Name: minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice
Uploaded: 2020-07-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Dr. Carla J. Shatz'a tavsiye ve destek için teşekkür ederim ve Dr. Barbara K. Brott ve Michelle K. Drews'a taslağı eleştirel olarak okudukları için teşekkür ederim. Çalışma NIH EY02858 ve Mathers Charitable Foundation tarafından CJS hibe desteklenir.

Protokol, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülür ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanır. Yöntemler aynı zamanda Nörobilim Araştırmalarında Hayvan ve İnsanların Kullanımına Ilişkin Nörobilim Derneği'nin politikalarına da uygun olarak kullanılmaktadır.
NOT: Tüm fareler patojensiz bir ortamda muhafaza edildi. Karışık C57Bl/ 6 x SV/ 129J genet...

<ol>
	<li>Glanzman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+mechanisms+of+learning+in+Aplysia:+of+blind+men+and+elephants.">The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants.</a> Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).</li><li>Aitken, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparative+methods+for+brain+slices:+a+discussion.">Preparative methods for brain slices: a discussion.</a> Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).</li><li>Edwards, F. A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamping+cells+in+sliced+tissue+preparations.">Patch-clamping cells in sliced tissue preparations.</a> Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).</li><li>Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Ischemia+on+Known+Substrates+and+Cofactors+of+the+Glycolytic+Pathway+in+Brain.">Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain.</a> Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hypoxia+on+evoked+potentials+in+the+in+vitro+hippocampus.">The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus.</a> Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).</li><li>Lipton, P., Whittingham, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+ATP+concentration+as+a+basis+for+synaptic+transmission+failure+during+hypoxia+in+the+in+vitro+guinea-pig+hippocampus.">Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus.</a> Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).</li><li>Free Mandel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.S.+Free+nucleotides+of+the+brain+in+various+mammals.">H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals.</a> Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).</li><li>Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+energetics+and+tolerance+to+anoxia+in+deep+hypothermia.">Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).</li><li>Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modest+hypothermia+preserves+cerebral+energy+metabolism+during+hypoxia-ischemia+and+correlates+with+brain+damage:+a+31P+nuclear+magnetic+resonance+study+in+unanesthetized+neonatal+rats.">Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats.</a> Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).</li><li>Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associative+pairing+enhances+action+potential+back-propagation+in+radial+oblique+branches+of+CA1+pyramidal+neurons.">Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons.</a> Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).</li><li>Thomson, A. M., Bannister, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release-independent+depression+at+pyramidal+inputs+onto+specific+cell+targets:+dual+recordings+in+slices+of+rat+cortex.">Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex.</a> Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).</li><li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+of+the+sodium+channel+to+organic+cations+in+myelinated+nerve.">The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve.</a> Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).</li><li>Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), 1-10 (2015).</li><li>Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+modulation+of+hippocampal+synaptic+plasticity+via+PirB+and+endocannabinoids.">Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids.</a> Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).</li><li>Djurisic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+regulates+a+structural+substrate+for+cortical+plasticity.">PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).</li><li>Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Autonomous+Regulation+of+Dendritic+Spine+Density+by+PirB.">Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB.</a> eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).</li><li>Blot, A., Barbour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-rapid+axon-axon+ephaptic+inhibition+of+cerebellar+Purkinje+cells+by+the+pinceau.">Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau.</a> Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).</li><li>Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection-specific+modulation+of+dopamine+neuron+synapses+by+aversive+and+rewarding+stimuli.">Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli.</a> Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).</li><li>Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Acute+Brain+Slices+Using+an+Optimized+N-Methyl-D-glucamine+Protective+Recovery+Method.">Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method.</a> Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).</li><li>Moyer, J. R., Brown, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+whole-cell+recording+from+visually+preselected+neurons+of+perirhinal+cortex+in+brain+slices+from+young+and+aging+rats.">Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats.</a> Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).</li><li>Frick, A., Magee, J., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTP+is+accompanied+by+an+enhanced+local+excitability+of+pyramidal+neuron+dendrites.">LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).</li><li>Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+beta+inhibits+olfactory+bulb+activity+and+the+ability+to+smell.">Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell.</a> PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).</li><li>Brooks, J. M., O'Donnell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kappa+Opioid+Receptors+Mediate+Heterosynaptic+Suppression+of+Hippocampal+Inputs+in+the+Rat+Ventral+Striatum.">Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum.</a> Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).</li><li>Goel, A., Lee, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+experience-induced+homeostatic+synaptic+plasticity+through+adulthood+in+superficial+layers+of+mouse+visual+cortex.">Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex.</a> Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).</li><li>Izumi, Y., Zorumski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+pyruvate+following+NMDA-mediated+excitotoxic+insults+in+hippocampal+slices.">Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices.</a> Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).</li><li>Hajos, N., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+physiological+environment+for+visualized+in+vitro+brain+slice+recordings+by+increasing+oxygen+supply+and+modifying+aCSF+content.">Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content.</a> Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).</li><li>. Hippocampus Rat Available from: <a target="_blank" href="https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat">https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat</a> (1999)</li><li>Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+Mechanisms+of+Frequency+Selectivity+in+the+Proximal+Dendrites+of+CA1+Pyramidal+Neurons.">Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li></ol>

Burada açıklanan protokol, yetişkin ve yaşlanan farelerden elde edilen hipokampal dilimlerin kesimden sonra saatlerce sağlıklı ve canlı kalabildiğini göstermektedir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan dilimler, yama kelepçesi kayıtlarının yanı sıra CA1 bölgelerindeuzun ömürlü alan kayıtları için uygundur.
Bu protokolde iki kritik adım vardır. İlk adım buz gibi bir çözelti ile transkardiyal perfüzyon adımıdır. Kan hızlı açıklık karaciğer renginin hızl?...

Memeli akut beyin dilimi preparatları gelişiyle daha önce Aplysia gibi omurgasız preparatlar sadece mümkün olan hücresel ve sinaptik düzeyde deneyler kolaylaştırdı1. Akut hipokampal dilimlerin gelişimi özellikle önem taşıyordu, çünkü çalışan hafıza ve bağlam oluşumundan sorumlu bir yapıdır ve kolay fizyolojik manipülasyona uygun özel bir tri-sinaptik devreye sahiptir. Ancak, akut beyin dilimleri büyük çoğunluğu hala nispeten genç fare ve sıçanlar hazırlanır, sağlıklı nöronlar ve devreleri korumak daha kolay olduğu gibi, ve dilimleri uzun süre canlı kalır2,3,4. Burada, yetişkin ve yaşlanan farelerden akut hipokampal dilimlerin daha canlı olması yla sonuçlanan standart dilimleme protokollerinde değişiklikler sıyoruz.
Memeli beyin parankim uzun vadeli ex vivo canlılık için büyük engel beyin kan akışını n için decapitation aşağıdaki durur kez hızla meydana gelen ilk hipoksik hasardır. Oksijen kaybı fosfo-kreatin kaybı ile beyinde büyük enerji kaynaklarının hızlı metabolik tüketimi sonuçları (P-kreatin) en hızlı olmak, glikoz takip, adenozin trifosfat (ATP), ve glikojen4. ATP korunması beyin dilimlerinin uzun vadeli sağlığı için özel önem taşımaktadır, ATP Na-K ATPase ile membran potansiyelini korumak için gerekli olduğu gibi, ve sonuç olarak nöral aktivite5,6. Yetişkin kemirgen beyinDE ATP seviyesi ~ 2.5 mM, ve bir bazal sabit durumuna ulaşmak için 20 s içinde hızla düşer (~ 0.5 mM) etrafında 1 dk post-decapitation4,7,8. Genç hayvanlarda, ATP aynı damla gözlemlemek için daha uzun sürer (~ 2 dk); fenobarbital anestezi ile 4 dk4'edaha da yavaşlar. Bu hususlar ATP ve diğer enerji kaynaklarının kaybını önlemek için gerekli bir strateji beyin hipoksik hasarı önlemek ve sırayla uzun süreler boyunca beyin dilimlerinin sağlığını korumak için gerekli bir strateji olduğunu göstermektedir, özellikle yetişkin hayvanlarda.
Düşük sıcaklıklar metabolizmayı yavaşlatır. Sonuç olarak, mütevazı hipotermi beyin enerji rezervlerini korur gösterilmiştir: genç hayvanlarda, altı derece vücut ısısını düşüren, 37 °C'den 31 °C'ye, KONTROLLÜ hipoksi nin 4 saat üzerindeki normal seviyelerin yaklaşık %80'ine kadar ATP seviyelerini korur9. P-kreatin düzeyleri benzer şekilde korunur, yanı sıra genel fosforilasyon potansiyeli9. Bu, kafa kesmeden önce vücut ısısını düşürmenin nöroprotektif olabileceğini düşündürmektedir, çünkü normale yakın ATP seviyeleri dilim kesme ve dilim geri kazanım dönemlerinde korunabilir.
Bir ATP düşüştamamen decapitation üzerine önlenemez ölçüde, Na-K ATPase kısmen bozulmuş fonksiyonu bekleniyor, pasif sodyum akını ile depolarizasyon takip. Pasif sodyum akını hücrelere su girişi takip gibi, sitotoksik ödem ve sonunda pyknoz neden olur. Yetişkin sıçanlarda, dilim kesme çözeltilerinde Na+ iyonlarının sakaroz la değiştirilmesi sitotoksik ödemin yükünü hafifletmek için başarılı bir strateji olmuştur10,11. Daha yakın zamanda, sodyum kanal geçirgenliği azaltmak metillenmiş organik katyonlar12 sakaroz daha etkili koruma sunmak için göstermiştir, özellikle yetişkin farelerden dilimleri, N-metil-D-glukagon ile (NMDG) en yaygın farklı yaş ve beyin bölgeleri arasında uygulanabilir olan13,14,15,16.
Çok sayıda beyin dilimleme protokolleri sadece dilim kesme adımı sırasında soğuk sıcaklıklar kullanarak içerir, bazen Na+ iyon değiştirme stratejisi ile birlikte16,17. Genç hayvanlarda, beyinler kafa kesme den sonra hızlı bir şekilde ayıklanabilir çünkü kafatası hala ince ve kaldırmak kolay olduğu için yeterli nörokoruma sunmak için görünür3. Ancak, bu strateji yetişkin hayvanlardan sağlıklı dilimler üretmez. Zamanla, yetişkin kemirgenler inceleyen laboratuvarların bir dizi hayvanın vücut ısısını azaltmak için buz gibi bir çözelti ile transkardiyal perfüzyon tanıttı, ve bu nedenle beyne hipoksik hasar, önce decapitation. Bu işlem başarıyla serebellar dilimleri üretmek için uygulandı18, orta beyin dilimleri19, neokortikal dilimler11,20, perirhinal korteks21, sıçan hipokampus10,22,23, koku ampul24, ventral striatum25, görme korteks26.
Sıçan ve farelerde bazı beyin bölgelerinde dilimleri hazırlanmasında transkardiyal perfüzyon ve Na+ iyon replasmanı tarafından sunulan avantajlara rağmen, fare hipokampus hipoksi korumak için en zorlu alanlardan biri olmaya devam etmektedir13,20. Bugüne kadar, nörodejenerasyon yaşlanma fareler ve fare modelleri hipokampus dilimleme için en yaygın yaklaşımlardan biri izole hipokampi klasik hızlı dilimleme içerir27. Burada açıklanan protokolde, hayvana çapraz olarak buz gibi Na+- serbest NMDG tabanlı yapay beyin-omurilik sıvısı (NMDG-aCSF) ile transkardi olarak nüfuz ederek beyin kesiti uygulayarak yetişkin beyindeki ATP kaybını en aza indiriyoruz. Dilimler daha sonra buz gibi Na+-free NMDG-aCSF olarak kesilir. Bu gelişmiş protokol ile dilimleme den sonra 10 saate kadar sağlıklı ve uzun süreli alan kayıtları ve yama-kıskaç çalışmaları için uygun olan yetişkin ve yaşlanan farelerden akut hipokampal dilimler elde ediyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#8220;60 degree&#8221; tool</td>
			<td>made in-house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 scalpel blade</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>21114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95%O2/5%CO2</td>
			<td>Praxiar or another local supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acepromazine maleate (AceproJect)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>5700850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers, measuring cylinders, reagent bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes size 00-2</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td></td>
			<td>Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choline bicarbonate</td>
			<td>Pfalz &#38; Bauer</td>
			<td>C21240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrilate glue</td>
			<td>Krazy glue</td>
			<td></td>
			<td>Singles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decapitation scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14130-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Feather blades</td>
			<td>Feather</td>
			<td>FA-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper #2</td>
			<td>Whatman</td>
			<td></td>
			<td>Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>A. Dumont &#38; Fils</td>
			<td>Inox 3c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) - porosity 3</td>
			<td>Robuglas.com</td>
			<td>18103 or 18113</td>
			<td>Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A144SI-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice buckets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl (KetaVed)</td>
			<td>VEDCO</td>
			<td>NDC 50989-996-06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Tissue slicer VT1000S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrers and stir bars</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2SO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliQ water machine</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Source for 18 Mohm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0320-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle 27G1/2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDG</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>#7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump head</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>Masterflex #7518-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Personna blades</td>
			<td></td>
			<td>Personna double edge</td>
			<td>Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery chamber</td>
			<td>in-house made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade handle size 3</td>
			<td>Bard-Parker (Aspen Surgical)</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors angled blade</td>
			<td>FST</td>
			<td>14081-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single edge industrial razor blade #9</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Samco Scientific</td>
			<td>225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus BX51WI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl (XylaMed)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>510650</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

minimizing hypoxia in hippocampal slices from adult and aging mice

Akut hipokampal dilimler nörolognesiller sinaptik keşfetmek için sağlamıştır, nöronal, ve ayrıntılı olarak devre özellikleri ve yüksek sadakat ile. LTP ve LTD mekanizmalarının araştırılması, tek nöron dendritik hesaplaması ve devrelerde deneyime bağlı değişiklikler, bu klasik hazırlık olmadan mümkün olamazdı. Ancak, birkaç istisna dışında, akut hipokampal dilimleri kullanarak en temel araştırma nispeten genç yaşlarda kemirgenler dilimleri kullanılarak yapılmıştır, ~ P20-P40, sinaptik ve içsel uyarılabilirlik mekanizmaları geçmiş P60 ulaşan uzun bir gelişimsel kuyruk olmasına rağmen. Genç hipokampal dilimleri kullanarak ana itiraz hipoksik hasara daha yüksek tolerans tarafından desteklenen nöronal sağlık korunmasıdır. Ancak, gelişmenin daha olgun aşamalarında nöronal fonksiyonu anlamak için bir ihtiyaç vardır, daha da yaşlanan bir beyin hazırlık gerektiren nörodejeneratif hastalıkların çeşitli hayvan modellerinin geliştirilmesi ile vurgulanan. Burada güvenilir yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi sağlıklı dilimler sunar akut hipokampal dilim hazırlanması için bir değişiklik açıklar. Protokolün kritik adımları transkardiyal perfüzyon ve buz gibi sodyumiçermeyen NMDG-aSCF ile kesimdir. Birlikte, bu adımlar decapitation üzerine ATP hipoksilen damla zayıflatmak, yanı sıra pasif sodyum akılarının neden olduğu sitotoksik ödem. Titreşen bir mikrotom kullanarak hipokampus artı korteksin transversal dilimlerinin nasıl kesilen yolu göstereceğiz. Bu şekilde elde edilen akut hipokampal dilimler, saatlerce kayıt ta güvenilir bir şekilde sağlıklıdır ve floresan etiketli nöronların hedefalınması da dahil olmak üzere hem alan kayıtları hem de hedeflenen yama-kıskaç kayıtları için uygundur.

CamKIIa-Cre+'dan hipokampus dilimleri oluşturmak için yukarıdaki protokolü uyguladık; WT fareler karışık genetik arka plan C57Bl / 6 x SV / 129J, P > 120. Ca1 alanında çok sayıda piramidal hücre(Şekil 2A)ve subikülum(Şekil 2B)bir dilim hazırlama sağlıklı hücrelerin bir özelliği olan kızılötesi diferansiyel kontrast mikroskopisi (IR-DIC) altında gözlendiğinde düşük kontrast görünür. Bu hazırlık la birlikte yüksek oranda giga-o...

Watch this Scientific Journal Video about Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice at JoVE.com

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.

Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Burada sunulan protokol yetişkin ve yaşlanan fare hipokampal dilimlerinin hazırlanması sırasında aşırı hipoksik hasarı azaltarak, olgun ve yaşlanan nöral devrelerin işlevini incelemek için önemli bir engeli ortadan kaldırır. Sodyumiçermeyen çözeltilerde hipoterminin ortaya çıkması, kesimden sonra 10 saate kadar sağlıklı ve hem uzun süreli alan kayıtları hem de yama-kıskaç çalışmaları için uygun olan hipokampal dilimlerle sonuçlanır. Hipokampal dilimler hazırlama Bu yöntem tanımı gereği bir yaşlanma beyin hazırlık gerektiren nörodejeneratif hastalıklarda hayvan modelleri için özellikle ilgili olabilir.Bu protokoldeki en kritik adım, buz gibi bir çözelti ile transkardiyal profüzyon yoluyla hipotermi getirilmesidir. Bazı uygulamalarla, araştırmacılar bu adımı güvenilir bir şekilde uygulayabilecekler. Kurtarma odası ve sonraki kayıtlar için bir litre aCSF çözümü hazırlayarak başlayın.Sonra transkardiyal profüzyon ve kesme adımları için NMDG-aCSF 300 mililitre hazırlayın. Titreşimli mikrotom kesme tepsisini ve montaj diskini eksi 20 derecelik bir dondurucuya yerleştirin. Kurtarma odası hazırlamak için, örgü tutan dilim hemen üstüne doldurun ve oda sıcaklığında bankta oda üzerinde oda tutarak kabarcık başlar.Buz kristalleri yüzey ve şişe duvarları oluşmaya başlayana kadar bir dondurucuda NMDG-aCSF tüm 300 mililitre chill. Sıfır ve iki derece santigrat arasında çözelti tutarak, buz ve kabarcık üzerine soğutulmuş ve NMDG-aCSF ile şişe yerleştirin. Doku montaj diskini dondurucudan alın ve gerekirse kurusilin.Bir fare beyin boyutu hakkında% 5 agar bir blok kesip ve cyanoakrilat tutkal ince bir tabaka kullanarak diskin ortasında tutkal. Buz üzerine yapıştırılmış agar ile disk yerleştirin ve kullanıma hazır olana kadar kağıt havlu ile kaplayın. Kesme tepsisini dondurucudan çıkarın, mikrotome yerleştirin, sonra buzla çevreleyin ve bıçağı yükleyin.Beyin diseksiyonu için tüm aletleri önceden hazırlayın. Transkardiyal perfüzyon için peristaltik pompayı ayarlayın. Buzlu NMDG-aCSF ile şişeiçine pompa boru bir tarafı yerleştirin ve 27 gauge iğne ile diğer tarafa uygun.Pompa hızını dakikada yaklaşık 3,5 mililitreye ayarlayın. Bu hızda, bir NMDG-aCSF çıkışı hızlı bir yolculuk değil, sürekli bir akış. Fareyi sırt üstüne bir bez üzerine yerleştirin.Devam etmeden önce, fare bir parmak çimdik gerçekleştirerek anestezi cerrahi bir düzlemde olduğunu doğruladı. Fare tepkisiz olmalı, daha sonra göğüs ve karın maruz böylece ön ve arka bacaklar aşağı bantlanmış. Göğüs kafesinin altından boğaza doğru giden derinin büyük bir parçasını kesin.Sternum'u forsepslerle alın, hafifçe kaldırın ve göğüs boşluğu açığa çıkana kadar her iki taraftaki göğüs kafesini kesmeye başlayın. Diyafram keserek, ince bir kas parçası ile bağlı göğüs kafesi kapağı bırakarak. Bu maruz göğüs boşluğuna geri düşmeden bir kenara koymak mümkün olmalıdır.Kalbin hala atışını kontrol edin ve karaciğerin çoğunun görünür olduğundan emin olun. İğneyi sağdan daha açık görünen sol ventriküle takın. İğneyi stabilize etmek için, vücudun sol tarafındaki kalan kaburgalardan geçirin.Koyu kırmızı renkli sağ atriyum bulun ve küçük makas ile kesti. Kan akmaya başlamalı. Pompa başlatın ve kırmızıdan kahverengiye renk değişecek karaciğer, gözlemlemek.Karaciğer rengini izleyin ve karaciğer soluk kahverengi dönene kadar perfüzyon devam edin. Pompayı birkaç dakika daha çalıştırın. Hayvanın vücut ısısı 28-29 dereceye düşmeli ve burnu dokunmak için soğuk olmalıdır.Farenin kafasını büyük decapitation makasla deşin, sonra kafatasının üstündeki deriyi açmak için 10 numaralı bıçakla neşter kullanın. Küçük açılı makas ile, orta hatta kafatası kesti. Daha sonra, kafatasının sağ ve sol yarım larını gözetlemek için üç numaralı forceps'u kullanın, durayı onunla birlikte götürmeye dikkat edin.Bir spatula ile dışarı kepçe ve buz üzerinde NMDG-aCSF çözeltisi içine bırakarak bir off-beyaz renk olmalıdır beyin, çıkarın. Bir dakika kadar orada bırakın. Beyni NMDG-aCSF'den çıkar ve bir filtre kağıdına yerleştirin.Ön beynin rostral ucundan orta hatta ortalanmış 60 derecelik bir aletle 60 derecelik bir doku dilimini kesip çıkarın. Hipokampal dilimler için uygun açı yı sağladığı için montaj yüzeyinin kesilmiş kenarlarını kullanın. Neşter ile orta hattan yarımküreleri ayırın ve montaj diskine yapıştırın.Buzdan montaj diskini alın ve gerekirse kuru silin. Sonra agar blok önünde her yarımkürede tutkal, yan aşağı kesti. Her iki yarımkürenin ventral kenarlarının agar bloğuna değdiğinden ve her iki yarımkürenin sırt tarafının bıçakla karşı karşıya olduğundan emin olun.Kesilen tarafta yapıştırıldığında, her yarımküre yerinde dorsal hipokampus enine dilimleri sağlayan bir şekilde bıçak göreli yönlendirilmelidir. Diski yarımkürelerle birlikte buz gibi karbogenated NMDG-aCSF içeren bir kesme odasına batırın. 400 mikrometrelik bir kesin, sonra dilimi oda sıcaklığında karbogenated NMDG-aCSF içeren bir kurtarma odasına aktarmak için kesme ucu olan tek kullanımlık bir transfer pipeti kullanın.Geri kalan bölümleri kesmeye ve dorsal hipokampus bölgesinden toplam 8-10 dilim kesmek için en fazla 10 dakika alarak kurtarma odasına aktarmaya devam edin. Kayıt yapmadan önce dilimleri oda sıcaklığında yaklaşık iki saat kuluçkaya yatırın. Bu protokol yetişkin farelerden hipokampal dilimler oluşturmak için kullanıldı.CA1 alanında ve subiculumda çok sayıda piramidal hücre, kızılötesi diferansiyel kontrast mikroskopisi altında gözlendiğinde, sağlıklı hücrelerin bir özelliği olan düşük kontrastta görünür. Yama-kelepçe kayıtları altı aylıktan eski farelerin CA1 nöronlarından elde edilebilir. Buradaki örnek deneyde, nmda-LTD kontrol koşullarına göre indüklendikten sonra minyatür uyarıcı postsinaptik akımların sıklığı ölçüldü.Minyatür uyarıcı postsinaptik akımların sıklığı, NMDA-LTD indüksiyonundan sonra nöronlarda daha düşüktü ve CA1'deki sinopsitlerin aktiviteye bağlı budamasını gösteriyordu. Genlik değişiklikleri algılanmadı. mEPSC kayıtları sırasında CA1 hücreleri de biyositin dolduruldu ve bozulmamış dendritik arbor ve piramidal nöronların sağlıklı hücre habitus burada görülebilir.Floresan boyanın hücre boyunca sağlam bir dağılımı, farklı koşullar altında dendritlerin ve dendritik dikenlerin analizini sağlar. CA3-CA1 sinapslarının yaklaşık %170'lik uzun süreli potentiation veya LTP'si gözlenmiştir ve bu da LTP için gerekli sinyal basamaklarının yetişkin farelerden hazırlanan dilimlerde mevcut olduğunu düşündürmektedir. Sağlam bir alan uyarıcı postsinaptik potansiyel sinyal ağ bağlantısı da korunmuş olduğunu göstermektedir.Protokolün iki kritik yönü hipotermi ve sitotoksik ödemi önlemek için çözümler de sodyum iyon yerine bir NMDG giriş bir buz gibi çözelti ile transkardiyal profüzyon vardır. Bu önlemler kullanılarak herhangi bir beyin bölgesinden akut dilimler hazırlanabilir. Ayrıca, bu şekilde hazırlanan dilimler iki foton veya geniş alan mikroskobu kullanılarak kalsiyum ve voltaj görüntülemeiçin kullanılabilir.Bu protokol, yaşlanan hayvanlardan akut hipokampal dilimler için standart bir hazırlık için bir temel olarak hizmet verebilir ve böylece nörodejeneratif hastalık mekanizmaları bağlamında çalışmalar arasında karşılaştırmalar kolaylaştırmak.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Preparation of Oligomeric ÃƒÅ½Ã‚Â²-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Kemirgenler gelen akut Hipokampal Dilimleri kullanarak Synaptic Etiketleme / yakalama ve Çapraz yakalama İncelenmesi

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Hipokampal teta salınımlarını fareler davranışlar içinde Optogenetic sürüklenme

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Elektrofizyolojik Kayıtlar için Akut İnsan Hipokampal Dilimlerinin Hazırlanması

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Continuous Video Electroencephalogram during Hypoxia-Ischemia in Neonatal Mice

Yenidoğan Farelerde Hipoksi-İskemi Sırasında Sürekli Video Elektroensefalogram

Hypoxia ischemia is the most common cause of neonatal seizures. Animal models are crucial for understanding the mechanisms and physiology underlying ...