Name: creating matched in vivo/in vitro patient-derived model pairs of pdx and pdx-derived organoids for cancer pharmacology research
Uploaded: 2021-05-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi e Rajendra Kumari pela leitura crítica e edição do manuscrito. Os autores também gostariam de agradecer à Crown Bioscience Oncology in vitro e equipe in vivo por seus grandes esforços técnicos.

Todos os protocolos e alterações ou procedimentos envolvendo o cuidado e o uso de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Crown Bioscience (IACUC) antes da realização dos estudos. O cuidado e o uso de animais foram realizados de acordo com a AAALAC (Associação para Avaliação e Acreditação de Cuidados Com Animais laboratoriais) Diretrizes internacionais conforme relatado no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Conselho Nacional de Pesquisa (2011...

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	<li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li><li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response.">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li><li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+erlotinib+resistance+with+tailored+treatment+regimen+in+patient-derived+xenografts+from+naive+Asian+NSCLC+patients.">Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients.</a> International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).</li><li>Li, Q. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+RNAi+library+based+on+partially+randomized+consensus+sequences+of+nuclear+receptors:+identifying+the+receptors+involved+in+amyloid+beta+degradation.">A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation.</a> Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+subset+of+gastric+cancers+with+EGFR+amplification+and+overexpression+respond+to+cetuximab+therapy.">A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy.</a> Scientific Reports. 3, 2992 (2013).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+set+of+defined+oncogenic+mutation+alleles+seems+to+better+predict+the+response+to+cetuximab+in+CRC+patient-derived+xenograft+than+KRAS+12/13+mutations.">A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations.</a> Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).</li><li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Pathology+of+Patient+Tumors,+Patient-Derived+Xenografts,+and+Cancer+Cell+Lines.">Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines.</a> Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma+Organoid+Models.">Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).</li><li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity.">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li><li>Corcoran, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+BRAF+and+MEK+Inhibition+With+Dabrafenib+and+Trametinib+in+BRAF+V600-Mutant+Colorectal+Cancer.">Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. , (2015).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li></ol>

Os dados preliminares do PDX-/PDXO-CR2110 neste relatório suportam a equivalência biológica entre pdx e seu derivado, PDXO, no que diz respeito à genômica, histopatologia e farmacologia, uma vez que ambos os modelos representam as formas da doença derivadas do CSC original do paciente. Ambos os modelos são modelos de doenças derivadas do paciente, potencialmente preditivos da resposta clínica dos pacientes10,11,12,...

Os cânceres são uma coleção de diversos distúrbios genéticos e imunológicos. O desenvolvimento bem-sucedido de tratamentos eficazes é altamente dependente de modelos experimentais que efetivamente predizem resultados clínicos. Grandes bibliotecas de xenoenxertos bem caracterizados pelo paciente (PDX) têm sido vistas há muito tempo como o sistema translacional in vivo de escolha para testar terapias de quimioterapia e/ou direcionadas devido à sua capacidade de recapitular características tumorais do paciente, heterogeneidade e resposta a medicamentos para pacientes1, permitindo assim que os ensaios clínicos do camundongo da Fase II melhorem o sucesso clínico2,3. Os PDXs são geralmente considerados como doenças cancerígenas, apresentando estabilidade genética, em contraste com os xenoenxertos derivados da linha celular2. Nas últimas décadas, grandes coleções de PDXs foram criadas em todo o mundo, tornando-se o cavalo de trabalho do desenvolvimento de medicamentos contra o câncer hoje. Embora amplamente utilizados e com grande valor translacional, esses modelos animais são intrinsecamente caros, demorados e de baixa produtividade, portanto inadequados para a triagem em larga escala. PDX também são indesejáveis para testes de imuno-oncologia (IO) devido a uma natureza imunocompensado4. Portanto, é impraticável aproveitar ao máximo a grande biblioteca disponível dos PDXs.
Descobertas recentes, pioneiras pelo laboratório Hans Clevers5,levaram ao estabelecimento de culturas in vitro de organoides gerados a partir de células-tronco adultas na maioria dos órgãos humanos de origem epitelial5. Esses protocolos foram ainda mais refinados para permitir o crescimento de organoides de CSCs assumidos em carcinomas humanos de várias indicações6,7. Estes organoides derivados do paciente (PDOs) são genomicamente estáveis8,9 e têm se mostrado altamente preditivos dos desfechos do tratamento clínico10,11,12. Além disso, a natureza in vitro dos PDOs permite a triagem de alto rendimento (HTS)13, potencialmente oferecendo uma vantagem sobre modelos in vivo e aproveitando grandes bibliotecas organoides como substituto da população paciente. Os PDOs estão prontos para se tornar uma importante plataforma de descoberta e tradução, superando as muitas limitações dos PDXs descritos acima.
Tanto o PDO quanto o PDX são modelos derivados do paciente e orientados pelo CSC, com a capacidade de avaliar terapêuticas no contexto de tratamento personalizado ou formato de ensaio clínico. As grandes bibliotecas existentes de PDXs, como a coleção proprietária de >3000 PDXs14,15,16,17, são, portanto, adequadas para a rápida geração de bibliotecas de organoides tumorais (organoides derivados do PDX, ou PDXO), resultando em uma biblioteca combinada de modelos PDX e PDXO emparelhados. Este relatório descreve o procedimento para criar e caracterizar o câncer colorretal PDXO-CR2110 em relação ao seu PDX-CR2110 parental modelo16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td>Washing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenese type II</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17101015</td>
			<td>Digest tumor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Ac</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-10C</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7076</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9145</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-38-1000</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050038</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630056</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Abmole</td>
			<td>M1817</td>
			<td>Organoid culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Screening assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTiter-Glo 3D</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9683</td>
			<td>Screening assay (luminescent ATP indicator)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multidrop dispenser</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Multidrop combi</td>
			<td>Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dispener</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>D300e</td>
			<td>Compound addition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Plate reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>2104</td>
			<td>Luminescence reading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/c nude mice</td>
			<td>Beijing HFK Bio-Technology Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>tRNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69506</td>
			<td>DNA purification kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histogel</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>Organoid embedding</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating matched in vivo/in vitro patient-derived model pairs of pdx and pdx-derived organoids for cancer pharmacology research

Os xenoenxertos tumorais derivados do paciente (PDXs) são considerados os modelos pré-clínicos mais preditivos, em grande parte acredita-se que sejam impulsionados por células-tronco cancerígenas (CSC) para avaliação convencional de medicamentos contra o câncer. Uma grande biblioteca de PDXs reflete a diversidade das populações de pacientes e, portanto, permite ensaios pré-clínicos baseados na população ("Ensaios clínicos de camundongos semelhantes à fase II"); no entanto, o PDX tem limitações práticas de baixo rendimento, custos elevados e longa duração. Os organoides tumorais, também sendo modelos derivados do CSC derivados do paciente, podem ser considerados como o equivalente in vitro do PDX, superando certas limitações de PDX para lidar com grandes bibliotecas de organoides ou compostos. Este estudo descreve um método para criar organoides derivados do PDX (PDXO), resultando assim em modelos emparelhados para pesquisa de farmacologia in vitro e in vivo. Tumores PDX-CR2110 transplantados subcutâneos foram coletados de camundongos portadores de tumor quando os tumores atingiram 200-800 mm3, por um procedimento de autópsia aprovado, seguido pela remoção dos tecidos não tumorais adjacentes e dissociação em pequenos fragmentos tumorais. Os pequenos fragmentos tumorais foram lavados e passaram por um coador de células de 100 μm para remover os detritos. Os agrupamentos celulares foram coletados e suspensos na solução de extrato de membrana do porão (BME) e banhados em uma placa de 6 poços como uma gotícula sólida com mídia líquida circundante para crescimento em uma incubadora de CO2. O crescimento organoide foi monitorado duas vezes por semana sob microscopia leve e registrado pela fotografia, seguido por variação média líquida 2 ou 3 vezes por semana. Os organoides cultivados foram ainda mais aprovados (7 dias depois) em uma proporção de 1:2, interrompendo os organoides incorporados da BME usando tesoura mecânica, auxiliados pela adição de trippsina e a adição de 10 μM Y-27632. Os organoides foram criopreservados em crio-tubos para armazenamento a longo prazo, após a liberação da BME por centrifugação, e também amostrados (por exemplo, DNA, RNA e bloco FFPE) para caracterização posterior.

Morfologia de PDXOs, típico de organoides sob microcopia leve, e consistente com pdx parental por mancha de H&E Sob microscopia leve, pdxo-CR2110 demonstra morfologia cística típica (Figura 1A),como descrito anteriormente para organoides derivados do paciente (PDO), evidências que sustentam a semelhança entre PDXO e PDO sob as mesmas condições culturais.
O exame histopatológico por manchas de H&E revela que as estruturas teciduais e os ...

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Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

Um método é descrito para criar organoides usando xenoenxertos derivados do paciente (PDX) para triagem in vitro, resultando em pares combinados de modelos in vivo/in vitro. Os tumores PDX foram colhidos/processados em pequenos pedaços mecanicamente ou enzimáticamente, seguidos pelo método dos Clevers para cultivar organoides tumorais que foram passagem, criopreservados e caracterizados contra o PDX original.

Criando pares de modelos derivados do paciente in vivo/in vitro de PDX e Organoides Derivados de PDX para pesquisa de farmacologia do câncer

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

Este protocolo pode ser usado para estabelecer uma biblioteca combinada de xenoenxertos derivados do paciente, ou PDX, e linhas organoides derivadas do paciente correspondentes. A vantagem deste método é que ele pode ser usado para criar organoides usando PDX para triagem in vitro, resultando em pares combinados de modelos in vivo/in vitro. Comece colhendo os tumores e processando o tecido conforme descrito no manuscrito do texto.Após a digestão do tecido, pipeta o tecido para cima e para baixo com uma pipeta plástica estéril de cinco mililitros. Em seguida, adicione 20 mililitros de AD+ao homogeneizar e filtre-o com um filtro de célula de 100 micrômetros. Lave o filtrado duas vezes com AD+, depois transfira-o para um tubo de plástico e centrífugue-o a 450 vezes G durante cinco minutos.Resuspend as células na BME e mantê-las no gelo. Para preparar a cultura organoide, transfira 200 microlitadores da suspensão celular para cada poço de uma placa de seis poços e incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Adicione dois mililitros de mídia organoide a cada poço e imagem o representante cai sob um microscópio.Mantenha as culturas organoides a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono com alterações médias a cada três ou quatro dias e passagem em uma proporção de um a dois a cada sete dias. Depois de dissociar os organoides, passe-os através de um filtro de 70 micrômetros em um tubo plástico de 50 mililitros. Conte os organoides sob um microscópio e resuspensá-los em BME no gelo para uma concentração final de 5%Adicione 50 microlitros da suspensão organoide em cada placa de 384 poços com um dispensador líquido para uma densidade de semeadura de 200 PDXOs CR2110 por poço.Use o distribuidor digital para adicionar SN38 a cada poço em diluição serial. Crie um mapa de placas usando a ferramenta de software do distribuidor digital. Os tratamentos devem incluir um veículo de controle negativo com 100% de viabilidade e controle positivo de cinco micromolares de Staurosporina com 0% de viabilidade.Quando terminar, coloque as placas de 384 poços tratadas de drogas de volta em incubadora de 37 graus Celsius. Sob microscopia leve, PDXO CR2110 mostra morfologia cística típica demonstrando a semelhança entre organoides derivados do PDX e organoides derivados do paciente sob as mesmas condições culturais. O exame histopatológico pela coloração da H&E revela que as estruturas teciduais e os tipos celulares do PDXO CR2110 são semelhantes ao PDX CR2110 original.Comparações genômicas de perfil de PDX e PDXO demonstram uma correlação de 94,92% da expressão transcriptome e uma concordância de 97,67% das mutações de DNA, sugerindo uma semelhança genômica global entre este par de modelos. Ensaios de sensibilidade à droga foram realizados em PDXO CR2110 em placas de 384 poços. PDXO CR2110 foi sensível à irinoteca e resistente à cisplatina, consistente com os resultados do tratamento PDX.O par combinado de modelos in vitro e in vivo pode elogiar uns aos outros pela triagem in vitro e validação in vivo, melhorando a taxa de sucesso da descoberta de medicamentos e potencialmente reduzindo as taxas de atrito no desenvolvimento clínico.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Um modelo de Xenoenxerto derivado do paciente com melanoma

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Pesquisa do câncer

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Estabelecimento de modelos de xenoenxertos derivados de câncer gástrico e linhas celulares primárias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testando terapias-alvo em câncer usando análise estrutural de alteração de DNA e xenoenxertos derivados do paciente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Ensaio in vitro de alta produtividade usando organoides tumorais derivados do paciente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Sensibilidade de perfil a terapias-alvo em organoides derivados do paciente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Geração e Cultivo de Organoides Derivados de Pacientes com Câncer de Ovário Seroso de Alto Grau

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Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Estabelecimento e Cultura de Organoides Mamários Derivados da Paciente

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizando proteínas de reparo de danos ao DNA em organoides de câncer de ovário derivados do paciente por meio de ensaios de imunofluorescência

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing

Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade

Cancer is one of the main causes of death worldwide, and the incidence of many types of cancer continues to increase. Much progress has been made in terms ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...