Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

نشكر ميشيل جودي، دكتوراه، من مجموعة إدانز (https://en-author-services.edanzgroup.com/) لتحرير مسودة لهذه المخطوطة.

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية للحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة جيتشي الطبية وتم تنفيذها وفقًا للمبادئ التوجيهية لاستخدام ورعاية الحيوانات التجريبية من دليل جامعة جيتشي الطبية للحيوانات المختبرية.
1. الجراحة الصورية
<ol><li>إعداد العناصر التال...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

البروتوكول الموصوف أعلاه مع qRT-PCR بنجاح تحديد مستويات التعبير من miRNAs المستهدفة. تقييم miRNAs المستخرجة مهم عند السعي للحصول على بيانات ذات مغزى qRT-PCR، ومن أجل تأكيد جودة miRNAs قبل تنفيذ qRT-PCR، ينبغي فحص نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى أن في 280 نانومتر مع مقياس الطيفي. إذا لم يكن بالإمكان الحصول على ...

MicroRNAs (ميرناس) - RNAs قصيرة وغير متكول التي تسبب التدهور والتثبيط النسخي من رسول RNA (مرنا)1 - وقد ثبت لتنظيم التعبير عن مختلف mRNAs التي لها أدوار حاسمة في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض (مثل، التهاب، التليف، الاضطرابات الأيضية، والسرطان). قد يكون بعض من miRNAs المرشحة المؤشرات الحيوية رواية والأهداف العلاجية لمجموعة متنوعة من الأمراض2,3,4,5. على الرغم من أن ميرنا لمحات التعبير في أجهزة الماوس والأنسجة بما في ذلك الدماغ والقلب والرئة والكبد والكلى وقد وصفت6,7,8,9,10, لم تكن هناك طرق قياسية لاستخراج وتقييم ميرناس في الماوس الكلى مع التليف الخلالي الكلوي.
لقد صممنا بروتوكولا لتنقية موثوق بها والكشف عن تعبيرات miRNAs في كلى الفئران مع التليف الخلالي الكلوي. ويتضمن البروتوكول خمس خطوات رئيسية، على النحو التالي. (1) 8 أسابيع من العمر C57BL/6 الفئران الذكور تنقسم إلى مجموعات من الفئران التي تخضع لعملية صورية (الضوابط) والفئران التي تتعرض لعملية جراحية توفير انسداد الحالب الأحادي (UUO)، والتي ترتبط التليف الخلالي الكلوي. (2) يتم استخراج عينات الكلى من الفئران صورية وUUO ، متجانسة بشكل منفصل في التجانس السيليكون ، ومن ثم نقلها إلى نظام تمزيق biopolymer على العمود تدور microcentrifuge11،12. (3) يتم استخراج مجموع الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ميرنا من عينات الكلى بواسطة عمود تدور السيليكا القائم علىغشاء 12،13. (4) باستخدام هذا RNA مجموع المستخرج، يتم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) من RNA مجموع مع استخدام النسخ العكسي، بولي (A) البوليميراز، وأوليجو دي تي التمهيدي14،15. (5) يتم تقييم تعبيرات miRNAs بواسطة الكمى عكس النسخ البوليمرات سلسلة تفاعل (qRT-PCR) باستخدام صبغة intercalating14،15.
ويستند هذا البروتوكول على التحقيقات التي حصلت على عمليات استخراج ذات مغزى وتقييمات من miRNAs في مجموعة متنوعة من الأنسجة11,12,13,14,15, ونظام biopolymer التقطيع المستخدمة في البروتوكول وقد تبين لتنقية عالية الجودة, مجموع RNA من الأنسجة في 200612. وبالإضافة إلى ذلك، أكدت الدراسات السابقة دقة وحساسية جوانب من البروتوكول (أي، التوليف cDNA مع النسخ العكسي، بولي (A) البوليميراز، وأوليجو دي تي التمهيدي من RNA مجموع المستخرجة) لتحديد التعبير ميرنا بواسطة qRT-PCR مع صبغة14،15intercalating . وبما أن البروتوكول الجديد يتمتع بمزايا البساطة وتوفير الوقت والحد من الأخطاء التقنية ، يمكن استخدام البروتوكول في الأبحاث التي تتطلب تحديد دقيق وحساس لملف ميرنا في الكلى الماوس. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق البروتوكول على التحقيقات في العديد من الحالات المرضية.
نحن بعد ذلك وصف تحديد ملامح التعبير ميرنا في الفئران مع UUO، والذي يرتبط التليف الخلالي الكلوي. في البشر، والتليف الخلالي الكلوي هو سمة مشتركة وهامة لكل من أمراض الكلى المزمنة ونهاية المرحلة مرض الكلى، بغض النظر عن المسببات16،17. ويرتبط هذا التليف الخلالي الكلوي مع تطور الفشل الكلوي، ويتميز بزيادة التعبيرات من مكونات مصفوفة خارج الخلية في المساحات الخلالية (على سبيل المثال، الكولاجين، فيبرومينكتين، والعضلات α على نحو سلس actin)17،18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNAs (miRNAs) هي واحدة الذين تقطعت بهم السبل، غير ترميز RNA الجزيئات التي تنظم عادة التعبير الجيني على مستوى ما بعد النسخ من خلال ربط لمواقع مستهدفة مكملة جزئيا في المنطقة غير المترجمة 3 '(UTR) من RNA رسول (مرنا)، مما يقلل من ترجمة الرنا والاستقرار. وقد تم التحقيق في ملامح التعبير ميرنا في مختلف الأجهزة والأنسجة من الفئران، ولكن لم تكن متاحة الأساليب القياسية لتنقية وكمية من ميرنا في الكلى الماوس. لقد أنشأنا طريقة فعالة وموثوق بها لاستخراج وتقييم التعبير ميرنا في الكلى الماوس مع التليف الخلالي الكلوي بواسطة تفاعل البوليمرات العكسية الكمية (qRT-PCR). وتطلب البروتوكول خمس خطوات: (1) إنشاء فئران العرقلة الحالبية الصورية والأحادية؛ (2) و(ج) إنشاء فئران للإعاقة الحالبانية من جانب واحد؛ (2) إنشاء فئران من نوعها؛ (2) إنشاء فئران للإعاقة الشرجية واللحالية من جانب واحد؛ (2 (2) استخراج عينات من الكلى من الفئران UUO؛ (3) استخراج RNA الكلي، الذي يشمل ميرنا، من عينات الكلى؛ (4) مكملة الحمض النووي (cDNA) التوليف مع النسخ العكسي من ميرنا؛ و (5) qRT-PCR باستخدام cDNA. باستخدام هذا البروتوكول، أكدنا بنجاح أنه بالمقارنة مع الضوابط، تم زيادة التعبير عن ميرنا-3070-3p بشكل كبير وتلك من ميرنا-7218-5p وميرنا-7219-5p انخفضت بشكل كبير في الكلى نموذج الماوس من التليف الخلالي الكلوي. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد التعبير ميرنا في كليتي الفئران مع UUO.

تم إنشاء نموذج فأر UUO عن طريق الربط الحالب اليسار كما هو موضح21 في 8 أسابيع الفئران الذكور وزنها 20-25 ز. تم عرقلة الحالب تماما من قبل الربط المزدوج مع 4-0 خياطة الحرير. تم إعطاء مسكن (ميلوكسيكام 5 ملغ / كجم ، حقن تحت الجلد) قبل الجراحة وكذلك يوميًا في اليومين اللاحقين للجراحة. في 8 أيام ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

نحن وصف طريقة لتقييم التعبير ميكرورنا في الكلى من الفئران مع انسداد الحالب الأحادي (UUO) عن طريق تفاعل البوليميراز سلسلة النسخ العكسي الكمية. هذا البروتوكول هو مناسبة لدراسة ملامح التعبير ميكرورنا الكلي في الفئران مع UUO وفي سياق الحالات المرضية الأخرى.

الكمية في الوقت الحقيقي PCR التقييم من التعبيرات ميكرورنا في الكلى الماوس مع انسداد الحالب أحادي

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

هذه الطريقة تجعل من الممكن توفير التعبير ميكروRNA في الكليات من الفئران مع مجموعة واسعة من الحالات المرضية، مثل التليف الكلوي. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمكن من تحديد صورة التعبير ميكرورنا بدقة وحساسية عالية باستخدام عملية بسيطة توفر الوقت وتمنع الخطأ التقني. لإجراء الجراحة الصورية، استخدم المقص الجراحي والملاقط لإجراء شق في الجلد في البطن وقطع العضلات والغشاء البريتوني من المثانة إلى الحافة السفلية اليسرى من الأضلاع.ترطيب اثنين من مسحات القطن مع برنامج تلفزيوني وسحب بعناية الأمعاء إلى الجانب. ضع مسحات مبللة لتحديد الكلى الأيسر والصابب. أغلق الغشاء البريتوني ثم الشق مع 4-0 النايلون.لأداء انسداد مجرى البول من جانب واحد، أو UUO، وجعل شق في الجلد في البطن وقطع العضلات والغشاء البريتوني كما هو موضح للجراحة صوري. ضع حقنة 2.5 ملليلتر تحت الماوس. ترطيب مسحتين القطن مع برنامج تلفزيوني، ثم سحب الأمعاء بعناية إلى الجانب مع ملاقط ووضع مسحات لتحديد الحالب الأيسر.استخدم الملاقط لرفع الكلية اليسرى. استخدام 4-0 الحرير لligate الحالب الأيسر في مكانين ما يقرب من سنتيمتر واحد عن بعضها البعض. قطع الحالب عند نقطة مركز الربطين ثم استخدام 4-0 خياطة النايلون لإغلاق الغشاء البريتوني والشق.بعد قطع الغشاء البريتوني ، كما ثبت من قبل ، ارفعه بالملاقط واستخدم المقص الجراحي لإجراء شق جانبي عند الحافة العليا ، ثم استمر في الشق على طول أدنى حافة من الأضلاع. تحديد الكلية اليسرى وارتجاعها مع برنامج تلفزيوني حتى تتحول الكلى الصفراء والبيضاء. إزالة الكلى عن طريق قطع الشريان الكلوي الأيسر والوريد مع مقص الجراحية ووضعها في طبق بيتري، ثم غسله بعناية مع برنامج تلفزيوني.قطع الكلى إلى ما يقرب من 10 ملليغرام عينات مع مقص الجراحية والملاقط، ووضع كل قطعة من الكلى في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر الخاصة بها وإغلاق غطاء الأنبوب. وضع عينة من الكلى في التجانس السيليكون وإضافة 700 ميكرولترات من كاشف التحلل فينيل / guanidine القائم على. اضغط ببطء وتحريف المهيج ضد العينة الكلى لتجانسها.كرر الضغط والالتواء حتى يتم حل العينة تماما في كاشف التحلل. لمزيد من تجانس العينة، نقل lysate متجانسة إلى العمود تدور بيوبولمير وتدور في 14، 000 مرات G لمدة ثلاث دقائق، ثم نقل lysate عجلت إلى أنبوب microcentrifuge غير المستخدمة 1.5 ملليلتر. الجمع بين lysate في أنبوب مع 140 ميكرولترات من الكلوروفورم وغطاء الأنبوب بإحكام.لخلط اللولب والكلوروفورم، عكس الأنبوب 15 مرة. احتضان العينات لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تدور في 12، 000 مرات G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية. دون إزعاج الترسب، نقل سوبرنات إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentuge، وإضافة 1.5 مرة حجمها من 100٪الإيثانول.دوامة الخليط لمدة خمس ثوان. قم بتحميل 700 ميكرولترات من العينة على عمود دوران راسي على الغشاء في أنبوب جمع مليلتر. أغلق غطاء العمود وقم بعمّر العمود عند 15000 مرة G لمدة 15 ثانية، ثم قم برمي الـ lysate المُعجَّل في أنبوب التجميع.غسل العينة جيدا عن طريق إضافة 700 ميكرولترات من غسل العازلة واحدة إلى عمود تدور الغشاء الراسية في أنبوب جمع مليلتر اثنين. ثم كرر الطرد المركزي ورمي بعيدا أنبوب جمع. كرر الغسيل مرتين مع 500 ميكرولترات من عازلة غسل اثنين في غسل.بعد الغسيل الأخير، تدور العمود تدور الراسية الغشاء في أنبوب جمع مليلتر اثنين في 15، 000 مرات G لمدة دقيقة واحدة ورمي بعيدا lysate عجلت. نقل العمود تدور الراسية الغشاء إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. قم بإذابة إجمالي الحمض النووي الريبي بإضافة 30 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase إلى العمود، وإغلاق غطاء العمود، وتركه لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم تدور العمود في 15، 000 مرات G لمدة دقيقة واحدة. نقل العينة التي تحتوي على مجموع RNA إلى أنبوب جديد microcentrifuge على الجليد، وقياس تركيز الجيش الملكي النيبالي الكلي بواسطة القياس الطيفي. إعداد حل مزيج رئيسي وفقا لاتجاهات المخطوطة وإضافة ثمانية ميكرولترات إلى كل أنبوب من شريط أنبوب ثمانية بئر.بعد ضبط الكثافة RNA الكلي، ضع 12 ميكرولتر aliquot من إجمالي الحمض النووي الريبي في كل أنبوب وإغلاق الغطاء. جهاز طرد مركزي الأنابيب لمدة 15 ثانية. وضع الأنابيب في الترموسكل واحتضان لهم لمدة 60 دقيقة في 37 درجة مئوية.عند الانتهاء، على الفور احتضان لهم لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية لتركيب cDNA. نقل cDNA في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر microcentuge وتمييع 10 مرات مع الماء المقطر. دوامة وطاردة مركزية الأنبوب لمدة خمس ثوان، ثم تنفيذ كمية في الوقت الحقيقي PCR، كما هو موضح في مخطوطة النص.وقد استخدم هذا البروتوكول لإنشاء نموذج أحادي الجانب انسداد مجرى البول الماوس عن طريق ربط الحالب اليسار في ثمانية أسابيع الفئران الذكور القديمة وزنها 20 إلى 25 غراما. تم عرقلة الحالب تماما من قبل الربط المزدوج مع 4-0 خياطة الحرير. تم جمع الكلى في ثمانية أيام بعد الجراحة.وأشارت بيانات ميكرورنا qRT-PCR إلى أن مستوى ميكرورنا 3070-3p قد زاد بشكل كبير وانخفضت مستويات ميكرورنا، 7218-5p وmicroRNA 7219-5p في كليتي الفئران UUO مقارنة بالضوابط. عند محاولة هذا البروتوكول، تذكر أن تكرر التواء العينة الكلوية حتى يتم حلها تماما في فينيل / guanidine القائم على كاشف التحلل لتحقيق استخراج الحمض النووي الريبي جيدة.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

دمج المطلق والنسبي البيانات الكمية PCR لتحديد STAT3 لصق النصوص البديل

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

منهجية تقديم ميكرورنا باستخدام النمط المصلي المسيطر المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة 9 لعلاج الأمراض العصبية العضلية في القوارض

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

موقع التكامل ثنائي الاتجاه للفيروسات القهقرية منهجية ير والتحليل الكمي للبيانات سير العمل

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

التحليل الكمي للربط مرناً قبل البديلة في أقسام الدماغ الماوس باستخدام الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين المقايسة

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

بروتوكول في المختبر لتقييم مستويات MicroRNA، وظائف، والجينات المستهدفة المرتبطة بها في الخلايا السرطانية

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

مؤشر تنافسي رقمي قائم على PCR لتحليل عالي الإنتاجية للياقة البدنية في السالمونيلا

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحليل بدقه وكفاءه الناسخ ميكرورنا في النباتات

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...