Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Я благодарю д-ра Карлу Дж. Шац за совет и поддержку, а д-р Барбара К. Брот и Мишель К. Дрюс за критическое прочтение рукописи. Работа поддерживается NIH EY02858 и Благотворительный фонд Mathers гранты CJS.

Протокол проводится в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Стэнфордского университета. Методы также в соответствии с политикой Общества неврологии п...

<ol>
	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+evoked+potentials+in+the+in+vitro+hippocampus.">The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus.</a> Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ATP+concentration+as+a+basis+for+synaptic+transmission+failure+during+hypoxia+in+the+in+vitro+guinea-pig+hippocampus.">Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus.</a> Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).</li><li>Free Mandel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.S.+Free+nucleotides+of+the+brain+in+various+mammals.">H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals.</a> Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).</li><li>Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energetics+and+tolerance+to+anoxia+in+deep+hypothermia.">Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).</li><li>Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+hypothermia+preserves+cerebral+energy+metabolism+during+hypoxia-ischemia+and+correlates+with+brain+damage:+a+31P+nuclear+magnetic+resonance+study+in+unanesthetized+neonatal+rats.">Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats.</a> Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).</li><li>Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+modulation+of+hippocampal+synaptic+plasticity+via+PirB+and+endocannabinoids.">Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids.</a> Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).</li><li>Djurisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+regulates+a+structural+substrate+for+cortical+plasticity.">PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Blot, A., Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-rapid+axon-axon+ephaptic+inhibition+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+the+pinceau.">Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).</li><li>Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+modulation+of+dopamine+neuron+synapses+by+aversive+and+rewarding+stimuli.">Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli.</a> Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

Протокол, описанный здесь, показывает, что гиппокампе ломтики, полученные от взрослых и стареющих мышей может оставаться здоровым и жизнеспособным в течение многих часов после резки. Срезы, подготовленные с использованием этого протокола, подходят для записи патч-зажима, а также длите?...

Появление млекопитающих острых препаратов кусок мозга способствовали эксперименты на клеточном и синаптическом уровне, которые ранее были возможны только в беспозвоночных препаратов, как Аплизия1. Особое значение имеет развитие острых ломтиков гиппокампа, так как это структура, отвечающая за рабочую память и контекстообразование, и имеет специализированную трехсинаптическую схему, которая поддается легкой физиологической манипуляции. Тем не менее, подавляющее большинство острых ломтиков мозга по-прежнему готовятся из относительно молодых мышей и крыс, так как легче сохранить здоровые нейроны и схемы, и ломтики остаются жизнеспособными в течение более длительных периодоввремени 2,3,4. Здесь мы вводим изменения в стандартные протоколы нарезки, которые приводят к повышению жизнеспособности острых ломтиков гиппокампа от взрослых и стареющих мышей.
Основным препятствием для долгосрочной ex vivo жизнеспособности млекопитающих мозга parenchyma является первоначальный гипоксический ущерб, который происходит быстро, как только поток крови к мозгу останавливается после обезглавливания. Потеря кислорода приводит к быстрому метаболическому потреблению основных энергетических ресурсов в головном мозге с потерей фосфо-креатина (P-креатина) является наиболее быстрым, а затем глюкозы, аденозинтрифосфата (АТФ), и гликоген4. Сохранение АТФ имеет особое значение для долгосрочного здоровья ломтиков мозга, так как АТФ необходим для поддержания мембранного потенциала через Na-K ATPase, и, следовательно, нейронной активности5,6. Уровень АТФ в мозге взрослого грызуна составляет 2,5 мМ, и он резко падает в пределах 20 с обезглавливания, чтобы достичь базального устойчивого состояния (0,5 мМ) на уровне около 1 мин после обезглавливания4,7,8. У молодых животных, это занимает больше времени, чтобы наблюдать то же падение в АТФ (2 мин); с фенобарбитальной анестезией он далее замедлился до 4 мин4. Эти соображения показывают, что предотвращение потери АТФ и других энергетических ресурсов является необходимой стратегией для предотвращения гипоксического повреждения мозга и, в свою очередь, для поддержания здоровья ломтиков мозга в течение более длительных периодов времени, особенно у взрослых животных.
Низкие температуры замедляют обмен веществ. Следовательно, было продемонстрировано, что скромное переохлаждение защищает запасы энергии мозга: у молодых животных, снижая температуру тела на шесть градусов, с 37 градусов до 31 градусов по Цельсию, сохраняет уровни АТФ примерно до 80% от нормального уровня более 4 ч контролируемой гипоксии9. Уровни P-креатина также сохранены, также, как общий потенциал фосфорилирования9. Это говорит о том, что снижение температуры тела до обезглавливания может быть нейропротекторным, так как почти нормальные уровни АТФ могут поддерживаться через ломтик резки и ломтик периодов восстановления.
В той степени, что падение АТФ не может быть полностью предотвращено при обезглавливании, ожидается частично нарушенная функция Na-K ATPase, за которой последует деполяризация через пассивный приток натрия. Как пассивный приток натрия сопровождается водой вступления в клетки, он вызывает цитотоксический отек и в конечном итоге пикноз. У взрослых крыс, замена ионов Na' с сахарозой в срез-резки решений была успешная стратегия, чтобы облегчить бремя цитотоксического отека10,11. Совсем недавно, метилированные органические катиции, которые уменьшают проницаемость канала натрия12 показали, чтобы предложить более эффективную защиту, чем сахароза, особенно в ломтики от взрослых мышей, с N-метил-D-глюкамин (NMDG) наиболее широко применимы в разных возрастов и мозговых регионах13,14,15,16.
Многочисленные протоколы нарезки мозга включают использование холодных температур только во время срезающего шага, иногда в сочетании со стратегией замены иона Naй 16,17. У молодых животных, эти протоколы, как представляется, предлагают достаточно нейрозащиты, так как мозг может быть извлечен быстро после обезглавливания, потому что череп все еще тонкий и легко удалить3. Тем не менее, эта стратегия не производит здоровые ломтики от взрослых животных. Со временем в ряде лабораторий, изучающих взрослых грызунов, введена транскардиальная перфузия с ледяным раствором для снижения температуры тела животного и, следовательно, гипоксического повреждения мозга до обезглавливания. Эта процедура была успешно применена для производства мозжечковых ломтиков18,ломтики среднего мозга19, неокортиковые ломтики11,20, периринальной коры21, крыса гиппокампа10,22,23,обонятельная луковица24, вентральная стриятная тум25, визуальная кора26.
Несмотря на преимущества, предлагаемые транскардиальной перфузии и Naион замены в подготовке ломтиков от крысы и в некоторых областях мозга у мышей, мышь гиппокампа остается одним из самых сложных областей для защиты от гипоксии13,20. На сегодняшний день, один из наиболее распространенных подходов к нарезке гиппокампа от старения мышей и мыши модели нейродегенерации включает в себя классические быстро нарезки изолированных гиппокампа27. В протоколе, описанном здесь, мы минимизируем потерю АТФ во взрослом мозгу, вводя переохлаждение до обезглавливания путем транскардиальной перфузии животного с ледянойNa- свободной NMDG основе искусственной спинномозговой жидкости (NMDG-aCSF). Ломтики затем вырезать в ледяной Na--бесплатноNMDG-aCSF. С помощью этого расширенного протокола мы получаем острые ломтики гиппокампа от взрослых и стареющих мышей, которые здоровы до 10 ч после нарезки и подходят для долгосрочных полевых записей и патч-зажим исследований.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Острые ломтики гиппокампа позволили поколениям нейробиологов исследовать синаптические, нейронные и схемные свойства в деталях и с высокой точностью. Изучение механизмов LTP и LTD, одно нейрон дендритных вычислений и опытозависимых изменений в схеме было бы невозможно без этой классической подготовки. Тем не менее, за некоторыми исключениями, большинство фундаментальных исследований с использованием острых ломтиков гиппокампа была выполнена с использованием ломтиков от грызунов относительно молодого возраста, P20-P40, хотя синаптические и внутренние механизмы возбудимости имеют длинный хвост развития, который достигает прошлого P60. Основной привлекательностью использования молодых ломтиков гиппокампа является сохранение нейронов здоровья, которому способствует более высокая толерантность к гипоксическим повреждениям. Тем не менее, необходимо понимать функции нейронов на более зрелых стадиях развития, что еще больше усугубляется развитием различных животных моделей нейродегенеративных заболеваний, которые требуют старения мозга подготовки. Здесь мы описываем модификацию острого препарата гиппокампа ломтик, который надежно обеспечивает здоровые ломтики от взрослых и старения мыши гиппокампа. Критическими шагами протокола являются транскардиальная перфузия и резка с ледяной натрия без NMDG-ASCF. Вместе эти шаги смягчают гипоксию индуцированной капли в АТФ при обезглавливании, а также цитотоксический отек, вызванный пассивными потоками натрия. Мы демонстрируем, как сократить поперечные ломтики гиппокампа плюс кора с помощью вибрирующих микротомов. Острые гиппокампа ломтики, полученные таким образом, надежно здоровы в течение многих часов записи, и подходят как для полевых записей и целевых патч-зажим записей, в том числе ориентации флуоресцентно помечены нейронов.

Мы применили вышеуказанный протокол для генерации ломтиков гиппокампа от CamKIIa-Cre'; WT мышей на смешанном генетическом фоне C57Bl / 6 х SV / 129J, на P Большое количество пирамидальных клеток в поле CA1(Рисунок 2A) и subiculum(Рисунок 2B) появляются в низком контрасте, когда ?...

Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Это протокол для острого приготовления ломтик от взрослых и старения мыши гиппокампа, который использует транскардиальной перфузии и ломтик резки с холодной льдий NMDG-ACSF для уменьшения гипоксического повреждения ткани. Полученные ломтики остаются здоровыми в течение многих часов, и подходят для долгосрочного патч-зажима и полевых записей.

Минимизация гипоксии в гиппокампе ломтики от взрослых и старения мышей

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Представленный здесь протокол уменьшает чрезмерные гипоксические повреждения при подготовке взрослых и стареющих ломтиков гиппокампа мыши, тем самым устраняя серьезное препятствие для изучения функции зрелых и стареющих нейронных цепей. Введение гипотермии в растворы без натрия приводит к гиппокампа ломтики, которые являются здоровыми на срок до 10 часов после резки и подходит как для долгосрочных полевых записей и патч-зажим исследований. Этот метод подготовки ломтиков гиппокампа может быть особенно актуален для животных моделей при нейродегенеративных заболеваниях, которые по определению требуют старения мозга подготовки.Наиболее важным шагом в этом протоколе является введение гипотермии через транскардиальное изобилие с ледяным раствором. С некоторой практикой, исследователи смогут надежно выполнить этот шаг. Начните с подготовки одного литра решения aCSF для восстановительной камеры и последующих записей.Затем приготовьте 300 миллилитров NMDG-aCSF для транскардиального изобилия и резки шагов. Поместите вибрирующий микротомный режущей лоток и монтажный диск в морозильную камеру минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы подготовить камеру восстановления, заполнить его чуть выше ломтик проведения сетки и начать пузырек поддержанию камеры на скамейке при комнатной температуре.Охладите все 300 миллилитров NMDG-aCSF в морозильной камере, пока кристаллы льда не начнут образовываться на поверхности и стенах бутылки. Поместите бутылку с охлажденным и NMDG-aCSF на лед и пузырь его, сохраняя раствор между нулем и двумя градусами по Цельсию. Возьмите ткань монтажный диск из морозильной камеры и протрите его сухим, если это необходимо.Вырежьте блок 5%agar размером с мозг мыши и клей его в центре диска с помощью тонкого слоя клея цианоакрилата. Поместите диск с клееным агаром на лед и накройте его бумажными полотенцами до готовности к использованию. Возьмите режущие лоток из морозильной камеры, поместите его в микротом, а затем окружить его льдом и загрузить лезвие.Подготовь все инструменты заранее для вскрытия мозга. Настройка перистальтического насоса для перфузии транскардиала. Вставьте одну сторону трубки насоса в бутылку со льдом NMDG-aCSF и подходят с другой стороны с 27 калибровочной иглой.Установите скорость насоса примерно до 3,5 миллилитров в минуту. При такой скорости отток NMDG-aCSF является быстрым путешествием, а не непрерывным потоком. Поместите мышь на спину на подгузник.Прежде чем продолжить, подтвердил, что мышь находится на хирургической плоскости анестезии, выполняя щепотку ноша. Мышь должна быть безответной, а затем лентой вниз его передние и задние ноги, так что грудь и живот подвергаются. Вырежьте большой участок кожи на груди, переходя из-под грудины в горло.Захватите грудину миппами, поднимите ее осторожно и начните прорезать грудную клетку с обеих сторон до тех пор, пока грудная полость не будет выставлена. Вырезать через диафрагму, оставляя лоскут грудной клетки прилагается через тонкий кусок мышцы. Следует иметь возможность отложить его в сторону, не имея его упасть обратно на открытые грудной полости.Убедитесь, что сердце все еще бьется и убедитесь, что большая часть печени видна. Вставьте иглу в левый желудочек, который выглядит светлее по цвету, чем правый. Чтобы стабилизировать иглу, прогнать его через оставшиеся ребра на левой стороне тела.Найдите темно-красный правый атриум и прорежьте его маленькими ножницами. Кровь должна начать вытекать. Запустите насос и наблюдайте за печенью, которая изменит цвет с красного на коричневый.Мониторинг цвета печени и продолжать перфузии, пока печень становится бледно-коричневый. Запустите насос еще на несколько минут. Температура тела животного должна упасть до 28-29 градусов по Цельсию, а нос должен быть холодным на ощупь.Обезглавить мышь с большими ножницами обезглавливание, а затем использовать скальпель с номером 10 лезвие, чтобы разрезать кожу на верхней части черепа. С небольшими ножницами под углом, вырезать череп в средней линии. Далее, используйте миппы номер три, чтобы вырвать правую и левую половинки черепа, будьте осторожны, чтобы забрать дуру с собой.Удалите мозг, который должен быть небелого цвета, черпая его с помощью шпателя и падение его в NMDG-ACSF решение на льду. Оставьте его там на минуту. Вывихи мозг из NMDG-aCSF и поместите его на лист фильтровальной бумаги.Вырезать и удалить 60 градусов клин ткани с 60 градусов инструмент по центру в средней линии от рострального конца forebrain. Используйте разрезанные стороны монтажной поверхности, поскольку она обеспечивает надлежащий угол для ломтиков гиппокампа. Разделите полушария вниз по средней линии скальпелем и приклейте их к монтажу диска.Возьмите монтажный диск со льда и протрите его сухим, если это необходимо. Затем приклейте каждое полушарие перед агар-блоком, срежьте сторону вниз. Убедитесь, что брюшной стороны обоих полушарий касаются агар-блока и что спинные стороны обоих полушарий обращены к лезвию.При склеив на разрезе стороны, каждое полушарие должно быть ориентировано по отношению к лезвию таким образом, что обеспечивает поперечные ломтики спинного гиппокампа на месте. Погрузите диск с полушариями в режущую камеру, содержащую ледяной карбогенный NMDG-aCSF. Вырезать 400 микрометровый раздел, а затем использовать одноразовые передачи пипетки с наконечником отсечения для передачи ломтик в камеру восстановления, содержащую карбогенированные NMDG-aCSF при комнатной температуре.Продолжить резки остальных разделов и передачи их в камеру восстановления занимает не более 10 минут, чтобы сократить в общей сложности от восьми до 10 ломтиков из спинного гиппокампа области. Инкубировать ломтики при комнатной температуре в течение примерно двух часов до записи. Этот протокол был использован для создания ломтиков гиппокампа от взрослых мышей.Большое количество пирамидальных клеток в поле CA1 и субикулум появляются в низком контрасте, отличительной чертой здоровых клеток, когда наблюдается под инфракрасным дифференциалом контрастной микроскопии. Записи патч-зажима можно получить из нейронов CA1 мышей, которые старше шести месяцев. В примере эксперимента здесь, частота миниатюрных возбуждательных постсинаптических течений была измерена после NMDA-LTD был вызван по отношению к условиям контроля.Частота миниатюрных возбудительных постсинаптических течений была ниже в нейронах после индукции NMDA-LTD, что указывает на зависимость активности синопсисов в CA1. Изменений амплитуды обнаружено не было. Во время записей mEPSC, клетки CA1 были также заполнены биоцитиным и нетронутыми дендритной беседкой и здоровой клеточной привычкой пирамидальных нейронов можно увидеть здесь.Надежное распределение флуоресцентного красителя по всей клетке позволяет проводить анализ дендритов и дендритных шипов в различных условиях. Долгосрочная потенция, или LTP, синапсов CA3-CA1 примерно 170%, была отмечена, предполагая, что поддержание сигнальных каскадов, необходимых для LTP присутствует в ломтиках, подготовленных из взрослых мышей. Надежный полевой возбуждающей постсинаптический потенциальный сигнал говорит о том, что сетевая связь также сохранилась.Двумя важнейшими аспектами протокола являются транскардиальное изобилие с ледяным раствором для индуцирования гипотермии и введение NMDG в качестве заменителя ионов натрия в растворах для предотвращения цитотоксического отека. Используя эти меры предосторожности, острые ломтики могут быть подготовлены из любой области мозга. Кроме того, ломтики, приготовленные таким образом, могут быть использованы для визуализации кальция и напряжения с помощью двух-фотонной или широкой микроскопии.Этот протокол может послужить основой для стандартизированной подготовки к острым ломтикам гиппокампа от стареющих животных и тем самым облегчить сравнение между исследованиями в контексте механизмов нейродегенеративных заболеваний.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Подготовка Олигомерные β-амилоида 1-42 И индукция Synaptic Обесценение Пластичность на срезах гиппокампа

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Подготовка острого срезах гиппокампа крыс и трансгенных мышей для изучения Synaptic Изменения в процессе старения и амилоида патологии

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Выделение и культуре нейронов гиппокампа мышей от пренатального

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Парные Целые Записи Сотовые в Органотипической срезов гиппокампа

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Исследование Synaptic Tagging / Захват и кросс-захвата с помощью острой срезах гиппокампа от грызунов

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Оценка плотности синапсов в срезах гиппокампа грызунов мозга

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic ГРЭС гиппокампа тета колебаний в себя мышей

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Подготовка острых человеческих гиппокампа для электрофизиологических записей

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Непрерывная видеоэлектроэнцефалограмма при гипоксии-ишемии у неонатальных мышей

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...