、ナンバー3の鉗子を使用して頭蓋骨の右半分と左半分を詮索し、硬膜を取り除くように注意してください。ヘラでそれをすくい取ることによってオフホワイト色であるべき脳を取り除き、氷の上のNMDG-aCSF溶液に落とします。そこには1分間放置してください。NMDG-aCSFから脳を取り出し、フィルターペーパーの上に置きます。前脳の鼻の端から正中線を中心とした60度のツールで、組織の60度のくさびを切って取り除きます。海馬スライスに適切な角度を与えるように、取り付け面のカット側を使用してください。メスで中半球を中間線に分け、取り付けディスクに接着します。取り付けディスクを氷から取り出し、必要に応じて乾かします。その後、寒天ブロックの前に各半球を接着し、側面を切り取ります。両半球の腹側が寒天ブロックに触れ、両半球の裏側がブレードに面していることを確認します。カット側に接着する場合、各半球は、その場での裏海馬の横切りスライスを保証する方法でブレードに対して相対的に向き合う必要があります。円盤を半球に沈め、氷冷カルボゲン化されたNMDG-aCSFを含む切断室に浸します。400マイクロメートルのセクションを切断し、カットオフチップ付きの使い捨て可能なトランスファーピペットを使用して、室温でカルボゲン化されたNMDG-aCSFを含む回収室にスライスを移します。残りの切片を切断し、10分以上かけて回復室に移し、歩行海馬領域から合計8〜10スライスを切断します。記録する前に約2時間室温でスライスをインキュベートします。このプロトコルは、成体マウスから海馬スライスを生成するために使用されました。CA1分野およびsubiculumの多数の錐体細胞は、赤外差動対比顕微鏡下で観察された場合、健康な細胞の特徴である低コントラストで現れる。パッチクランプの記録は、生後6ヶ月以上のマウスのCA1ニューロンから得ることができます。ここでの実験例では、制御条件に対してNMDA-LTDが誘導された後に、ミニチュア興奮性ポストシナプス電流の頻度を測定した。NMDA-LTD誘導後のニューロンでは、縮小励起後の過動電流の頻度が低く、CA1におけるあらすじの活性依存剪定を示す。振幅の変化は検出されませんでした。mEPSCの記録の間に、CA1細胞もまた、生物細胞を満たし、無傷の樹状の樹状樹状および錐体ニューロンの健康な細胞習慣がここで見ることができる。細胞全体の蛍光色素の強い分布は異なった条件の樹状突起および樹状棘の分析を可能にする。約170%のCA3-CA1シナプスの長期増強(LTP)が観察され、LTPに必要なシグナル伝達カスケードの維持が成体マウスから調製されたスライスに存在することを示唆した。堅牢なフィールド興奮性ポストシナプス電位信号は、ネットワーク接続も維持されたことを示唆しています。プロトコルの2つの重要な側面は、低体温を誘導する氷冷溶液を用いた心筋拡散と、細胞毒性浮腫を防ぐための溶液中のナトリウムイオン代替品としてのNMDGの導入である。これらの予防措置を使用して、急性のスライスは、任意の脳領域から調製することができる。また、この方法で作製したスライスは、2光子または広視野顕微鏡を用いたカルシウムおよび電圧イメージングに使用することができる。このプロトコルは、老化した動物からの急性海馬スライスの標準化された準備の基礎となり、神経変性疾患メカニズムの文脈における研究間の比較を容易にする可能性がある。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

β-アミロイドオリゴマーの調製 1から42まで</sub海馬スライスでのシナプス可塑性の減損の>と誘導

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

海馬の齧歯動物の脳スライスにおけるシナプス密度の評価

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

新生児マウスにおける低酸素虚血期における連続映像脳波

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...