Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Wij danken Michelle Goody, PhD, van Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript.

Alle dierlijke experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Jichi Medical University en werden uitgevoerd in overeenstemming met de Use and Care of Experimental Animals richtlijnen van de Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. De schijnoperatie
<ol><li>Bereid de volgende items: isoflurane, kurkenlak, ontharingscrème, laboratoriumdoekjes, petrischaaltje met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 4-0 nylon, pincet, chirurgische schaar,...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

Het hierboven beschreven protocol met qRT-PCR heeft met succes de expressieniveaus van de beoogde miRNAs bepaald. De beoordeling van geëxtraheerde miRNAs is belangrijk bij het verkrijgen van zinvolle qRT-PCR-gegevens, en om de kwaliteit van de miRNAs te bevestigen voordat de qRT-PCR wordt uitgevoerd, moet de absorptieverhouding van 260 nm tot die bij 280 nm worden gecontroleerd met een spectrofotometer. Als een enkele PCR-versterking van de verwachte lengte en smelttemperatuur of een monomodale smeltcurve niet kan worde...

MicroRNAs (miRNAs) — de korte, niet-coderende RNAs die de afbraak en transcriptieremming van messenger RNA (mRNA)1 veroorzaken - is aangetoond dat ze de expressie reguleren van verschillende mRNAs die een cruciale rol spelen in zowel fysiologie als ziekte (bijvoorbeeld ontsteking, fibrose, metabole stoornissen en kanker). Sommige miRNAs kunnen daarom kandidaat-nieuwe biomarkers en therapeutische doelstellingen zijn voor een verscheidenheid aan ziekten2,3,4,5. Hoewel miRNA-expressieprofielen in muisorganen en weefsels, waaronder hersenen, hart, long, lever en nieren zijn beschreven6,7,8,9,10, zijn er geen standaardmethoden voor de extractie en evaluatie van miRNAs in de muizennier met nierintermale fibrose.
We hebben een protocol ontworpen om de uitdrukkingen van miRNAs in de nieren van muizen met nierinterstitial fibrose betrouwbaar te zuiveren en te detecteren. Het protocol omvat vijf belangrijke stappen, als volgt. (1) 8 weken oude C57BL/6 mannelijke muizen zijn verdeeld in groepen muizen die een schijnoperatie ondergaan (controles) en muizen die worden onderworpen aan een operatie die eenzijdige ureterale obstructie (UUO) biedt, die verband houdt met nierinterstitial fibrose. (2) Niermonsters worden gewonnen uit de sham- en UUO-muizen, afzonderlijk gehomogeniseerd in een siliciumhomogenisator en vervolgens overgebracht naar een biopolymeerversnippersysteem op een microcentrifugespinkolom11,12. (3) Het totale RNA dat miRNA bevat, wordt uit de niermonsters gehaald door een spinkolom op basis van silicamembraan op basis van12,13. (4) Met behulp van dit totale RNA wordt aanvullend DNA (cDNA) gesynthetiseerd uit het totale RNA met behulp van reverse transcriptase, poly(A) polymerase en oligo-dT primer14,15. (5) De uitdrukkingen van miRNA's worden beoordeeld door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) met behulp van een intercalating kleurstof14,15.
Dit protocol is gebaseerd op onderzoeken die zinvolle extracties en evaluaties van miRNAs in verschillende weefsels11,12,,13,14,15, en de biopolymeer-shredder systeem gebruikt in het protocol werd aangetoond dat hoge kwaliteit, totale RNA zuiveren uit weefsels in 200612. Bovendien hebben eerdere studies de nauwkeurigheid en gevoeligheid van aspecten van het protocol bevestigd (d.w.z. de cDNA-synthese met reverse transcriptase, poly(A) polymerase en oligo-dT-primers uit geëxtraheerd totaal RNA) voor de bepaling van miRNA-expressie door qRT-PCR met een intercalating dye14,15. Aangezien het nieuwe protocol de voordelen heeft van eenvoud, tijdbesparing en het verminderen van technische fouten, kan het protocol worden gebruikt in onderzoek dat de nauwkeurige en gevoelige identificatie van het miRNA-profiel in de muisnier vereist. Bovendien zou het protocol kunnen worden toegepast op onderzoeken naar vele pathologische omstandigheden.
Vervolgens beschrijven we de bepaling van de miRNA expressieprofielen in muizen met UUO, die gekoppeld is aan nierinterstitial fibrose. Bij mensen is nierinterstitial fibrose een gemeenschappelijk en belangrijk kenmerk van zowel chronische nierziekte als eindstadium nierziekte, ongeacht hun etiologie16,17. Deze nierstitial fibrose wordt geassocieerd met de progressie van nierfalen, en het wordt gekenmerkt door verhoogde expressies van extracellulaire matrixcomponenten in de interstitiële ruimten (bijvoorbeeld collageen, fibronectine en α gladde spieractine)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNAs (miRNAs) zijn enkelstrengse, niet-coderende RNA-moleculen die doorgaans genexpressie op posttrantieniveau reguleren door zich te binden aan gedeeltelijk complementaire doellocaties in de onvertaalde regio 3 (UTR) van messenger RNA (mRNA), wat de vertaling en stabiliteit van het mRNA vermindert. De miRNA-expressieprofielen in verschillende organen en weefsels van muizen zijn onderzocht, maar standaardmethoden voor de zuivering en kwantificering van miRNA in de muizennier zijn niet beschikbaar. We hebben een effectieve en betrouwbare methode voor het extraheren en evalueren van miRNA expressie in de muis nier met nier interstitiële fibrose door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR). Het protocol vereiste vijf stappen: (1) creatie van schijn en eenzijdige ureterale obstructie (UUO) muizen; (2) extractie van niermonsters van de UUO-muizen; (3) extractie van het totale RNA, waaronder miRNA, uit de niermonsters; (4) aanvullende DNA-synthese (cDNA) met omgekeerde transcriptie van miRNA; en (5) qRT-PCR met behulp van de cDNA. Met behulp van dit protocol hebben we met succes bevestigd dat in vergelijking met de controles, de expressie van miRNA-3070-3p aanzienlijk werd verhoogd en die van miRNA-7218-5p en miRNA-7219-5p aanzienlijk zijn afgenomen in de nieren van een muismodel van nierinterstitial fibrose. Dit protocol kan worden gebruikt om de miRNA-expressie in de nieren van muizen met UUO te bepalen.

Een UUO muis model werd gemaakt door linker ureterale ligatie zoals beschreven21 in 8 weken oude mannelijke muizen met een gewicht van 20-25 g. Ureters werden volledig belemmerd door dubbele ligatie met 4-0 zijde hechtingen. Een pijnstiller (meloxicam 5 mg/kg, onderhuidse injectie) werd toegediend vóór de operatie en ook dagelijks op de 2 dagen na de operatie. Na 8 dagen na de operatie werden nieren verzameld, gespoeld met PBS, ontleed en opgeslagen in vloeibare stikstof voor verdere analyse. Sh...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

We beschrijven een methode voor het evalueren van de microRNA-expressie in de nieren van muizen met eenzijdige ureterale obstructie (UUO) door kwantitatieve reverse-transcriptie polymerase kettingreactie. Dit protocol is geschikt voor het bestuderen van niermicroRNA expressieprofielen bij muizen met UUO en in de context van andere pathologische aandoeningen.

Kwantitatieve real-time PCR-evaluatie van microRNA-expressies in muisnier met eenzijdige ureterale obstructie

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Deze methode maakt het mogelijk om microRNA expressie in nieren van muizen te voorzien van een breed scala aan pathologische aandoeningen, zoals nierfibrose. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het microRNA expressie profilering met hoge nauwkeurigheid en gevoeligheid mogelijk maakt met behulp van een eenvoudig proces dat tijd bespaart en technische fouten voorkomt. Om de schijnoperatie uit te voeren, gebruik je chirurgische schaar en pincet om een incisie in de huid in de buik te maken en snijd je de spier en het buikvlies membraan van de blaas naar de linker onderrand van de ribben.Bevochtig twee wattenstaafjes met PBS en trek voorzichtig de darmen naar de zijkant. Plaats de bevochtigde wattenstaafjes om de linkernier en ureter te identificeren. Sluit het buikvlies en vervolgens de incisie met 4-0 nylon.Om de eenzijdige urethrale obstructie uit te voeren, of UUO, maak een incisie in de huid op de buik en snijd de spier en peritoneale membraan zoals aangetoond voor de schijnoperatie. Plaats een spuit van 2,5 milliliter onder de muis. Bevochtig twee wattenstaafjes met PBS, trek de darmen voorzichtig naar de zijkant met de pincet en plaats de wattenstaafjes om de linker ureter te identificeren.Gebruik de pincet om de linker nier op te tillen. Gebruik 4-0 zijde om de linker ureter op twee plaatsen ongeveer een centimeter uit elkaar te binden. Snijd de ureter in het midden punt van de twee ligaties en gebruik vervolgens 4-0 nylon hechtingen om het buikvlies en incisie te sluiten.Na het snijden van het buikvlies, zoals eerder aangetoond, til het op met een pincet en gebruik een chirurgische schaar om een zijwaartse incisie aan de bovenrand te maken en zet u vervolgens de incisie voort langs de laagste rand van de ribben. Identificeer de linkernier en reflux het met PBS totdat de nier geel-wit wordt. Verwijder de nier door het snijden van de linker nierslagader en ader met de chirurgische schaar en plaats het in een petrischaaltje, dan was het zorgvuldig met PBS.Snijd de nier in ongeveer 10 milligram monsters met de chirurgische schaar en pincet, zet elk stuk van de nier in zijn eigen 1,5-milliliter microcentrifuge buis en sluit de buis dop. Doe een niermonster in de siliconenhomogenisator en voeg 700 microliter van een fenyl/guanidine-gebaseerde lysisreage. Druk langzaam op en draai de stamper van de homogenisator tegen het niermonster om het te homogeniseren.Herhaal het persen en draaien totdat het monster volledig is opgelost in het lysisreagens. Om het monster verder te homogeniseren, breng je het gehomogeniseerde lysaat over naar de biopolymeerspinkolom en draai je het drie minuten op 14.000 keer G en breng je het neergeslagen lysaat over naar een ongebruikte microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Combineer het lysaat in de buis met 140 microliter chloroform en doop de buis stevig vast.Om het lysaat en chloroform te mengen, moet u de buis 15 keer omkeren. Broed de monsters twee tot drie minuten bij kamertemperatuur en draai ze vervolgens gedurende 15 minuten op 12.000 g bij vier graden Celsius. Zonder het neerslag te verstoren, breng je het supernatant over op een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en voeg je 1,5 keer het volume van 100% ethanol toe.Vortex het mengsel voor vijf seconden. Laad 700 microliter van het monster op een membraange verankerde spinkolom in een opvangbuis van twee milliliter. Sluit de kolomdop en draai de kolom op 15.000 keer G gedurende 15 seconden en gooi het neergeslagen lysaat in de opvangbuis weg.Was het monster grondig door 700 microliter wasbuffer één toe te voegen aan de membraanverank in een opvangbuis van twee milliliter. Herhaal vervolgens de centrifugatie en gooi de opvangbuis weg. Herhaal de was twee keer met 500 microliters wasbuffer twee per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt draai je de membraanverank in een verzamelbuis van twee milliliter op 15.000 keer G gedurende een minuut en gooi je het neergeslagen lysaat weg. Breng de membraanverank naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Los het totale RNA op door 30 microliter RNase-vrij water aan de kolom toe te voegen, sluit de kolomdop en laat het vijf minuten op kamertemperatuur.Draai de kolom vervolgens op 15.000 keer G gedurende een minuut. Breng het monster met totaal RNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis op ijs en meet de concentratie van het totale RNA door spectrofotometrie. Bereid een master mix oplossing volgens het manuscript richtingen en voeg acht microliters aan elke buis van een acht-goed buis strip.Na het aanpassen van de totale RNA-dichtheid, plaats een 12-microliter aliquot van de totale RNA in elke buis en sluit de dop. Centrifuge de buizen gedurende 15 seconden. Leg de buizen in de thermocycler en broed ze 60 minuten uit bij 37 graden Celsius.Wanneer u klaar bent, onmiddellijk uitbroed ze gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius voor de synthese van cDNA. Breng de cDNA in een nieuwe 1,5-milliliter microcentrifugebuis en verdun het 10 keer met gedestilleerd water. Vortex en centrifugeren de buis gedurende vijf seconden en voeren vervolgens kwantitatieve real-time PCR uit, zoals beschreven in het tekstmanuscript.Dit protocol werd gebruikt om een eenzijdige urethrale obstructie muis model te creëren via linker ureterale ligatie in acht weken oude mannelijke muizen met een gewicht van 20 tot 25 gram. Ureters werden volledig belemmerd door dubbele ligatie met 4-0 zijde hechtingen. Nieren werden verzameld op acht dagen na de operatie.De microRNA qRT-PCR gegevens gaven aan dat het niveau van microRNA 3070-3p aanzienlijk werd verhoogd en de niveaus van microRNA, 7218-5p en microRNA 7219-5p werden verminderd in de nieren van de UUO muizen in vergelijking met de controles. Bij een poging van dit protocol, vergeet niet te herhalen draaien van de nier monster totdat het volledig is opgelost in fenyl / guanidine-gebaseerde lysis reagens om een goede RNA extractie te bereiken.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Het samenvoegen van absolute en relatieve kwantitatieve PCR gegevens te kwantificeren STAT3 Splice Variant Afschriften

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-blokkering van PCR In combinatie met Direct Sequencing als een zeer gevoelige detectiemethode voor Low-Frequency somatische mutaties

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemische levering van MicroRNA met behulp van Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 voor de behandeling van neuromusculaire ziekten bij knaagdieren

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tweerichtings retrovirale integratie site PCR methodologie en kwantitatieve data analyse werkstroom

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kwantitatieve analyse van alternatieve Pre-mRNA-Splicing in muis hersenen secties met behulp van RNA In Situ hybridisatie Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Een in vitro protocol voor het evalueren van MicroRNA-niveaus, functies en geassocieerde doel genen in tumor cellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Een bioinformatica-pijpleiding om de MicroRNA Transcriptomes in fabrieken nauwkeurig en efficiënt te analyseren

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...