Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
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카를라 J. 샤츠 박사에게 조언과 지원을 해주신 것에 대해 감사드리며, 바바라 K. 브로트 박사와 미셸 K. 드루스 박사가 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 NIH EY02858과 MATHers 자선 재단이 CJS에 보조금을 지급함으로써 지원됩니다.

이 프로토콜은 국립 보건원의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되며 스탠포드 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 방법은 또한 신경 과학 연구에서 동물과 인간의 사용에 신경 과학 에 대 한 사회의 정책에 따라.
참고: 모든 마우스는 병원균이 없는 환경에서 유지되었습니다. 혼합 C57Bl/ 6 x SV/ 129J 유전 적 배경에 야생 형 마우스는 달?...

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M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

여기에 설명된 프로토콜은 성인 및 노화 마우스에게서 얻은 해마 조각이 절단 후에 많은 시간 동안 건강하고 실행 가능한 남아 있다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 슬라이스는 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 CA1 영역에서 오래 지속되는 필드 레코딩에 적합합니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째 단계는 얼음 차가운 용액을 가진...

포유류 급성 뇌 슬라이스 제제의 출현은 이전에 는 Aplysia1과같은 무척추 동물 제제에서만 가능했던 세포 및 시냅스 수준에서 실험을 촉진하였다. 급성 해마 슬라이스의 개발은 작업 기억과 문맥 형성을 담당하는 구조이기 때문에 특히 의미가 있었고, 생리학적 조작이 용이한 전문 삼중 시냅스 회로를 가지고 있다. 그러나, 급성 뇌 슬라이스의 대부분은 건강한 뉴런과 회로를 보존하는 것이 더 쉽기 때문에 상대적으로 젊은 마우스와 쥐로부터 여전히 준비되고, 슬라이스는 시간2,,3,,4의긴 기간 동안 실행 가능한 남아있다. 여기에서는 성인 및 노화 마우스에서 급성 해마 슬라이스의 생존 가능성이 증가하는 표준 슬라이스 프로토콜에 대한 수정을 소개합니다.
포유류 뇌 의 장기 전 생체 생존가능성에 대한 주요 장애물은 뇌로의 혈류가 중단되면 급속히 발생하는 초기 저산소 손상입니다. 산소의 손실은 인 크레아틴 (P-크레아틴)의 손실과 함께 뇌의 주요 에너지 자원의 빠른 신진 대사 소비의 결과 가장 빠른 되고, 포도당, 아데노신 삼호산염 (ATP), 및 글리코겐4다음. ATP의 보존은 NA-K ATPase를 통해 멤브레인 잠재력을 유지하기 위해 ATP가 필요하므로 뇌 슬라이스의 장기적인 건강에 특히 중요하며, 결과적으로 신경 활동5,,6. 성인 설치류 뇌의 ATP 수준은 ~2.5mM이며, 20초 이내에 급격히 떨어뜨려 약 1분 후 참수4,,7,,8에서기저 정상 상태(~0.5mMM)에 도달한다. 젊은 동물에서 ATP (~2분)에서 동일한 하락을 관찰하는 데 시간이 더 오래 걸립니다. 페노바르비탈 마취로 4분4로더 느려집니다. 이러한 고려 사항은 ATP 및 기타 에너지 자원의 손실을 방지하는 것은 뇌에 저산소 손상을 방지하고 차례로 오랜 기간 동안 뇌 슬라이스의 건강을 유지하기 위해 필요한 전략임을 보여줍니다, 특히 성인 동물.
낮은 온도는 신진 대사를 느리게. 따라서, 겸손한 저체온증이 뇌 에너지 매장량을 보호한다는 것이 입증되었습니다: 젊은 동물의 경우 체온을 6도 낮추고 37°C에서 31°C로, ATP 수준을 대조저 저산소증9의4시간 이상 정상 수준의 약 80%로 보존한다. P-크레아틴 수준은 유사하게 보존되고, 또한 전반적인 인산화전위도 9. 이것은 ATP의 거의 정상 수준이 슬라이스 절단 및 슬라이스 복구 기간을 통해 유지 될 수 있기 때문에 참수 전에 체온을 낮추는 것은 신경 보호일 수 있음을 시사합니다.
ATP 낙하가 참수 시 완전히 예방할 수 없는 정도까지, Na-K ATPase의 부분적으로 손상된 기능이 예상되며, 이어서 수동 나트륨 유입을 통한 탈극화가 뒤따릅니다. 수동 나트륨 유입은 세포로 물 입력에 선행되기 때문에, 그것은 세포 독성 부종과 결국 pyknosis를 일으키는 원인이 됩니다. 성인 쥐에서, 슬라이스 절단 솔루션에서 자당으로 Na + 이온을 교체하는 것은 세포 독성 부종의 부담을 완화하는 성공적인 전략이었다10,,11. 최근에는 나트륨 채널 투과성을 감소시키는 메틸화된 유기 양이온(12)은 특히 성인 마우스의 슬라이스에서 자당보다 더 효과적인 보호를 제공하는 것으로 나타났으며, N-메틸-D-글루카민(NMDG)은12 13,14,,15,,16에걸쳐 가장 광범위하게 적용되고 있다.,
수많은 뇌 슬라이스 프로토콜은 슬라이스 절단 단계에서만 차가운 온도를 사용하는 것을 포함하며 때로는 Na+ 이온 교체 전략16,,17과함께 합니다. 젊은 동물에서, 이러한 프로토콜은 두개골이 여전히 얇고 제거하기 쉽기 때문에 참수 후 신속하게 추출 할 수 있기 때문에 충분한 신경 보호를 제공하는 것으로 보인다3. 그러나,이 전략은 성인 동물에서 건강한 조각을 생산하지 않습니다. 시간이 지남에 따라, 성인 설치류를 연구하는 실험실의 숫자는 동물의 체온을 감소시키기 위해 얼음 차가운 솔루션과 경전 관혈을 도입했다, 따라서 뇌에 저산소 손상, 참수하기 전에. 이 절차는 소뇌 슬라이스18,중뇌 슬라이스19,신피성 슬라이스11,,20,과리라인 피질21,쥐 해마10,,22,,23,후각 전구24,복부 줄기 줄기25,시각 피질26을성공적으로 적용했다.
쥐와 쥐의 일부 뇌 영역에서 슬라이스를 준비하는 동안 경내 관류및 Na+ 이온 교체에 의해 제공되는 장점에도 불구하고, 마우스 해마는 저산소증으로부터 보호하기 위해 가장 어려운 영역 중 하나 남아13,,20. 현재까지, 신경 변성의 노화 마우스와 마우스 모델에서 해마를 슬라이스하는 가장 일반적인 접근 중 하나는 고립 된 해마(27)의고전적인 빠른 슬라이스를 포함한다. 여기에 설명된 프로토콜에서, 우리는 얼음 감기 Na+-무료 NMDG 기지를 둔 인공 뇌척수액 (NMDG-aCSF)로 동물을 경감하여 반갑게 침범하기 전에 저체온증을 도입하여 성인 뇌의 ATP의 손실을 최소화합니다. 슬라이스는 얼음 차가운 Na+-무료 NMDG-aCSF로 절단됩니다. 이 향상된 프로토콜로 우리는 슬라이스 후 최대 10 시간 동안 건강하고 장기 현장 기록 및 패치 클램프 연구에 적합한 성인 및 노화 마우스에서 급성 해마 조각을 얻습니다.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

급성 해마 슬라이스는 신경 과학자의 세대를 활성화하여 시냅스, 뉴런 및 회로 특성을 자세히 탐구하고 충실도가 높습니다. LTP 및 LTD 메커니즘, 단일 신경 수지상 계산 및 회로의 경험에 의존하는 변화의 탐구는 이 고전적인 준비 없이는 불가능했을 것입니다. 그러나, 몇 가지 예외를 제외하고, 급성 해마 슬라이스를 사용하여 대부분의 기본적인 연구는 상대적으로 젊은 연령의 설치류에서 조각을 사용하여 수행되었습니다, ~ P20-P40, 시냅스 및 본질적 흥분 성 메커니즘은 P60 과거에 도달하는 긴 개발 꼬리를 가지고 있지만. 젊은 해마 슬라이스를 사용 하 여의 주요 매력은 저 산소 손상에 높은 내성에 의해 도움이 신경 건강의 보존. 그러나, 노화 뇌 준비를 필요로 하는 신경 퇴행성 질환의 다양한 동물 모델의 개발에 의해 더욱 강조되는 발달의 더 성숙한 단계에서 신경 기능을 이해할 필요가 있다. 여기서 우리는 안정적으로 성인과 노화 마우스 해마에서 건강한 조각을 제공하는 급성 해마 슬라이스 준비에 대한 수정을 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 간 근사 관류와 얼음 차가운 나트륨이 없는 NMDG-aSCF로 절단하는 것입니다. 함께, 이러한 단계는 참수 시 ATP에 저산소증 유발 하 강 하 뿐만 아니라 수동 나트륨 플럭스로 인한 세포 독성 부종을 감쇠. 우리는 진동 마이크로 토메를 사용하여 해마 플러스 피질의 트랜스 버들 조각을 잘라하는 방법을 보여줍니다. 이러한 방식으로 얻은 급성 해마 슬라이스는 여러 시간 동안 안정적으로 건강하며 형광으로 표시된 뉴런을 대상으로 하는 필드 레코딩 및 표적 패치 클램프 레코딩 모두에 적합합니다.

우리는 CamKIIa-Cre +에서 해마 조각을 생성하기 위해 위의 프로토콜을 적용; 혼합 유전 배경 C57Bl / 6 x SV / 129J, P > 120에 WT 마우스. CA1 분야에서 많은 수의 피라미드세포(도 2A)및수분(도 2B)은슬라이스 제제에서 건강한 세포의 특징인 적외선 차분 콘트라스트 현미경 검사법(IR-DIC)에서 관찰될 때 낮은 콘트라스트로 나타납니다. 이 준비와 함께 기가옴 씰의 높?...

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Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

이것은 조직에 저산소 손상을 줄이기 위해 얼음 차가운 NMDG-aCSF와 함께 경내 관류 및 슬라이스 절단을 활용하는 성인 및 노화 마우스 해마의 급성 슬라이스 준비를위한 프로토콜입니다. 결과 슬라이스는 여러 시간 동안 건강하게 유지되며 장기 패치 클램프 및 필드 레코딩에 적합합니다.

성인과 노화 마우스에서 해마 조각에서 저산소증 최소화

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

여기에 제시 된 프로토콜은 성인과 노화 마우스 해마 슬라이스의 준비 중에 과도한 저산소 손상을 감소시켜 성숙하고 노화하는 신경 회로의 기능을 연구하기위한 주요 장애물을 제거합니다. 나트륨 프리 솔루션에 저체온증의 도입은 절단 후 최대 10 시간 동안 건강하고 장기 현장 기록 및 패치 클램프 연구 모두에 적합한 해마 슬라이스를 초래합니다. 해마 슬라이스를 준비하는이 방법은 정의에 따라 노화 뇌 준비를 필요로하는 신경 퇴행성 질환의 동물 모델에 특히 관련이있을 수 있습니다.이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 얼음 차가운 용액을 가진 경내 풍부를 통해 저체온증을 도입하는 것입니다. 몇 가지 연습을 통해 연구자들은 이 단계를 안정적으로 실행할 수 있습니다. 먼저 복구 챔버 및 후속 레코딩을 위해 aCSF 솔루션 1리터를 준비합니다.그런 다음 경내 증식 및 절단 단계를 위해 300 밀리리터의 NMDG-aCSF를 준비합니다. 진동하는 미세 토메 절단 트레이와 장착 디스크를 영하 20도 냉동고에 놓습니다. 복구 챔버를 준비하려면 메시를 들고 있는 슬라이스 바로 위에 채우고 실온에서 챔버를 벤치에 보관하는 버블러를 시작합니다.얼음 결정이 표면과 병의 벽에 형성되기 시작할 때까지 냉동고에서 NMDG-aCSF의 전체 300 밀리리터를 식힙니다. 차가운 병과 NMDG-aCSF를 얼음위에 놓고 거품을 내고 용액을 섭씨 0도에서 2도 사이로 유지합니다. 티슈 마운팅 디스크를 냉동고에서 꺼내 필요한 경우 건조시 닦아냅니다.마우스 뇌의 크기에 대한 5 %의 천 블록을 잘라 시아노아크라일트 접착제의 얇은 층을 사용하여 디스크의 중심에 접착제. 디스크에 붙어 있는 한천을 얼음 위에 놓고 사용할 준비가 될 때까지 종이 타월로 덮습니다. 절단 트레이를 냉동고에서 꺼내 마이크로톤에 넣은 다음 얼음으로 둘러싸고 블레이드를 적재합니다.뇌 해부에 대한 모든 도구를 미리 준비합니다. 경동맥 관류용 연동 펌프를 설정합니다. 아이스 NMDG-aCSF로 펌프 튜브의 한쪽을 병에 넣고 27 게이지 바늘로 다른 쪽에 맞습니다.펌프 속도를 분당 약 3.5 밀리리터로 설정합니다. 이 속도로 NMDG-aCSF의 유출은 연속 흐름이 아니라 빠른 여행입니다. 마우스를 뒷면에 기저귀에 놓습니다.계속하기 전에 마우스가 발가락 핀치를 수행하여 마취의 수술 비행기에 있음을 확인했습니다. 마우스는 응답하지 않아야하며 가슴과 복부가 노출되도록 앞다리와 뒷다리를 테이프로 두어야합니다. 흉골 아래에서 목구멍까지 가는 가슴에 있는 피부의 큰 패치를 잘라냅니다.흉골을 집게로 잡고 부드럽게 들어 올리고 가슴 구멍이 노출 될 때까지 양쪽의 늑골 케이지를 절단하십시오. 다이어프램을 잘라내어 얇은 근육을 통해 갈비뼈가 부착된 상태로 둡시합니다. 노출된 가슴 구멍에 다시 떨어지지 않고 따로 설정할 수 있어야 합니다.심장이 여전히 뛰고 있는지 확인하고 대부분의 간이 보이는지 확인하십시오. 바늘을 왼쪽 심실에 삽입하면 오른쪽보다 색상이 밝아 보입니다. 바늘을 안정시키기 위해 신체의 왼쪽에 남아있는 갈비뼈를 통해 운전하십시오.어두운 붉은 색 오른쪽 아트리움을 찾아 작은 가위로 잘라냅니다. 피가 흘러나오기 시작해야 합니다. 펌프를 시작하고 빨간색에서 갈색으로 색상을 변경하는 간을 관찰합니다.간 색상을 모니터링하고 간이 옅은 갈색으로 변할 때까지 관류를 계속합니다. 펌프를 몇 분 더 실행합니다. 동물의 체온은 섭씨 28~29도로 떨어지고 코가 차가워야 합니다.큰 참수 가위로 마우스를 참수한 다음 숫자 10 블레이드가있는 메스를 사용하여 두개골 위에 피부를 열어 두습니다. 작은 각진 가위로, 미드라인에서 두개골을 잘라. 다음으로, 두개골의 오른쪽과 왼쪽 절반을 멀리 캐비 번호 세 개의 집게를 사용하여, 그것으로 멀리 두라를 가지고조심.주걱으로 떠서 흰색색이 되어야 하는 뇌를 제거하고 얼음 위에 있는 NMDG-aCSF 솔루션에 넣습니다. 최대 1분 동안 그대로 둡니다. NMDG-aCSF에서 뇌를 꺼내 필터 용지에 놓습니다.전뇌의 로스트랄 끝에서 중간선을 중심으로 60도 도구를 사용하여 60도 의 조직 웨지를 잘라 제거합니다. 마마 조각에 적합한 각도를 제공하기 때문에 마운팅 표면의 절단 면을 사용합니다. 반구를 미드라인 아래로 메스로 분리하고 장착 디스크에 붙입니다.얼음에서 장착 디스크를 가지고 필요한 경우 건조 닦아. 그런 다음 한천 블록 앞에 각 반구를 붙이면 측면을 줄입니다. 양 반구의 복부 면이 한천 블록을 만지고 있고 양 반구의 등쪽이 블레이드를 향하고 있는지 확인합니다.절단 측에 접착할 때, 각 반구는 그 점에서 등쪽 해마의 횡방향 조각을 보장하는 방식으로 블레이드를 기준으로 지향되어야 합니다. 반구와 디스크를 얼음 차가운 발보성 NMDG-aCSF를 포함하는 절단 챔버로 잠급한다. 400 마이크로미터 섹션을 잘라낸 다음 컷오프 팁이 있는 일회용 이송 파이펫을 사용하여 실온에서 이보게겐화된 NMDG-aCSF를 포함하는 복구 챔버로 슬라이스를 전송합니다.나머지 부분을 절단하고 회생실로 옮기는 데 10분이 지나지 않고 등해학 부위에서 총 8~10개의 슬라이스를 자르십시오. 기록하기 전에 실온에서 슬라이스를 약 2 시간 동안 배양합니다. 이 프로토콜은 성인 마우스에서 해마 조각을 생성하는 데 사용되었다.CA1 필드와 체증에 있는 피라미드 세포의 다수는 적외선 차등 대조 현미경검사의 밑에 관찰될 때 건강한 세포의 특징인 낮은 대비에서 나타납니다. 패치 클램프 레코딩은 생후 6개월 이상인 마우스의 CA1 뉴런으로부터 얻을 수 있다. 본 예실험에서, NMDA-LTD가 제어 조건에 따라 유도된 후 소형 흥분절기 전류의 주파수를 측정하였다.소형 흥분성 포스트 냅 스 전류의 주파수는 NMDA-LTD 유도 후 뉴런에서 낮았다, CA1에서 시놉시스의 활동에 의존적인 가지치기를 나타내는. 진폭의 변화는 감지되지 않았다. mEPSC 기록 동안, CA1 세포는 또한 생물시틴과 그대로 수지상 식소 및 피라미드 뉴런의 건강한 세포 습관이 채워져 여기에서 볼 수 있다.세포 전체에 형광 염료의 강력한 분포는 다른 조건하에서 수선화및 수지상 척추의 분석을 허용합니다. 약 170%의 CA3-CA1 시냅스의 장기 전위성 또는 LTP가 관찰되었으며, 이는 LTP에 필요한 신호 캐스케이드의 유지 보수가 성인 마우스로부터 제조된 슬라이스에 존재한다는 것을 시사한다. 견고한 현장 흥분성 포스트냅틱 잠재적 신호는 네트워크 연결도 보존되었음을 시사합니다.프로토콜의 두 가지 중요한 측면은 저체온증을 유도하는 얼음 감기 용액을 가진 경동맥 풍부유와 세포 독성 부종을 방지하기 위한 용액의 나트륨 이온 대체물로 NMDG를 도입하는 것입니다. 이러한 예방 조치를 사용하여 급성 슬라이스는 뇌 영역에서 준비 될 수 있습니다. 또한, 이러한 방식으로 제조된 슬라이스는 2광자 또는 와이드필드 현미경 검사를 사용하여 칼슘 및 전압 이미징에 사용될 수 있다.이 프로토콜은 노화 동물에서 급성 해마 슬라이스에 대한 표준화 된 준비를위한 기초가 될 수 있으므로 신경 퇴행성 질환 메커니즘의 맥락에서 연구 전반에 걸쳐 비교를 용이하게 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

노화와 아밀로이드 병리 동안 시냅틱 얼터 레이션의 연구에 대한 고양이와 트렌스 제닉 마우스의 급성 Hippocampal 조각의 준비

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

태아 쥐의 Hippocampal 신경 세포의 분리 및 문화

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

설치류에서 급성 해마 조각을 사용하여 시냅스 태그 / 캡처 및 크로스 캡처 조사

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

시 냅 스 밀도 Hippocampal 설치류 두뇌 분할 영역에서의 평가

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic 쥐 행동에 Hippocampal 세타 진동의 유입

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

신생아 쥐의 저산소증-허혈 중 연속 비디오 뇌전도

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...