Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Carla J. Shatz por conselhos e apoio, e Dr. Barbara K. Brott e Michelle K. Drews por lerem criticamente o manuscrito. O trabalho é apoiado pelo NIH EY02858 e pela Mathers Charitable Foundation concede ao CJS.

O protocolo é realizado de acordo com o Guia de Cuidado e Uso de Animais laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Stanford. Os métodos também estão de acordo com as Políticas da Sociedade para a Neurociência sobre o Uso de Animais e Humanos na Pesquisa em Neurociência.
NOTA: Todos os camundongos foram mantidos em um ambiente livre de patógenos. Ratos do tipo selvagem em c57Bl/ 6 x SV/ 129J de ...

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M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. 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Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

O protocolo descrito aqui demonstra que as fatias hipocampais obtidas de camundongos adultos e envelhecidos podem permanecer saudáveis e viáveis por muitas horas após o corte. As fatias preparadas usando este protocolo são apropriadas para gravações de grampos de remendo, bem como gravações de campo de longa duração nas regiões ca1.
Há dois passos críticos neste protocolo. O primeiro passo é o passo de perfusão transcárvia com uma solução gelada. A liberação rápida do sang...

O advento das preparações de fatias cerebrais agudas de mamíferos facilitou experimentos no nível celular e sináptico que antes eram possíveis apenas em preparações de invertebrados como a Aplysia1. O desenvolvimento de fatias hipocampais agudas foi de particular significado, pois é uma estrutura responsável pela formação da memória e do contexto, e possui um circuito tri-sináptico especializado que é amenable à fácil manipulação fisiológica. No entanto, a grande maioria das fatias cerebrais agudas ainda são preparadas a partir de camundongos e ratos relativamente jovens, pois é mais fácil preservar neurônios e circuitos saudáveis, e as fatias permanecem viáveis por períodos mais longos de tempo2,3,4. Aqui, introduzimos modificações nos protocolos de corte padrão que resultam em maior viabilidade de fatias hipocampais agudas de camundongos adultos e envelhecidos.
O principal impedimento para a viabilidade ex vivo a longo prazo do parenchyma cerebral mamífero é o dano hipóxico inicial que ocorre rapidamente quando o fluxo sanguíneo para o cérebro pára após a decapitação. A perda de oxigênio resulta no rápido consumo metabólico dos principais recursos energéticos do cérebro, sendo a perda de fosfo-creatina (P-creatina) a mais rápida, seguida por glicose, adenosina triptofato (ATP) e glicógeno4. A preservação da ATP é de particular importância para a saúde a longo prazo das fatias cerebrais, pois a ATP é necessária para manter o potencial de membrana através do ATPase Na-K e, consequentemente, da atividade neural5,,6. O nível ATP no cérebro de roedor adulto é de ~2,5 mM, e cai vertiginosamente dentro de 20 s de decapitação para alcançar um estado basal estável (~0,5 mM) em torno de 1 min pós-decapitação4,,7,,8. Em animais jovens, leva mais tempo para observar a mesma queda em ATP (~2 min); com anestesia fenobarbital é ainda mais retardada para 4 min4. Essas considerações mostram que prevenir a perda de ATP e outros recursos energéticos é uma estratégia necessária para evitar danos hipóxicos ao cérebro e, por sua vez, manter a saúde das fatias cerebrais por períodos mais longos de tempo, especialmente em animais adultos.
Baixas temperaturas atrasam o metabolismo. Consequentemente, foi demonstrado que a hipotermia modesta protege as reservas de energia cerebral: em animais jovens, reduzindo a temperatura corporal em seis graus, de 37 °C para 31 °C, preserva os níveis de ATP para cerca de 80% dos níveis normais acima de 4h de hipóxia controlada9. Os níveis de p-creatina são igualmente preservados, bem como o potencial global de fosforilação9. Isso sugere que a redução da temperatura corporal antes da decapitação pode ser neuroprotetora, uma vez que os níveis quase normais de ATP poderiam ser mantidos através dos períodos de corte de fatias e recuperação de fatias.
Na medida em que uma queda de ATP não pode ser completamente impedida após a decapitação, espera-se uma função parcialmente prejudicada do ATPase Na-K, seguida de despolarização via influxo passivo de sódio. Como o fluxo passivo de sódio é seguido pela entrada de água nas células, causa edema citotóxico e, eventualmente, pyknose. Em ratos adultos, substituir íons Na+ por sacarose em soluções de corte de fatias tem sido uma estratégia bem sucedida para aliviar a carga do edema citotóxico10,11. Mais recentemente, as cáras orgânicas metiladas que diminuem a permeabilidade do canal de sódio12 têm mostrado oferecer proteção mais eficaz do que a sacarose, especialmente em fatias de camundongos adultos, com n-metil-D-glucamine (NMDG) sendo mais amplamente aplicável em diferentes idades e regiões cerebrais13,,14,,15,,16.
Numerosos protocolos de corte cerebral envolvem o uso de temperaturas frias apenas durante a etapa de corte de fatias, às vezes em combinação com a estratégia de substituição de íons Na+ 16,17. Em animais jovens, esses protocolos parecem oferecer neuroproteção suficiente, uma vez que os cérebros podem ser extraídos rapidamente após a decapitação porque o crânio ainda é fino e fácil de remover3. No entanto, essa estratégia não produz fatias saudáveis de animais adultos. Com o tempo, vários laboratórios que estudam roedores adultos introduziram perfusão transcárrica com uma solução gelada para diminuir a temperatura corporal do animal e, portanto, danos hipóxicos ao cérebro, antes da decapitação. Este procedimento foi aplicado com sucesso para produzir fatias cerebelares18, fatias de cérebro médio19, fatias neocorticais11,20, córtex perirhinal21, hipocampo de rato10,22,23, bulbo olfativo24, estriado ventral25, córtex visual26.
Apesar das vantagens oferecidas pela perfusão transcárdia e substituiçãode íons na preparação de fatias de ratos e em algumas regiões cerebrais em camundongos, o hipocampo de camundongos continua sendo uma das áreas mais desafiadoras para proteger da hipóxia13,20. Até o momento, uma das abordagens mais comuns para cortar hipocampo de camundongos envelhecidos e modelos de camundongos de neurodegeneração envolve o corte rápido clássico do hipocampo isolado27. No protocolo aqui descrito, minimizamos a perda de ATP no cérebro adulto introduzindo hipotermia antes da decapitação, perfumando transcardialmente o animal com Na+- fluido cerebrospinal artificial à base de NMDG (NMDG-aCSF). As fatias são então cortadas em Na+-free NMDG-aCSF. Com este protocolo aprimorado, obtemos fatias hipocampais agudas de camundongos adultos e envelhecidos que são saudáveis por até 10 h após o corte e são apropriados para gravações de campo de longo prazo e estudos de grampo de remendo.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

As fatias agudas de hipocampal permitiram que gerações de neurocientistas explorassem propriedades sinápticas, neuronais e circuitos em detalhes e com alta fidelidade. A exploração de mecanismos LTP e LTD, a computação dendrítica de neurônio único e as mudanças dependentes da experiência nos circuitos não teriam sido possíveis sem esta preparação clássica. No entanto, com algumas exceções, a pesquisa mais básica usando fatias de hipocampal agudas tem sido realizada usando fatias de roedores de idades relativamente jovens, ~P20-P40, embora mecanismos de excitabilidade sináptica e intrínseca tenham uma longa cauda de desenvolvimento que ultrapassa p60. O principal apelo do uso de jovens fatias hipocampais é a preservação da saúde neuronal auxiliada pela maior tolerância aos danos hipóxicos. No entanto, é preciso entender a função neuronal em estágios mais maduros de desenvolvimento, ainda mais acentuados pelo desenvolvimento de vários modelos animais de doenças neurodegenerativas que requerem uma preparação cerebral envelhecida. Aqui descrevemos uma modificação em uma preparação aguda de fatia hipocampal que fornece fatias saudáveis de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos. Os passos críticos do protocolo são a perfusão transcárdica e o corte com NMDG-aSCF sem sódio frio. Juntos, essas etapas atenuam a queda induzida pela hipóxia no ATP após a decapitação, bem como o edema citotóxico causado por fluxos passivos de sódio. Demonstramos como cortar fatias transversais de hipocampo mais córtex usando um microtoma vibrante. As fatias hipocampais agudas obtidas desta forma são confiáveis e saudáveis ao longo de muitas horas de gravação, e são apropriadas tanto para gravações de campo quanto para gravações direcionadas de grampos de remendo, incluindo o alvo de neurônios fluorescentes rotulados.

Aplicamos o protocolo acima para gerar fatias de hipocampo da CamKIIa-Cre+; Camundongos WT em um fundo genético misto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, em P > 120. Um grande número de células piramidas no campo CA1 (Figura 2A) e subículo (Figura 2B) aparecem em baixo contraste quando observadas sob microscopia de contraste diferencial infravermelho (IR-DIC), uma marca registrada de células saudáveis em uma preparação de fatias. Com esta preparação, uma alta taxa de...

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Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Este é um protocolo para preparação aguda de fatias de hipocampi de camundongos adultos e envelhecidos que se aproveita da perfusão transcárrica e corte de fatias com NMDG-aCSF gelado para reduzir danos hipóxicos ao tecido. As fatias resultantes permanecem saudáveis durante muitas horas, e são adequadas para grampos de remendo de longo prazo e gravações de campo.

Minimizando a hipóxia em fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

O protocolo aqui apresentado diminui danos hipóxicos excessivos durante a preparação de fatias hipocampais de camundongos adultos e envelhecidos, removendo assim um grande obstáculo para estudar a função de circuitos neurais maduros e envelhecidos. A introdução de hipotermia em soluções livres de sódio resulta em fatias hipocampais saudáveis por até 10 horas após o corte e apropriadas tanto para os estudos de registro de campo de longo prazo quanto para patch-clamp. Este método de preparação de fatias hipocampais pode ser particularmente relevante para modelos animais em doenças neurodegenerativas que, por definição, requerem uma preparação cerebral envelhecida.O passo mais crítico neste protocolo é introduzir hipotermia via profusão transcárquia com uma solução gelada. Com alguma prática, os pesquisadores poderão executar essa etapa de forma confiável. Comece preparando um litro de solução aCSF para a câmara de recuperação e gravações subsequentes.Em seguida, prepare 300 mililitros de NMDG-aCSF para a profusão transcárvia e etapas de corte. Coloque a bandeja de corte de microtóme vibrante e o disco de montagem em um congelador de menos 20 graus Celsius. Para preparar a câmara de recuperação, preencha-a um pouco acima da malha de segurando a fatia e inicie o borbulhante mantendo a câmara no banco em temperatura ambiente.Esfrie os 300 mililitros inteiros de NMDG-aCSF em um congelador até que os cristais de gelo comecem a se formar na superfície e nas paredes da garrafa. Coloque a garrafa com refrigerado e NMDG-aCSF no gelo e borbulhe-a, mantendo a solução entre zero e dois graus Celsius. Tire o disco de montagem do tecido do congelador e limpe-o, se necessário.Corte um bloco de 5% de ágar do tamanho de um cérebro de rato e cole-o no centro do disco usando uma fina camada de cola cianoacrilato. Coloque o disco com ágar colado no gelo e cubra-o com toalhas de papel até estar pronto para usar. Tire a bandeja de corte do congelador, coloque-a no microtome, em seguida, cerque-a com gelo e carregue a lâmina.Prepare todas as ferramentas com antecedência para a dissecção cerebral. Configure a bomba peristáltica para perfusão transcárlica. Insira um lado da tubulação da bomba na garrafa com NMDG-aCSF gelado e encaixe o outro lado com uma agulha calibre 27.Coloque a velocidade da bomba em aproximadamente 3,5 mililitros por minuto. A esta velocidade, o fluxo de saída de um NMDG-aCSF é uma viagem rápida, não um fluxo contínuo. Coloque o mouse de costas em uma fralda.Antes de continuar, confirmou que o rato está em um plano cirúrgico de anestesia realizando uma pitada de dedo do pé. O rato deve não responder, depois colado pelas pernas dianteiras e traseiras para que o peito e o abdômen sejam expostos. Corte um grande pedaço da pele no peito, indo de baixo do esterno até a garganta.Pegue o esterno com fórceps, levante-o suavemente e comece a cortar a caixa torácica em ambos os lados até que a cavidade torácica seja exposta. Corte através do diafragma, deixando o retalho da caixa torácica preso através de um fino pedaço de músculo. Deve ser possível colocá-lo de lado sem tê-lo cair de volta na cavidade torácica exposta.Verifique se o coração ainda está batendo e certifique-se de que a maior parte do fígado é visível. Insira a agulha no ventrículo esquerdo, que parece mais leve em cores do que a direita. Para estabilizar a agulha, dirija-a através das costelas restantes do lado esquerdo do corpo.Localize o átrio direito de cor vermelha escura e corte-o com uma tesoura pequena. O sangue deve começar a fluir. Inicie a bomba e observe o fígado, que mudará de cor de vermelho para marrom.Monitore a cor do fígado e continue a perfusão até que o fígado fique castanho pálido. Execute a bomba por mais alguns minutos. A temperatura corporal do animal deve cair para 28 a 29 graus Celsius e seu nariz deve ser frio ao toque.Decapitar o rato com uma grande tesoura de decapitação, em seguida, use um bisturi com uma lâmina número 10 para cortar a pele em cima do crânio. Com uma tesoura pequena em ângulo, corte o crânio na linha média. Em seguida, use os fórceps número três para arrancar as metades direita e esquerda do crânio, tomando cuidado para levar a dura com ele.Remova o cérebro, que deve ser uma cor off-white, retirando-o com uma espátula e solte-o na solução NMDG-aCSF no gelo. Deixe lá por até um minuto. Tire o cérebro do NMDG-aCSF e coloque-o em um pedaço de papel filtro.Corte e remova uma cunha de tecido de 60 graus com uma ferramenta de 60 graus centrada na linha média da extremidade rostral do cérebro. Use os lados cortados da superfície de montagem, pois fornece o ângulo adequado para fatias hipocampais. Separe os hemisférios pela linha média com o bisturi e cole-os no disco de montagem.Pegue o disco de montagem do gelo e limpe-o, se necessário. Em seguida, cole cada hemisfério em frente ao bloco de ágar, corte de lado para baixo. Certifique-se de que os lados ventral de ambos os hemisférios estão tocando o bloco de ágar e que os lados dorsais de ambos os hemisférios estão voltados para a lâmina.Quando colados no lado do corte, cada hemisfério deve ser orientado em relação à lâmina de uma forma que garanta fatias transversais do hipocampo dorsal in situ. Submergir o disco com os hemisférios em uma câmara de corte contendo NMDG-aCSF caricaturado a frio do gelo. Corte uma seção de 400 micrômetros e use uma pipeta de transferência descartável com uma ponta de corte para transferir a fatia para uma câmara de recuperação contendo NMDG-aCSF carbogenado à temperatura ambiente.Continue cortando o resto das seções e transferindo-as para a câmara de recuperação levando não mais do que 10 minutos para cortar um total de oito a 10 fatias da região do hipocampo dorsal. Incubar as fatias em temperatura ambiente por aproximadamente duas horas antes de gravar. Este protocolo foi usado para gerar fatias hipocampais de ratos adultos.Um grande número de células piramidas no campo CA1 e no subiculum aparecem em baixo contraste, uma marca registrada de células saudáveis, quando observadas sob microscopia de contraste diferencial infravermelho. Gravações de grampos de patch podem ser obtidas a partir de neurônios CA1 de camundongos com mais de seis meses de idade. No experimento de exemplo aqui, a frequência de correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura foi medida após a induzida pelo NMDA-LTD em relação às condições de controle.A frequência das correntes pós-sinápticas excitatórias em miniatura foi menor nos neurônios após uma indução do NMDA-LTD, indicando poda dependente de atividade de sinopses em CA1. Não foram detectadas alterações na amplitude. Durante as gravações do MEPSC, as células CA1 também foram preenchidas biocitina e arbor déndrítica intacta e habitus de células saudáveis dos neurônios piramihários podem ser vistos aqui.Uma distribuição robusta do corante fluorescente em toda a célula permite a análise de dendritos e colunas dendríticas em diferentes condições. Observou-se a potencialização de longo prazo, ou LTP, de sinapses CA3-CA1 de aproximadamente 170%, sugerindo que a manutenção das cascatas de sinalização necessárias para o LTP está presente em fatias preparadas a partir de camundongos adultos. Um robusto sinal potencial de campo excitatório de forma exsináptica sugere que a conectividade de rede também foi preservada.Dois aspectos críticos do protocolo são a profusão transcárdica com uma solução gelada para induzir hipotermia e introdução de um NMDG como um substituto de íon de sódio em soluções para prevenir edema citotóxico. Usando essas precauções, fatias agudas podem ser preparadas de qualquer região cerebral. Além disso, as fatias preparadas desta forma podem ser usadas para imagens de cálcio e tensão usando microscopia de dois fótons ou widefield.Este protocolo poderia servir de base para uma preparação padronizada para fatias hipocampais agudas de animais envelhecidos e, assim, facilitar comparações entre estudos no contexto de mecanismos de doenças neurodegenerativas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparação de Oligoméricas β-amilóide 1-42 Indução e de Impairment plasticidade sináptica em fatias do hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Neurociência

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Preparação de fatias do hipocampo aguda de ratos e camundongos transgênicos para o Estudo das Alterações Synaptic durante o envelhecimento e amilóide Patologia

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Emparelhados Recordings células inteiras em organotï¿½icas fatias do hipocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Investigação de Synaptic Tagging / Captura e-captura Cruz usando aguda fatias do hipocampo de roedores

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic de arrastamento de Theta Hippocampal oscilações em comportar-se ratos

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Eletroencefalograma de vídeo contínuo durante hipoxia-isquemia em camundongos neonatais

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...