Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Jag tackar Dr Carla J. Shatz för råd och stöd, och Dr Barbara K. Brott och Michelle K. Drews för kritiskt läsa manuskriptet. Arbetet stöds av NIH EY02858 och Mathers Charitable Foundation beviljar CJS.

Protokollet utförs i enlighet med Handledning för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health och godkänts av Stanford University Institutions Institutions Care and Use Committee. Metoder är också i enlighet med den politik som förs av Society for Neuroscience om användning av djur och människor i neurovetenskap forskning.
OBS: Alla möss bibehölls i en patogenfri miljö. Här användes möss av vildtyp på blandad C57Bl/ 6 x SV/ 129J genetisk bakgrund, ...

<ol>
	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+evoked+potentials+in+the+in+vitro+hippocampus.">The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus.</a> Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ATP+concentration+as+a+basis+for+synaptic+transmission+failure+during+hypoxia+in+the+in+vitro+guinea-pig+hippocampus.">Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus.</a> Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).</li><li>Free Mandel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.S.+Free+nucleotides+of+the+brain+in+various+mammals.">H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals.</a> Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).</li><li>Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energetics+and+tolerance+to+anoxia+in+deep+hypothermia.">Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).</li><li>Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+hypothermia+preserves+cerebral+energy+metabolism+during+hypoxia-ischemia+and+correlates+with+brain+damage:+a+31P+nuclear+magnetic+resonance+study+in+unanesthetized+neonatal+rats.">Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats.</a> Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).</li><li>Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+modulation+of+hippocampal+synaptic+plasticity+via+PirB+and+endocannabinoids.">Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids.</a> Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).</li><li>Djurisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+regulates+a+structural+substrate+for+cortical+plasticity.">PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Blot, A., Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-rapid+axon-axon+ephaptic+inhibition+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+the+pinceau.">Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).</li><li>Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+modulation+of+dopamine+neuron+synapses+by+aversive+and+rewarding+stimuli.">Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli.</a> Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

Det protokoll som beskrivs här visar att hippocampus skivor som erhållits från vuxna och åldrande möss kan förbli friska och livskraftiga i många timmar efter styckning. De skivor som bereds med hjälp av detta protokoll är lämpliga för patch-clamp-inspelningar, samt långvariga fältinspelningar i CA1-regionerna.
Det finns två kritiska steg i det här protokollet. Första steget är transkardialperfusionssteget med en iskall lösning. Snabb clearance av blod signaleras genom snabb ...

Tillkomsten av däggdjur akut hjärnan skiva preparat underlättas experiment på cellulär och synaptisk nivå som tidigare var möjligt endast i ryggradslösa preparat som Aplysia1. Utveckling av akut hippocampus skivor var av särskild betydelse, eftersom det är en struktur som ansvarar för arbetsminne och sammanhang bildning, och har en specialiserad tri-synaptiska kretsar som är mottagliga för lätt fysiologisk manipulation. Emellertid, de allra flesta akut hjärnan skivor är fortfarande beredda från relativt unga möss och råttor, eftersom det är lättare att bevara friska nervceller och kretsar, och skivorna förblir livskraftiga under längretidsperioder 2,3,4. Här inför vi ändringar i standard skivning protokoll som resulterar i ökad lönsamhet för akut hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss.
Det stora hindret för den långsiktiga ex vivo livskraften hos däggdjurshjärnparenkym är den initiala hypoxiska skada som inträffar snabbt när blodflödet till hjärnan slutar efter halshuggning. Förlust av syre resulterar i snabb metabolisk konsumtion av större energiresurser i hjärnan med förlusten av fosfo-kreatin (P-kreatin) är den snabbaste, följt av glukos, adenosintrifosfat (ATP), och glykogen4. Bevarande av ATP är av särskild betydelse för den långsiktiga hälsan hos hjärnan skivor, som ATP behövs för att upprätthålla membranet potential via Na-K ATPase, och följaktligen den neurala aktiviteten5,6. ATP-nivån i den vuxna gnagare hjärnan är ~ 2,5 mM, och det droppar precipitously inom 20 s av halshuggning för att nå en basal steady state (~ 0,5 mM) på cirka 1 min post-halshuggning4,7,8. Hos unga djur tar det längre tid att observera samma droppe i ATP (~2 min); med fenobarbital anestesi det bromsas ytterligare till 4 min4. Dessa överväganden visar att förhindra förlust av ATP och andra energiresurser är en nödvändig strategi för att förhindra hypoxisk skada på hjärnan och i sin tur att upprätthålla hälsan hos hjärnan skivor över längre tidsperioder, särskilt hos vuxna djur.
Låga temperaturer saktar ner ämnesomsättningen. Följaktligen har det visats att blygsam hypotermi skyddar hjärnans energireserver: hos unga djur, sänka kroppstemperaturen med sex grader, från 37 °C till 31 °C, bevarar ATP-nivåer till cirka 80% av normala nivåer över 4 h av kontrollerad hypoxi9. P-kreatinhalterna bevaras på liknande sätt, liksom den totala fosforyleringspotentialen9. Detta tyder på att sänka kroppstemperaturen före halshuggning kan vara nervskyddande, som nästan normala nivåer av ATP skulle kunna upprätthållas genom skiva styckning och skiva återhämtning perioder.
Till den grad att en ATP-droppe inte helt kan förhindras vid halshuggning förväntas en delvis försämrad funktion av Na-K ATPase, följt av depolarisering via passiv natriumtillströmning. Eftersom den passiva natriumtillströmningen följs av vatteninträde i celler, orsakar det cytotoxiska ödem och så småningom pyknosis. Hos vuxna råttor har det varit en framgångsrik strategi att ersätta Na+ joner med sackaros i skärande lösningar som är en framgångsrik strategi för att lindra bördan av cytotoxisktödem 10,11. På senare tid har metylerade organiska katjoner som minskar natrium kanal permeabilitet12 visat sig erbjuda effektivare skydd än sackaros, särskilt i skivor från vuxna möss, med N-metyl-D-glucamine (NMDG) är mest allmänt tillämpliga i olika åldrar och regioner hjärnan13,14,15,16.
Många hjärnskärningsprotokoll innebär att man bara använder kalla temperaturer under det skärande steget, ibland i kombination med Na+ jonersättningsstrategi16,17. Hos unga djur, dessa protokoll verkar erbjuda tillräcklig neuroprotektion eftersom hjärnorna kan utvinnas snabbt efter halshuggning eftersom skallen är fortfarande tunn och lätt att ta bort3. Denna strategi producerar dock inte friska skivor från vuxna djur. Med tiden har ett antal laboratorier som studerar vuxna gnagare infört transkard perfusion med en iskall lösning för att minska djurets kroppstemperatur, och därför hypoxisk skada på hjärnan, före halshuggning. Detta förfarande tillämpades framgångsrikt för att producera cerebellar skivor18, midbrain skivor19, neokortikala skivor11,20, perirhinal cortex21, råtta hippocampus10,22,23, luktbulb24, ventral striatum25, visuell cortex26.
Trots de fördelar som erbjuds av transkardial perfusion och Na+ jonersättning i att förbereda skivor från råtta och i vissa regioner i hjärnan hos möss, är mus hippocampus fortfarande en av de mest utmanande områden för att skydda från hypoxi13,20. Hittills innebär en av de vanligaste metoderna för att skära hippocampus från åldrande möss och musmodeller av neurodegeneration den klassiska snabb skivning av den isolerade hippocampi27. I det protokoll som beskrivs här, minimerar vi förlusten av ATP i den vuxna hjärnan genom att införa hypotermi före halshuggning genom transcardially perfusing djuret med iskall Na+- fri NMDG-baserade konstgjorda ryggmärgsvätskan (NMDG-aCSF). Skivor skärs sedan i iskall Na+-fri NMDG-aCSF. Med detta förbättrade protokoll får vi akut hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss som är friska för upp till 10 h efter skivning och är lämpliga för långsiktiga fält-inspelningar och patch-clamp studier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Akut hippocampus skivor har gjort det möjligt generationer av neuroforskare att utforska synaptiska, neuronala, och krets egenskaper i detalj och med hög trohet. Utforskning av LTP och LTD mekanismer, enda neuron dendritic beräkning och erfarenhet-beroende förändringar i kretsar, skulle inte ha varit möjligt utan denna klassiska beredning. Men med några få undantag, de flesta grundläggande forskning med akut hippocampus skivor har utförts med hjälp av skivor från gnagare i relativt unga åldrar, ~ P20-P40, även om synaptiska och inneboende retbarhet mekanismer har en lång utvecklingsstjärt som når förbi P60. Den viktigaste överklagandet av att använda unga hippocampus skivor är bevarande av neuronal hälsa med hjälp av högre tolerans mot hypoxisk skada. Det finns dock ett behov av att förstå neuronal funktion på mer mogna stadier av utveckling, ytterligare accentueras av utvecklingen av olika djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar som kräver en åldrande hjärnan förberedelse. Här beskriver vi en ändring av en akut hippocampus skiva beredning som på ett tillförlitligt sätt levererar friska skivor från vuxna och åldrande mus hippocampi. Protokollets kritiska steg är transkardial perfusion och skärning med iskall natriumfri NMDG-aSCF. Tillsammans dämpar dessa steg den hypoxiinducerade droppen i ATP vid halshuggning, samt cytotoxiskt ödem som orsakas av passiva natriumfluss. Vi visar hur man skär tvärgående skivor av hippocampus plus cortex med hjälp av en vibrerande mikrotom. Akut hippocampus skivor som erhållits på detta sätt är tillförlitligt friska under många timmar av inspelning, och är lämpliga för både fält-inspelningar och riktade patch-clamp inspelningar, inklusive inriktning av fluorescerande märkt nervceller.

Vi tillämpade ovanstående protokoll för att generera hippocampus skivor från CamKIIa-Cre +; WT-möss på en blandad genetisk bakgrund C57Bl/ 6 x SV/ 129J, vid P > 120. Stort antal pyramidceller i CA1-fältet (Figur 2A) och subiculum (Bild 2B) förekommer i låg kontrast när de observeras under infraröd differentialkontrastmikroskopi (IR-DIC), ett kännetecken för friska celler i en skiva beredning. Med denna beredning, en hög hastighet av giga-ohm tätni...

Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Detta är ett protokoll för akut skiva beredning från vuxna och åldrande mus hippocampi som drar nytta av transkardialaperfusion och skiva skärning med iskall NMDG-aCSF att minska hypoxisk skada på vävnaden. De resulterande skivorna håller sig friska under många timmar, och är lämpliga för långsiktiga patch-clamp och fält-inspelningar.

Minimera Hypoxi i Hippocampus skivor från vuxna och åldrande möss

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Protokollet presenteras här minskar överdriven hypoxisk skada under beredning av vuxna och åldrande mus hippocampus skivor, vilket tar bort ett stort hinder för att studera funktion mogna och åldrande neurala kretsar. Införande av hypotermi i natriumfria lösningar resulterar i hippocampus skivor som är friska i upp till 10 timmar efter styckning och lämplig för både långsiktiga fält-inspelningar och patch-clamp studier. Denna metod för att förbereda hippocampus skivor kan vara särskilt relevant för djurmodeller i neurodegenerativa sjukdomar som per definition kräver en åldrande hjärnan förberedelse.Det mest kritiska steget i detta protokoll är att införa hypotermi via transcardial profusion med en iskall lösning. Med viss praxis kommer forskare att kunna utföra detta steg på ett tillförlitligt sätt. Börja med att förbereda en liter aCSF-lösning för återhämtningskammaren och efterföljande inspelningar.Förbered sedan 300 milliliter NMDG-aCSF för transkardelampiket och skärstegen. Placera den vibrerande mikrotomskärarn och monteringsskivan i en frys med minus 20 grader Celsius. För att förbereda återhämtningskammaren, fyll den till strax ovanför skiva som håller mesh och starta bubblaren hålla kammaren på bänken vid rumstemperatur.Kyl hela 300 milliliter NMDG-aCSF i en frys tills iskristaller börjar bildas på ytan och flaskans väggar. Placera flaskan med kyld och NMDG-aCSF på is och bubbla den, hålla lösningen mellan noll och två grader Celsius. Ta ut vävnadsmonteringsskivan ur frysen och torka av den torr, om det behövs.Klipp ut ett block av 5%agar ungefär lika stor som en mushjärna och limma den i mitten av skivan med hjälp av ett tunt lager cyanoakrylatlim. Placera skivan med limmad agar på is och täck den med hushållspapper tills den är klar att använda. Ta ut skärbrickan ur frysen, placera den i mikrotomen och omge den sedan med is och ladda bladet.Förbered alla verktyg i förväg för hjärnsinfektionen. Ställ in peristaltisk pump för transkardial perfusion. Sätt in ena sidan av pumpslangen i flaskan med iskallt NMDG-aCSF och passa den andra sidan med en 27 gauge nål.Ställ in pumphastigheten på cirka 3,5 milliliter per minut. Vid denna hastighet är utflödet av en NMDG-aCSF en snabb resa, inte ett kontinuerligt flöde. Placera musen på ryggen på en blöja.Innan du fortsätter, bekräftade att musen är på ett kirurgiskt plan av anestesi genom att utföra en tå nypa. Musen ska vara svarar inte, sedan tejpade ner dess främre och bakben så att bröstet och buken utsätts. Klipp ut en stor fläck av huden på bröstet, går underifrån bröstbenet till halsen.Ta tag i bröstbenet med tärna, lyft det försiktigt och börja skära genom bröstkorgen på båda sidor tills brösthålan är utsatt. Skär genom membranet, lämnar flik av bröstkorgen fäst via en tunn bit av muskeln. Det bör vara möjligt att lägga den åt sidan utan att ha det falla tillbaka på den exponerade brösthålan.Kontrollera att hjärtat fortfarande slår och se till att det mesta av levern syns. Sätt in nålen i den vänstra ventrikeln, som ser ljusare ut i färg än den högra. För att stabilisera nålen, kör den genom de återstående revbenen på vänster sida av kroppen.Leta reda på det mörkröda högra atriumet och skär genom det med liten sax. Blodet ska börja rinna ut. Starta pumpen och observera levern, som kommer att ändra färg från rött till brunt.Övervaka levern färg och fortsätta perfusion tills levern blir blekbrun. Kör pumpen i ytterligare några minuter. Djurets kroppstemperatur bör sjunka till 28 till 29 grader Celsius och dess näsa ska vara kall vid beröring.Halshugga musen med stora halshuggning sax, sedan använda en skalpell med ett nummer 10 blad för att skära upp huden på toppen av skallen. Med liten vinklad sax, skär skallen vid mittlinjen. Därefter använder du nummer tre tärningar för att bända bort de högra och vänstra halvorna av skallen, vara noga med att ta duran bort med den.Ta bort hjärnan, som bör vara en off-white färg genom att ösa ut den med en spatel och släpp den i NMDG-aCSF lösning på is. Lämna den där i upp till en minut. Ta hjärnan ur NMDG-aCSF och placera den på en bit filterpapper.Skär och ta bort en 60 graders kil av vävnad med en 60 graders verktyg centrerad vid mittlinjen från rostrala änden av framhjärnan. Använd de skurna sidorna av monteringsytan eftersom det ger rätt vinkel för hippocampus skivor. Separera halvkloten ner mittlinjen med skalpell och limma dem på monteringsskivan.Ta monteringsskivan från isen och torka av den torr, om det behövs. Limma sedan varje halvklot framför agarblocket, skär sidan nedåt. Se till att de ventrala sidorna av båda halvkloten vidrör agarblocket och att ryggsidorna på båda halvkloten är vända mot bladet.När limmas på den skurna sidan, varje halvklot bör vara orienterad i förhållande till bladet på ett sätt som säkerställer tvärgående skivor av dorsala hippocampus in situ. Dränka skivan med halvkloten i en skärkammare som innehåller iskallt karbiogenerade NMDG-aCSF. Skär en 400 mikrometer avsnitt, sedan använda en disponibel överföring pipett med en cutoff spets för att överföra skiva till en återhämtning kammare som innehåller karbiogenerade NMDG-aCSF vid rumstemperatur.Fortsätt skära resten av sektionerna och överföra dem till återhämtningskammaren tar inte mer än 10 minuter att skära totalt åtta till 10 skivor från dorsala hippocampus regionen. Inkubera skivorna i rumstemperatur i cirka två timmar före inspelning. Detta protokoll användes för att generera hippocampus skivor från vuxna möss.Stort antal pyramidala celler i CA1 fältet och subiculum visas i låg kontrast, ett kännetecken för friska celler, när observeras under infraröd differentialkontrast mikroskopi. Patch-clamp inspelningar kan erhållas från CA1 nervceller av möss som är över sex månader gamla. I exemplet experiment här, frekvensen av miniatyr excitatoriska postsynaptic strömmar mättes efter NMDA-LTD var inducerad i förhållande till kontroll villkor.Frekvensen av miniatyr retande postsyndiga strömmar var lägre i nervceller efter en NMDA-LTD induktion, som anger verksamhet beroende beskärning av synopses i CA1. Ändringar i amplitud upptäcktes inte. Under mEPSC inspelningar, CA1 celler var också fylld biocytin och intakt dendritiska berså och friska cell habitus av pyramidala nervceller kan ses här.En robust fördelning av det fluorescerande färgämnet i hela cellen möjliggör analys av dendriter och dendritiska taggar under olika förhållanden. Långsiktig potentiering, eller LTP, av CA3-CA1 synapser på cirka 170%observerades, vilket tyder på att underhåll av signalering kaskader som behövs för LTP finns i skivor beredda från vuxna möss. Ett robust fält retande postsynaptic potentiella signalen tyder på att nätverksanslutningen också bevarades.Två kritiska aspekter av protokollet är transkardial profusion med en iskall lösning för att inducera hypotermi och införande av en NMDG som en natriumjonersättning i lösningar för att förhindra cytotoxiska ödem. Med hjälp av dessa försiktighetsåtgärder kan akuta skivor förberedas från alla hjärnregion. Dessutom kan skivor som bereds på detta sätt användas för kalcium- och spänningsavbildning med hjälp av tvåfoton- eller widefieldmikroskopi.Detta protokoll skulle kunna tjäna som grund för en standardiserad förberedelse för akut hippocampus skivor från åldrande djur och därmed underlätta jämförelser över studier i samband med neurodegenerativa sjukdomar mekanismer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Beredning av Oligomer β-amyloid 1-42 Och induktion av synaptisk plasticitet Nedskrivning av hippocampus Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Beredning av akut hippocampus Skivor från råttor och transgena möss för studier av Synaptic Förändringar under åldrandet och Amyloid patologi

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering och kultur hippocampusneuroner från Prenatal möss

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Utredning av Synaptic märkning / Capture och Cross-capture använder akut hippocampus skivor från Gnagare

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Utvärdering av synaps densitet i hippocampus gnagare hjärnan skivor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Optogenetic ångan av hippocampus Theta svängningar i beter sig möss

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Beredning av akut mänskliga Hippocampus skivor för elektrofysiologiska Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Kontinuerlig videoelektroencefalogram under hypoxi-ischemi hos neonatalmöss

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...