Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Agradezco a la Dra. Carla J. Shatz por consejo y apoyo, y a la Dra. Barbara K. Brott y Michelle K. Drews por leer críticamente el manuscrito. El trabajo es apoyado por NIH EY02858 y la Fundación Mathers Charitable otorga a CJS.

El protocolo se lleva a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford. Los métodos también están de acuerdo con las Políticas de la Sociedad para la Neurociencia sobre el Uso de Animales y Humanos en la Investigación de Neurociencia.
NOTA: Todos los ratones se mantuvieron en un ambiente libre de patógenos. Ratones de tipo...

<ol>
	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+evoked+potentials+in+the+in+vitro+hippocampus.">The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus.</a> Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ATP+concentration+as+a+basis+for+synaptic+transmission+failure+during+hypoxia+in+the+in+vitro+guinea-pig+hippocampus.">Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus.</a> Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).</li><li>Free Mandel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.S.+Free+nucleotides+of+the+brain+in+various+mammals.">H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals.</a> Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).</li><li>Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energetics+and+tolerance+to+anoxia+in+deep+hypothermia.">Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).</li><li>Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+hypothermia+preserves+cerebral+energy+metabolism+during+hypoxia-ischemia+and+correlates+with+brain+damage:+a+31P+nuclear+magnetic+resonance+study+in+unanesthetized+neonatal+rats.">Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats.</a> Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).</li><li>Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+modulation+of+hippocampal+synaptic+plasticity+via+PirB+and+endocannabinoids.">Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids.</a> Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).</li><li>Djurisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+regulates+a+structural+substrate+for+cortical+plasticity.">PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Blot, A., Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-rapid+axon-axon+ephaptic+inhibition+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+the+pinceau.">Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).</li><li>Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+modulation+of+dopamine+neuron+synapses+by+aversive+and+rewarding+stimuli.">Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli.</a> Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

El protocolo descrito aquí demuestra que las rebanadas de hipocampo obtenidas de ratones adultos y envejecidos pueden permanecer saludables y viables durante muchas horas después del corte. Los sectores preparados con este protocolo son adecuados para grabaciones de abrazaderas de parches, así como grabaciones de campo de larga duración en las regiones CA1.
Hay dos pasos críticos en este protocolo. El primer paso es el paso de perfusión transcardial con una solución helada. El aclaramie...

El advenimiento de las preparaciones agudas de la rebanada cerebral de los mamíferos facilitó experimentos a nivel celular y sináptico que antes sólo eran posibles en preparaciones de invertebrados como Aplysia1. El desarrollo de rebanadas agudas del hipocampo fue de particular importancia, ya que es una estructura responsable de la memoria de trabajo y la formación de contexto, y tiene un circuito trisináptico especializado que es amenable a la manipulación fisiológica fácil. Sin embargo, la gran mayoría de las rebanadas cerebrales agudas todavía se preparan a partir de ratones y ratas relativamente jóvenes, ya que es más fácil preservar las neuronas y circuitos sanos, y las rebanadas siguen siendo viables durante períodos más largos de tiempo2,,3,,4. Aquí, introducimos modificaciones en los protocolos de corte estándar que resultan en una mayor viabilidad de las rodajas agudas del hipocampo de ratones adultos y envejecidos.
El principal impedimento para la viabilidad ex vivo a largo plazo del parénquima cerebral de los mamíferos es el daño hipoxico inicial que ocurre rápidamente una vez que el flujo sanguíneo al cerebro deja de disminuir. La pérdida de oxígeno resulta en un consumo metabólico rápido de los principales recursos energéticos en el cerebro con la pérdida de fosfo-creatina (P-creatina) siendo el más rápido, seguido de glucosa, trifosfato de adenosina (ATP), y glucógeno4. La preservación de ATP es de particular importancia para la salud a largo plazo de las rebanadas cerebrales, ya que el ATP es necesario para mantener el potencial de membrana a través de la ATPase Na-K, y en consecuencia la actividad neuronal5,6. El nivel de ATP en el cerebro de los roedores adultos es de 2,5 mM, y cae precipitadamente dentro de 20 s de decapitación para alcanzar un estado estacionario basal (0,5 mM) en alrededor de 1 min después de la decapitación4,7,8. En animales jóvenes, se tarda más en observar la misma caída en ATP (2 min); con anestesia fenobarbital se ralentiza aún más a 4 min4. Estas consideraciones muestran que prevenir la pérdida de ATP y otros recursos energéticos es una estrategia necesaria para prevenir el daño hipoxico al cerebro y a su vez para mantener la salud de las rebanadas cerebrales durante períodos más largos de tiempo, especialmente en animales adultos.
Las bajas temperaturas ralentizan el metabolismo. Por lo tanto, se ha demostrado que la hipotermia modesta protege las reservas de energía cerebral: en animales jóvenes, reduciendo la temperatura corporal en seis grados, de 37 oC a 31 oC, preserva los niveles de ATP a alrededor del 80% de los niveles normales durante 4 h de hipoxia controlada9. Los niveles de P-creatina se conservan de manera similar, así como el potencial general de fosforilación9. Esto sugiere que bajar la temperatura corporal antes de la decapitación podría ser neuroprotector, como niveles casi normales de ATP podrían mantenerse a través de los períodos de corte por rebanada y recuperación de la rebanada.
En la medida en que una caída de ATP no se puede prevenir completamente tras la decapitación, se espera una función parcialmente deteriorada de la ATPase Na-K, seguida de la despolarización a través de la afluencia pasiva de sodio. Como la afluencia pasiva de sodio es seguida por la entrada de agua en las células, causa edema citotóxico y eventualmente piknosis. En ratas adultas, la sustitución de iones Na+ por sacarosa en soluciones de corte por rodajas ha sido una estrategia exitosa para aliviar la carga del edema citotóxico10,11. Más recientemente, los cationes orgánicos metilados que disminuyen la permeabilidad del canal de sodio12 han demostrado ofrecer una protección más eficaz que la sacarosa, especialmente en rodajas de ratones adultos, siendo N-metil-D-glucamina (NMDG) más ampliamente aplicable en diferentes edades y regiones cerebrales13,,14,,15,,16.
Numerosos protocolos de corte cerebral implican el uso de temperaturas frías sólo durante el paso de corte por rebanadas, a veces en combinación con La estrategia de reemplazo de Na+ ion16,17. En animales jóvenes, estos protocolos parecen ofrecer suficiente neuroprotección ya que los cerebros se pueden extraer rápidamente después de la decapitación porque el cráneo es todavía delgado y fácil de eliminar3. Sin embargo, esta estrategia no produce rebanadas saludables de animales adultos. Con el tiempo, varios laboratorios que estudian roedores adultos han introducido la perfusión transcardial con una solución helada para disminuir la temperatura corporal del animal, y por lo tanto daño hipoxico al cerebro, antes de la decapitación. Este procedimiento se aplicó con éxito para producir rodajas cerebelosas18, rodajas de cerebro medio19, rodajas neocorticales11,20, corteza perirhinal21, hipocampo de rata10,22,23, bulbo olfativo24, estriado ventral25, corteza visual26.
A pesar de las ventajas que ofrece la perfusión transcardial y el reemplazo de iones Na+ en la preparación de rodajas de rata y en algunas regiones cerebrales en ratones, el hipocampo de ratón sigue siendo una de las zonas más desafiantes para protegerse de la hipoxia13,,20. Hasta la fecha, uno de los enfoques más comunes para cortar el hipocampo de ratones envejecidos y modelos de ratón de neurodegeneración implica el corte rápido clásico del hipocampo aislado27. En el protocolo descrito aquí, minimizamos la pérdida de ATP en el cerebro adulto mediante la introducción de hipotermia antes de la decapitación perfundiendo transcardimente al animal con el frío helado Na+- fluido cefalorraquídeo artificial basado en NMDG libre (NMDG-aCSF). Las rebanadas se cortan en Na+libre de hielo NMDG-aCSF. Con este protocolo mejorado obtenemos rebanadas agudas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos que son saludables hasta 10 h después del corte y son apropiados para grabaciones de campo a largo plazo y estudios de parches.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Las rebanadas agudas del hipocampo han permitido a generaciones de neurocientíficos explorar las propiedades sinápticas, neuronales y de circuito en detalle y con alta fidelidad. La exploración de los mecanismos LTP y LTD, el cálculo dendrítico de una sola neurona y los cambios dependientes de la experiencia en los circuitos, no habrían sido posibles sin esta preparación clásica. Sin embargo, con algunas excepciones, la mayoría de las investigaciones básicas utilizando rodajas agudas de hipocampo se han realizado utilizando rebanadas de roedores de edades relativamente jóvenes, P20-P40, a pesar de que los mecanismos de excitabilidad sináptica e intrínseca tienen una larga cola de desarrollo que supera el P60. El principal atractivo del uso de rebanadas de hipocampo joven es la preservación de la salud neuronal ayudada por una mayor tolerancia al daño hipoxico. Sin embargo, hay una necesidad de entender la función neuronal en etapas más maduras de desarrollo, acentuado aún más por el desarrollo de varios modelos animales de enfermedades neurodegenerativas que requieren una preparación cerebral envejecida. Aquí describimos una modificación a una preparación aguda de la rebanada del hipocampo que entrega de forma fiable rebanadas saludables de hipocampos adultos y de ratón envejecido. Los pasos críticos del protocolo son la perfusión transcardial y el corte con NMDG-aSCF sin sodio helado. Juntos, estos pasos atenúan la caída inducida por hipoxia en ATP tras la decapitación, así como el edema citotóxico causado por los flujos pasivos de sodio. Demostramos cómo cortar rodajas transversales de hipocampo más corteza usando un microtoma vibratorio. Las rebanadas agudas del hipocampo obtenidas de esta manera son confiablemente saludables durante muchas horas de grabación, y son apropiadas tanto para grabaciones de campo como para grabaciones dirigidas de abrazaderas de parches, incluida la segmentación de neuronas con la etiqueta fluorescente.

Aplicamos el protocolo anterior para generar rebanadas de hipocampo de CamKIIa-Cre+; Ratones WT sobre un fondo genético mixto C57Bl/ 6 x SV/ 129J, en P > 120. Un gran número de células piramidales en el campo CA1 (Figura 2A) y subiculum (Figura 2B) aparecen en bajo contraste cuando se observan bajo microscopía de contraste diferencial infrarrojo (IR-DIC), un sello distintivo de las células sanas en la preparación de una rebanada. Con esta preparación, una...

Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Este es un protocolo para la preparación aguda de la rebanada de hipocampo adulto y envejecido del ratón que aprovecha la perfusión transcardial y el corte de rodajas con NMDG-aCSF helado para reducir el daño hipoxico al tejido. Las rebanadas resultantes se mantienen saludables durante muchas horas y son adecuadas para grabaciones de parches y de campo a largo plazo.

Minimizar la hipoxia en las rebanadas de hipocampo de ratones adultos y envejecidos

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

El protocolo presentado aquí disminuye el daño hipoxico excesivo durante la preparación de rebanadas de hipocampo de ratón adultos y envejecidos, eliminando así un obstáculo importante para estudiar la función de los circuitos neuronales maduros y envejecidos. La introducción de la hipotermia en soluciones libres de sodio da como resultado rebanadas hipocampales que son saludables hasta 10 horas después del corte y adecuadas tanto para las grabaciones de campo a largo plazo como para los estudios de sujeción de parches. Este método de preparación de rodajas de hipocampo podría ser particularmente relevante para modelos animales en enfermedades neurodegenerativas que por definición requieren una preparación cerebral envejecida.El paso más crítico en este protocolo es introducir hipotermia a través de la profusión transcardial con una solución helada. Con un poco de práctica, los investigadores podrán ejecutar este paso de forma fiable. Comience preparando un litro de solución aCSF para la cámara de recuperación y las grabaciones posteriores.A continuación, prepare 300 mililitros de NMDG-aCSF para la profusión transcardial y los pasos de corte. Coloque la bandeja de corte de microtoma vibratoria y el disco de montaje en un congelador de menos 20 grados Centígrados. Para preparar la cámara de recuperación, llénala justo por encima de la malla de sujeción de la rebanada e inicia el burbujeador manteniendo la cámara en el banco a temperatura ambiente.Enfríe los 300 mililitros de NMDG-aCSF en un congelador hasta que los cristales de hielo comiencen a formarse en la superficie y las paredes de la botella. Coloque la botella con frío y NMDG-aCSF sobre hielo y burlíquela, manteniendo la solución entre cero y dos grados centígrados. Saque el disco de montaje de tejido del congelador y límpielo, si es necesario.Corta un bloque de 5% de agar del tamaño de un cerebro de ratón y péguelo en el centro del disco usando una fina capa de pegamento de cianoacrilato. Coloque el disco con agar pegado sobre hielo y cúbralo con toallas de papel hasta que esté listo para usar. Saque la bandeja de corte del congelador, colóquela en el microtomo, luego rodeándola con hielo y cargue la cuchilla.Prepare todas las herramientas con anticipación para la disección cerebral. Configure la bomba peristáltica para la perfusión transcardial. Inserte un lado del tubo de la bomba en la botella con NMDG-aCSF helado y ajuste el otro lado con una aguja de calibre 27.Ajuste la velocidad de la bomba a aproximadamente 3,5 mililitros por minuto. A esta velocidad, la salida de un NMDG-aCSF es un viaje rápido, no un flujo continuo. Coloque el ratón sobre su espalda en un pañal.Antes de continuar, confirmó que el ratón está en un plano quirúrgico de la anestesia mediante la realización de un pellizco del dedo del dedo del El ratón debe no responder, luego pegado por las patas delantera y trasera para que el pecho y el abdomen estén expuestos. Corta un gran parche de la piel en el pecho, yendo desde debajo del esternón hasta la garganta.Agarre el esternón con fórceps, levántelo suavemente y comience a cortar a través de la caja torácica en ambos lados hasta que la cavidad torácica esté expuesta. Cortar a través del diafragma, dejando la solapa de la caja torácica unida a través de un pedazo delgado de músculo. Debe ser posible apartarlo sin que vuelva a caer sobre la cavidad torácica expuesta.Compruebe que el corazón sigue latiendo y asegúrese de que la mayor parte del hígado es visible. Inserte la aguja en el ventrículo izquierdo, que se ve más claro en color que el derecho. Para estabilizar la aguja, conduzca a través de las costillas restantes en el lado izquierdo del cuerpo.Localice la aurícula derecha de color rojo oscuro y córtela con tijeras pequeñas. La sangre debería empezar a fluir. Encienda la bomba y observe el hígado, que cambiará de color de rojo a marrón.Monitoree el color del hígado y continúe con la perfusión hasta que el hígado se vuelva marrón pálido. Ejecute la bomba durante unos minutos más. La temperatura corporal del animal debe bajar a 28 a 29 grados Celsius y su nariz debe ser fría al tacto.Decapita el ratón con tijeras de decapitación grandes, luego usa un bisturí con una hoja número 10 para abrir la piel en la parte superior del cráneo. Con pequeñas tijeras en ángulo, corta el cráneo en la línea media. A continuación, utilice el número tres fórceps para apartar las mitades derecha e izquierda del cráneo, teniendo cuidado de quitar la dura con él.Retire el cerebro, que debe ser un color blanquecino sacándolo con una espátula y suéltelo en la solución NMDG-aCSF sobre hielo. Déjalo ahí hasta un minuto. Saque el cerebro del NMDG-aCSF y colóquelo en un pedazo de papel de filtro.Corte y extraiga una cuña de tejido de 60 grados con una herramienta de 60 grados centrada en la línea media del extremo rostral del antebrazmo. Utilice los lados cortados de la superficie de montaje, ya que proporciona el ángulo adecuado para las rodajas de hipocampo. Separe los hemisferios por la línea media con el bisturí y péguelos en el disco de montaje.Tome el disco de montaje del hielo y límpielo, si es necesario. A continuación, pegue cada hemisferio delante del bloque de agar, corte el lado hacia abajo. Asegúrese de que los lados ventrales de ambos hemisferios estén tocando el bloque de agar y que los lados dorsales de ambos hemisferios estén mirando hacia la hoja.Cuando se pega en el lado de corte, cada hemisferio debe estar orientado en relación con la hoja de una manera que asegura las rodajas transversales del hipocampo dorsal in situ. Sumerja el disco con los hemisferios en una cámara de corte que contenga NMDG-aCSF carisfado con frío helado. Corte una sección de 400 micrómetros y, a continuación, utilice una pipeta de transferencia desechable con una punta de corte para transferir la rebanada a una cámara de recuperación que contenga NMDG-aCSF carbogenado a temperatura ambiente.Continúe cortando el resto de las secciones y transfiriéndolas a la cámara de recuperación tomando no más de 10 minutos para cortar un total de ocho a 10 rodajas de la región dorsal del hipocampo. Incubar las rodajas a temperatura ambiente durante aproximadamente dos horas antes de la grabación. Este protocolo se utilizó para generar rebanadas de hipocampo a partir de ratones adultos.Un gran número de células piramidales en el campo CA1 y el subiculum aparecen en bajo contraste, un sello distintivo de las células sanas, cuando se observan bajo microscopía de contraste diferencial infrarrojo. Las grabaciones de parches se pueden obtener de las neuronas CA1 de ratones de más de seis meses de edad. En el experimento de ejemplo aquí, la frecuencia de las corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura se midió después de que NMDA-LTD fue inducido en relación con las condiciones de control.La frecuencia de las corrientes postsinápticas excitatorias en miniatura fue menor en las neuronas después de una inducción NMDA-LTD, lo que indica la poda dependiente de la actividad de sinopsis en CA1. No se detectaron cambios en la amplitud. Durante las grabaciones de mEPSC, las células CA1 también se llenaron de biocytina y se puede ver aquí un árbol dendrítico intacto y un habitus celular saludable de las neuronas piramidales.Una distribución robusta del tinte fluorescente a lo largo de la célula permite el análisis de dendritas y espinas dendríticas en diferentes condiciones. Se observó potenciación a largo plazo, o LTP, de sinapsis CA3-CA1 de aproximadamente 170%, lo que sugiere que el mantenimiento de las cascadas de señalización necesarias para el LTP está presente en rodajas preparadas a partir de ratones adultos. Una señal de potencial postsináptica excitatoria de campo robusto sugiere que también se conservó la conectividad de red.Dos aspectos críticos del protocolo son la profusión transcardial con una solución helada para inducir hipotermia e introducción de un NMDG como sustituto del iones de sodio en soluciones para prevenir el edema citotóxico. Usando estas precauciones, se pueden preparar rodajas agudas desde cualquier región cerebral. Además, las rebanadas preparadas de esta manera se pueden utilizar para imágenes de calcio y voltaje utilizando microscopía de dos fotones o de campo ancho.Este protocolo podría servir como base para una preparación estandarizada para las rebanadas agudas del hipocampo de animales envejecidos y así facilitar las comparaciones entre estudios en el contexto de mecanismos de enfermedad neurodegenerativa.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Investigación

Neurociencias

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Preparación de la aguda rodajas de hipocampo de ratas y ratones transgénicos para el estudio de las alteraciones sinápticas durante el envejecimiento y la patología amiloide

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Investigación de sináptica Tagging / Captura y Cruz de captura utilizando aguda hipocampo rebanadas de Roedores

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic de arrastre de las oscilaciones Theta Hippocampal en comportarse ratones

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Electroencefalograma de video continuo durante la hipoxia-isquemia en ratones neonatales

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...