Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Vi takker Michelle Goody, ph.d., fra Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) for at redigere et udkast til dette manuskript.

Alle forsøgsprotokoller til dyr blev godkendt af Animal Ethics Committee of Jichi Medical University og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for anvendelse og pleje af forsøgsdyr fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Den fingerede kirurgi
<ol><li>Forbered følgende elementer: isofluran, kork ark, depilatory creme, laboratorieservietter, Petriskål med fosfat-bufferet saltvand (PBS), 4-0 nylon, pincet, kirurgisk saks, vatpinde, og 8-ugers gamle C57BL/...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

Den ovenfor beskrevne protokol med qRT-PCR har bestemt udtryksniveauerne for de målrettede miRNA'er. Vurderingen af udtrukne miRNA'er er vigtig, når man søger at opnå meningsfulde qRT-PCR-data, og for at bekræfte kvaliteten af miRNA'erne, før qRT-PCR udføres, skal absorbansforholdet ved 260 nm og ved 280 nm kontrolleres med et spektrofotometer. Hvis en enkelt PCR-forstærkning af den forventede længde og smeltetemperatur eller en monomodal smeltekurve ikke kan opnås ved qRT-PCR, kan der være DNA-kontaminering e...

MicroRNAs (miRNAs) - den korte, noncoding RNAs, der forårsager nedbrydning og transskriptionel hæmning af messenger RNA (mRNA)1 - har vist sig at regulere udtrykket af forskellige mRNAs, der har afgørende roller i både fysiologi og sygdom (f.eks betændelse, fibrose, metaboliske lidelser, og kræft). Nogle af miRNA'erne kan derfor være kandidatromanbiomarkører og terapeutiske mål for en række sygdomme2,3,4,5. Selv om miRNA udtryk profiler i mus organer og væv, herunder hjerne, hjerte, lunge, lever og nyre er blevet beskrevet6,,7,8,9,10, der har været nogen standard metoder til ekstraktion og evaluering af miRNAs i musenyr med nyre interstitiel fibrose.
Vi har designet en protokol til pålideligt at rense og opdage udtryk for miRNAs i nyrerne af mus med nyre interstitiel fibrose. Protokollen omfatter fem hovedtrin som følger. (1) 8 uger gamle C57BL/6 hanmus er opdelt i grupper af mus, der gennemgår en fingeret operation (kontrol) og mus, der udsættes for en operation, der giver ensidig ureteral obstruktion (UUO), som er forbundet med nyre interstitiel fibrose. (2) Nyreprøver udvundet af skind- og UUO-mus, homogeniseres separat i en siliciumhomogenisator og overføres derefter til et biopolymer-makuleringssystem på en mikrocentrifuges spin kolonne11,12. (3) Det samlede RNA, der indeholder miRNA, udvindes af nyreprøverne ved en silicamembranbaseret spinkolonne12,13. (4) Ved hjælp af denne ekstraherede total RNA, komplementær DNA (cDNA) er syntetiseret fra den samlede RNA med brug af omvendt transskriptionase, poly (A) polymerase, og oligo-dT primer14,15. (5) MiRNA'ernes udtryk vurderes ved hjælp af en kvantitativ polymerasekædereaktion med omvendt transskription (qRT-PCR) ved hjælp af et interkalkningsfarvestof14,15.
Denne protokol er baseret på undersøgelser , der opnåede meningsfulde ekstraktioner og evalueringer af miRNA'er i en række forskellige væv11,12,13,14,15, og det biopolymer-makuleringssystem , der anvendes i protokollen , viste sig at rense total RNA af høj kvalitet fra væv i 200612. Desuden har tidligere undersøgelser bekræftet nøjagtigheden og følsomheden af aspekter af protokollen (dvs. cDNA syntesen med omvendt transskriptionase, poly(A) polymerase, og oligo-dT primere fra ekstraheret total RNA) til bestemmelse af miRNA udtryk ved qRT-PCR med en interkalkningfarvestof 14,15. Da den nye protokol har fordelene ved enkelhed, tidsbesparende og reduktion af tekniske fejl, kan protokollen bruges i forskning, der kræver nøjagtig og følsom identifikation af miRNA-profilen i musenyrerne. Desuden kan protokollen anvendes på undersøgelser af mange patologiske forhold.
Vi beskriver derefter bestemmelsen af miRNA-udtryksprofilerne i mus med UUO, som er forbundet med nyre interstitiel fibrose. Hos mennesker, nyre interstitiel fibrose er et fælles og vigtigt træk ved både kronisk nyresygdom og slutstadiet nyresygdom, uanset deres ætiologi16,17. Denne nyre interstitiel fibrose er forbundet med progression af nyresvigt, og det er kendetegnet ved øget udtryk for ekstracellulære matrix komponenter i de interstitielle rum (f.eks kollagen, fibronectin, og α-glat muskel actin)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNAs (miRNAs) er enkeltstrengede, ikke-kodende RNA-molekyler, der typisk regulerer genekspression på post-transskriptionelt niveau ved at binde sig til delvist komplementære målsteder i 3 ' uoversat region (UTR) af messenger RNA (mRNA), hvilket reducerer mRNA's oversættelse og stabilitet. MiRNA-udtryksprofilerne i forskellige organer og væv hos mus er blevet undersøgt, men der har ikke været standardmetoder til rensning og kvantificering af miRNA i musenyren. Vi har etableret en effektiv og pålidelig metode til udvinding og evaluering af miRNA-ekspression i musenyr med nyre-interstitiel fibrose ved kvantitativ reverse-transskription polymerase kædereaktion (qRT-PCR). Protokollen krævede fem trin: (1) skabelse af falske og ensidige urinerale obstruktion (UUO) mus; 2) udvinding af nyreprøver fra UUO-musene 3) ekstraktion af total RNA, som omfatter miRNA, fra nyreprøverne 4) komplementær DNA-syntese (cDNA) med omvendt transskription fra miRNA og (5) qRT-PCR ved hjælp af cDNA. Ved hjælp af denne protokol bekræftede vi med succes, at sammenlignet med kontrollerne blev udtrykket af miRNA-3070-3p signifikant forøget, og at ekspressionen af miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p blev signifikant nedsat i nyrerne af en musemodel af nyre interstitiel fibrose. Denne protokol kan bruges til at bestemme miRNA-ekspressionen i nyrerne af mus med UUO.

En UUO musemodel blev skabt af venstre ureteral ligation som beskrevet21 i 8 uger gamle hanmus, der vejer 20-25 g. Ureters blev fuldstændig blokeret af dobbelt ligation med 4-0 silkesuturer. En smertestillende (meloxicam 5 mg/kg, subkutan injektion) blev administreret før operationen og også dagligt på 2 dage efter operationen. Efter 8 dage efter operationen blev nyrerne indsamlet, skyllet med PBS, dissekeret og opbevaret i flydende nitrogen til yderligere analyse. Sham-opererede mus fungerede...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Vi beskriver en metode til vurdering af microRNA-ekspressionen i nyrerne af mus med ensidig urinlederobstruktion (UUO) ved kvantitativ omvendt transskription polymerase kædereaktion. Denne protokol er velegnet til undersøgelse af nyre microRNA-ekspressionsprofiler i mus med UUO og i forbindelse med andre patologiske tilstande.

Kvantitativ real-time PCR evaluering af microRNA udtryk i musenyr med ensidig ureteral obstruktion

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Denne metode gør det muligt at give microRNA-ekspression i nyrer af mus med en bred vifte af patologiske tilstande, såsom nyrefibrose. Den største fordel ved denne teknik er, at det muliggør microRNA udtryk profilering med høj nøjagtighed og følsomhed ved hjælp af en simpel proces, der sparer tid og forhindrer tekniske fejl. For at udføre fingeret kirurgi, bruge kirurgisk saks og pincet til at foretage et snit i huden på maven og skære muskler og bughindemembranen fra blæren til venstre nederste kant af ribbenene.Fugt to vatpinde med PBS og træk forsigtigt tarmene til siden. Placer fugtede svaberprøver til at identificere venstre nyre og ureter. Luk bughinden og derefter snittet med 4-0 nylon.At udføre den ensidige urethral obstruktion, eller UUO, foretage et snit i huden på maven og skære muskel og bughindemembranen som påvist for fingeret kirurgi. Ansvar en 2,5 milliliter sprøjte under musen. Fugt to vatpinde med PBS, derefter trække tarmene forsigtigt til siden med pincet og placere podninger til at identificere den venstre ureter.Brug pincet til at løfte venstre nyre. Brug 4-0 silke til at late venstre ureter to steder cirka en centimeter fra hinanden. Skær ureter i midten af de to ligationer og derefter bruge 4-0 nylon suturer til at lukke bughindemembranen og indsnit.Efter at have skåret bughinden membran, som tidligere påvist, løft det med pincet og bruge kirurgisk saks til at foretage en sidelæns snit på den øverste kant, derefter fortsætte snittet langs den laveste kant af ribbenene. Identificer venstre nyre og refluks det med PBS indtil nyrerne bliver gul-hvid. Fjern nyrerne ved at skære venstre nyrearterie og vene med den kirurgiske saks og læg den i en petriskål, vask den derefter omhyggeligt med PBS.Skær nyrerne i ca 10-milligram prøver med den kirurgiske saks og pincet, sætte hvert stykke af nyrerne i sin egen 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør og lukke rørets hætte. Sæt en nyre prøve i silikone homogenis og tilsæt 700 mikroliter af en phenyl/guanidin-baserede lysis reagens. Tryk langsomt på og drej homogenisatorens støder mod nyreprøven for at homogenisere den.Presningen og vridningen gentages, indtil prøven er helt opløst i lysis-reagenset. For yderligere at homogenisere prøven overføres det homogeniserede lysat til den biopolymerspinskolon, og den drejes ved 14.000 gange G i tre minutter, hvorfra det udfældede lysat overføres til et ubrugt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Kombiner lysatet i røret med 140 mikroklitter af chloroform og hætte røret stramt.For at blande lysatet og chloroform, vende røret 15 gange. Inkuber prøverne i to til tre minutter ved stuetemperatur, drej dem derefter ved 12.000 gange G i 15 minutter ved fire grader Celsius. Uden at forstyrre bundfaldet, overføre supernatant til en ny 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør, og tilsæt 1,5 gange sit volumen på 100% ethanol.Vortex blandingen i fem sekunder. Prøvens 700 mikroliter læsses på en membranforankret spinskolonne i et opsamlingsrør med to milliliter. Luk kolonnehætten og drej kolonnen ved 15.000 gange G i 15 sekunder, og smid derefter det udfældede lysat i opsamlingsrøret.Prøven vaskes grundigt ved at tilsætte 700 mikroliter vaskebuffer en til membranens forankrede spinskolonne i et to milliliteropsamlingsrør. Gentag derefter centrifugering og smid opsamlingsrøret væk. Vasken gentages to gange med 500 mikroliter vaskepude to pr. vask.Efter den sidste vask drejes den membranforankrede spinskolonne i et 2-milliliteropsamlingsrør ved 15.000 gange G i et minut og det udfældede lysat smides væk. Overfør den membranforankrede spinkolonne til et nyt 1,5-milliliterrør. Opløs det samlede RNA ved at tilsætte 30 mikroliter RNase-frit vand til kolonnen, luk søjlehætten, og lad det blive i fem minutter ved stuetemperatur.Drej derefter kolonnen ved 15.000 gange G i et minut. Den prøve, der indeholder det samlede RNA, overføres til et nyt mikrocentrifugerør på is, og koncentrationen af det samlede RNA måles ved spektrofotometri. Forbered en master mix løsning i henhold til manuskriptet retninger og tilføje otte mikroliter til hvert rør af en otte-brønd rør strimmel.Efter justering af den samlede RNA-tæthed anbringes en 12-mikroliter aliquot af det samlede RNA i hvert rør og lukkes hætten. Centrifuge rørene i 15 sekunder. Sæt rørene i termocyren og inkuber dem i 60 minutter ved 37 grader Celsius.Når du er færdig, straks inkubere dem i fem minutter ved 95 grader Celsius for syntesen af cDNA. CDNA overføres til et nyt mikrocentrifugerør på 1,5 milliliter, og det fortyndes 10 gange med destilleret vand. Vortex og centrifuge røret i fem sekunder, derefter udføre kvantitative real-time PCR, som beskrevet i teksten manuskript.Denne protokol blev brugt til at skabe en ensidig urethral obstruktion mus model via venstre ureteral ligation i otte uger gamle mandlige mus vejer 20 til 25 gram. Ureters blev fuldstændig blokeret af dobbelt ligation med 4-0 silkesuturer. Nyrerne blev indsamlet efter otte dage efter operationen.MicroRNA qRT-PCR-dataene indikerede, at niveauet af microRNA 3070-3p blev signifikant forøget, og niveauet af microRNA, 7218-5p og microRNA 7219-5p blev nedsat i nyrerne af UUO-musene sammenlignet med kontrollerne. Når du forsøger denne protokol, skal du huske at gentage, hvordan nyreprøven vrides, indtil den er helt opløst i phenyl-/guanidinbaseret lysis-reagens for at opnå en god RNA-ekstraktion.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Fletning absolutte og relative kvantitativ PCR data at kvantificere STAT3 Splice Variant Afskrifter

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Vild type Blokering af PCR Kombineret med direkte sekventering som en yderst følsom metode til påvisning af lavfrekvent somatiske mutationer

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Påvisning af mikroRNA ekspression i peritoneal membran af rotter ved hjælp af kvantitativ real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemisk levering af mikroRNA ved hjælp af rekombinante Adeno-associeret Virus Serotype 9 til behandling af neuromuskulære sygdomme i gnavere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tovejs Retroviral Integration Site PCR Metode og Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse af transskription faktor bindende, transskription, Translation og omsætning skal vises Global begivenheder under aktivering af cellulære

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse af Alternative Pre-mRNA-Splicing i mus hjernen sektioner ved hjælp af RNA In Situ hybridisering Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

En in vitro-protokol til evaluering af MicroRNA-niveauer, funktioner og tilknyttede Målgener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digitalt PCR-baseret konkurrencemæssigt indeks til analyse af egnethed til salmonella med høj gennemløb

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

En Bioinformatik rørledning til præcist og effektivt at analysere MicroRNA Transkriptomes i planter

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...