Name: creating matched in vivo/in vitro patient-derived model pairs of pdx and pdx-derived organoids for cancer pharmacology research
Uploaded: 2021-05-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research at JoVE.com

Gli autori ringraziano la Dott.ssa Jody Barbeau, Federica Parisi e Rajendra Kumari per la lettura critica e la modifica del manoscritto. Gli autori ringraziano anche il crown bioscience oncology in vitro e il team in vivo per i loro grandi sforzi tecnici.

Tutti i protocolli e le modifiche o le procedure che prevedono la cura e l'uso degli animali sono stati rivisti e approvati dal Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) prima di condurre gli studi. La cura e l'uso degli animali è stato condotto in conformità con le linee guida internazionali AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) come riportato nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, Consiglio Nazionale delle Ricerche (2011). Tut...

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+RNAi+library+based+on+partially+randomized+consensus+sequences+of+nuclear+receptors:+identifying+the+receptors+involved+in+amyloid+beta+degradation.">A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation.</a> Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subset+of+gastric+cancers+with+EGFR+amplification+and+overexpression+respond+to+cetuximab+therapy.">A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy.</a> Scientific Reports. 3, 2992 (2013).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+defined+oncogenic+mutation+alleles+seems+to+better+predict+the+response+to+cetuximab+in+CRC+patient-derived+xenograft+than+KRAS+12/13+mutations.">A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations.</a> Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pathology+of+Patient+Tumors,+Patient-Derived+Xenografts,+and+Cancer+Cell+Lines.">Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines.</a> Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Tiriac, H., French, R., Lowy, A. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+BRAF+and+MEK+Inhibition+With+Dabrafenib+and+Trametinib+in+BRAF+V600-Mutant+Colorectal+Cancer.">Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. , (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li></ol>

I dati preliminari per PDX-/PDXO-CR2110 in questo rapporto supportano l'equivalenza biologica tra PDX e il suo derivato, PDXO, per quanto riguarda la genomica, l'istopatologia e la farmacologia, poiché entrambi i modelli rappresentano le forme di malattia derivate dal CSC originale del paziente. Entrambi i modelli sono modelli di malattia derivati dal paziente, potenzialmente predittivi della risposta clinicadei pazienti 10,11,12,</s...

I tumori sono una raccolta di diversi disturbi genetici e immunologici. Lo sviluppo riuscito di trattamenti efficaci dipende fortemente da modelli sperimentali che prevedono efficacemente i risultati clinici. Grandi librerie di xenoinnesti ben caratterizzati di origine paziente (PDX) sono state a lungo viste come il sistema trascizionale in vivo di scelta per testare terapie chemio- e / o mirate grazie alla loro capacità di ricapitolare le caratteristiche tumorali del paziente, l'eterogeneità e la risposta del farmaco delpaziente 1, consentendo così agli studi clinici sul topo di fase II di migliorare ilsuccesso clinico 2,3. I PDX sono generalmente considerati malattie delle cellule staminali tumorali, con stabilità genetica, in contrasto con gli xenoinnesti derivati dalla lineacellulare 2. Negli ultimi decenni, grandi collezioni di PDX sono state create in tutto il mondo, diventando oggi il cavallo di battaglia dello sviluppo di farmaci antitumorali. Sebbene ampiamente utilizzati e con un grande valore trasdizionale, questi modelli animali sono intrinsecamente costosi, dispendiosi in termini di tempo e bassa produttività, quindi inadeguati per lo screening su larga scala. La PDX è anche indesiderabile per i test di immuno-oncologia (IO) a causa di una natura immuno-compromessa4. Non è quindi pratico sfruttare appieno la grande libreria disponibile di PDX.
Recenti scoperte, pioniere del laboratorio5di Hans Clevers, hanno portato alla creazione di colture in vitro di organoidi generati da cellule staminali adulte nella maggior parte degli organi umani di origine epiteliale5. Questi protocolli sono stati ulteriormente perfezionati per consentire la crescita di organoidi da cSC presunti in carcinomi umani di varieindicazioni 6,7. Questi organoidi derivati dal paziente (DOP) sono genomicamente stabili8,9 e hanno dimostrato di essere altamente predittivi degli esiti del trattamentoclinico 10,11,12. Inoltre, la natura in vitro delle DOP consente lo screening ad alta produttività (HTS)13, offrendo così potenzialmente un vantaggio rispetto ai modelli in vivo e sfruttando grandi librerie organoidi come surrogato della popolazione del paziente. Le DOP sono pronta a diventare un'importante piattaforma di scoperta e traduzione, superando le numerose limitazioni dei PDX sopra descritte.
Sia la DOP che la PDX sono modelli derivati dal paziente e guidati dal CSC, con la capacità di valutare le terapie nel contesto di un trattamento personalizzato o di un formato di sperimentazione clinica. Le grandi librerie esistenti di PDX, come la collezione proprietaria di >3000 PDX14,15,16,17, sono quindi adatte per la rapida generazione di librerie di organoidi tumorali (organoidi derivati da PDX, o PDXO), dando vita a una libreria abbinata di modelli PDX e PDXO accoppiati. In questo report viene descritta la procedura per creare e caratterizzare il cancro colorettale PDXO-CR2110 in relazione al suo PDX-CR2110 parentalemodello 16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Washing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenese type II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Digest tumor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ac</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7076</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38-1000</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole</td>
			<td>M1817</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Screening assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9683</td>
			<td>Screening assay (luminescent ATP indicator)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop dispenser</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Multidrop combi</td>
			<td>Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dispener</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>Compound addition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2104</td>
			<td>Luminescence reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c nude mice</td>
			<td>Beijing HFK Bio-Technology Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>tRNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Organoid embedding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating matched in vivo/in vitro patient-derived model pairs of pdx and pdx-derived organoids for cancer pharmacology research

Gli xenografti tumorali derivati dal paziente (PDX) sono considerati i modelli preclinici più predittivi, in gran parte ritenuti guidati da cellule staminali tumorali (CSC) per la valutazione convenzionale dei farmaci antitumorali. Una vasta libreria di PDX riflette la diversità delle popolazioni di pazienti e consente quindi studi preclinici basati sulla popolazione ("Studi clinici sul topo simili alla fase II"); tuttavia, pdx ha limitazioni pratiche di bassa produttività, costi elevati e lunga durata. Gli organoidi tumorali, essendo anche modelli guidati dal CSC derivati dal paziente, possono essere considerati come l'equivalente in vitro del PDX, superando alcune limitazioni PDX per trattare grandi librerie di organoidi o composti. Questo studio descrive un metodo per creare organoidi derivati dalla PDX (PDXO), risultando così in modelli accoppiati per la ricerca farmacologica in vitro e in vivo. I tumori PDX-CR2110 trapiantati per via sottocutanea sono stati raccolti da topi portanti di tumore quando i tumori hanno raggiunto i 200-800 mm3, secondo una procedura di autopsia approvata, seguita dalla rimozione dei tessuti non tumorali adiacenti e dissociazione in piccoli frammenti tumorali. I piccoli frammenti tumorali sono stati lavati e passati attraverso un colino cellulare di 100 μm per rimuovere i detriti. I grappoli cellulari sono stati raccolti e sospesi in soluzione di estratto di membrana basale (BME) e placcati in una piastra da 6 po 'come una goccia solida con mezzi liquidi circostanti per la crescita in un incubatore di CO2. La crescita organoide è stata monitorata due volte alla settimana sotto microscopia ottica e registrata dalla fotografia, seguita da una variazione media liquida 2 o 3 volte a settimana. Gli organoidi coltivati furono ulteriormente passaggi (7 giorni dopo) con un rapporto di 1:2 interrompendo gli organoidi incorporati BME usando la cesoia meccanica, aiutati dall'aggiunta di tripina e dall'aggiunta di 10 μM Y-27632. Gli organoidi sono stati crioconservati in crio-tubi per la conservazione a lungo termine, dopo il rilascio dal BME per centrifugazione, e anche campionati (ad esempio, DNA, RNA e blocco FFPE) per un'ulteriore caratterizzazione.

Morfologia dei PDXO, tipica degli organoidi sotto microscopia leggera, e coerente con la colorazione PDX parentale per H&E In microscopia ottica, PDXO-CR2110 dimostra la tipica morfologia cistica (Figura 1A), come descritto in precedenza per gli organoidi derivati dal paziente (DOP), prove a sostegno della somiglianza tra PDXO e DOP nelle stesse condizioni di coltura.
L'esame istopatologico da parte della colorazione H&E rivela che le strutture...

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Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

Viene descritto un metodo per creare organoidi utilizzando xenoinnesti derivati dal paziente (PDX) per lo screening in vitro, con conseguente coppie abbinate di modelli in vivo/in vitro. I tumori PDX sono stati raccolti/trasformati in piccoli pezzi meccanicamente o enzimaticamente, seguiti dal metodo clevers per far crescere organoidi tumorali che sono stati passaggi, crioconservati e caratterizzati contro il PDX originale.

Creazione di coppie di modelli in vivo/in vitro derivati dal paziente abbinate di organoidi derivati da PDX e PDX per la ricerca farmacologica sul cancro

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

Questo protocollo può essere utilizzato per stabilire una libreria abbinata di xenoinnesti accoppiati derivati dal paziente, o PDX, e corrispondenti linee organoidi derivate dal paziente. Il vantaggio di questo metodo è che può essere utilizzato per creare organoidi utilizzando PDX per lo screening in vitro, con conseguente coppie abbinate di modelli in vivo / in vitro. Inizia raccogliendo i tumori ed elaborando il tessuto come descritto nel manoscritto testuale.Dopo la digestione dei tessuti, pipettare il tessuto su e giù con una pipetta di plastica sterile da cinque millilitri. Quindi aggiungere 20 millilitri di AD+ all'omogeneato e filtrarlo con un filtro cellulare da 100 micrometri. Lavare il filtrato due volte con AD+, quindi trasferirlo su un tubo di plastica e centrifugarlo a 450 volte G per cinque minuti.Rimorsi le cellule in BME e tenerle sul ghiaccio. Per preparare la coltura organoide, trasferire 200 microlitri della sospensione cellulare in ogni pozzo di una piastra a sei porri e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Aggiungere due millilitri di mezzi organoidi a ciascun pozzo e mentre l'immagine del rappresentante scende al microscopio.Mantenere le colture organoidi a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con variazioni medie ogni tre o quattro giorni e passare a un rapporto uno a due ogni sette giorni. Dopo aver dissociato gli organoidi, farli passare attraverso un filtro da 70 micrometri in un tubo di plastica da 50 millilitri. Contare gli organoidi al microscopio e riprernerli in BME sul ghiaccio per una concentrazione finale del 5%Aggiungere 50 microlitri della sospensione organoide in ogni piastra da 384 poggia-porsi con un distributore di liquidi per una densità di semina di 200 PDXO CR2110 per pozzo.Utilizzare il distributore digitale per aggiungere SN38 a ogni pozzo in diluizione seriale. Creare una mappa della piastra utilizzando lo strumento software del distributore digitale. I trattamenti dovrebbero includere un veicolo di controllo negativo con redditività del 100% e controllo positivo di cinque staurosporine micromolare con vitalità dello 0%.Al termine, riposizionare le piastre a 384 pozzi trattate con farmaci in un'incubatrice di 37 gradi Celsius. Sotto microscopia ottica, PDXO CR2110 mostra una tipica morfologia cistica che dimostra la somiglianza tra organoidi derivati dalla PDX e organoidi derivati dal paziente nelle stesse condizioni di coltura. L'esame istopatologico da parte della colorazione H&E rivela che le strutture tissutali e i tipi cellulari di PDXO CR2110 sono simili all'originale PDX CR2110.I confronti del profilo genomico di PDX e PDXO dimostrano una correlazione del 94,92% dell'espressione del trascritoma e una concordanza del 97,67% delle mutazioni del DNA, suggerendo una somiglianza genomica complessiva tra questa coppia di modelli. I test di sensibilità del farmaco sono stati eseguiti su PDXO CR2110 in piastre da 384 pozzi. PDXO CR2110 era sensibile all'irinotecan e resistente al cisplatino, coerente con i risultati del trattamento PDX.La coppia abbinata di modelli in vitro e in vivo può complimentarsi a vicenda per lo screening e la convalida in vitro in vivo, migliorando il tasso di successo della scoperta di farmaci e riducendo potenzialmente i tassi di attrito nello sviluppo clinico.

Research

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