Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Nous remercions Michelle Goody, Ph.D., du Groupe Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) d’avoir édité une ébauche de ce manuscrit.

Tous les protocoles expérimentaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité d’éthique animale de l’Université médicale de Jichi et ont été exécutés conformément aux lignes directrices sur l’utilisation et le soin des animaux expérimentaux du Guide de l’Université médicale Jichi pour les animaux de laboratoire.
1. La chirurgie simulée
<ol><li>Préparer les articles suivants : isoflurane, feuille de liège, crème dépilatoire, lingettes de laboratoire, plat Petr...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. 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M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. 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Le protocole décrit ci-dessus avec qRT-PCR a réussi à déterminer les niveaux d’expression des miARN ciblés. L’évaluation des miARN extraits est importante lorsqu’on cherche à obtenir des données qRT-PCR significatives, et afin de confirmer la qualité des miARN avant d’effectuer le qRT-PCR, le rapport d’absorption à 260 nm à celui de 280 nm doit être vérifié avec un spectrophotomètre. Si une seule amplification pcr de la longueur prévue et de la température de fusion ou une courbe de fusion mono...

Il a été démontré que les microARN (miARN) — les ARN courts et non coodants qui causent la dégradation et l’inhibition transcriptionnelle de l’ARN messager (ARNm)1 — régulent l’expression de divers ARNm qui jouent un rôle crucial dans la physiologie et la maladie (p. ex., inflammation, fibrose, troubles métaboliques et cancer). Certains des miARN peuvent donc être candidats de nouveaux biomarqueurs et cibles thérapeutiques pour une variété de maladies2,3,4,5. Bien que les profils d’expression miRNA dans les organes et les tissus de souris, y compris le cerveau, le cœur, le poumon, le foie, et les reins ont été décrits6,7,8,9,10, il n’y a eu aucune méthode standard pour l’extraction et l’évaluation des miARN dans le rein de souris avec la fibrose interstitielle rénale.
Nous avons conçu un protocole pour purifier et détecter de manière fiable les expressions des miARN dans les reins des souris atteintes de fibrose interstitielle rénale. Le protocole comporte cinq étapes principales, comme suit. (1) Les souris mâles C57BL/6 de 8 semaines sont divisées en groupes de souris qui subissent une opération simulée (contrôles) et de souris qui sont soumises à une chirurgie fournissant l’obstruction uréterale unilatérale (UUO), qui est liée à la fibrose interstitielle rénale. (2) Les échantillons de rein sont extraits de la fausse et des souris UUO, homogénéisés séparément dans un homogénéisant de silicium, puis transférés à un système de biopolymère-déchiquetage sur une colonne de spin microcentrifuge11,12. (3) L’ARN total contenant du miARN est extrait des échantillons de rein par une colonne de spin à base de membrane de silice12,13. (4) À l’aide de cet ARN total extrait, l’ADN complémentaire (ADNC) est synthétisé à partir de l’ARN total avec l’utilisation de la transcriptase inverse, de la polymérase(A) et de l’amorce oligo-dT14,15. (5) Les expressions des miARN sont évaluées par réaction quantitative en chaîne de polymérase à transcription inverse (qRT-PCR) à l’aide d’un colorant intercalé14,15.
Ce protocole est basé sur des enquêtes qui ont obtenu des extractions significatives et des évaluations de miARN dans une variété de tissus11,12,13,14,15, et le système de biopolymère-déchiquetage utilisé dans le protocole a été montré pour purifier de haute qualité, ARN total des tissus en 200612. En outre, des études antérieures ont confirmé l’exactitude et la sensibilité des aspects du protocole (c.-à-d. la synthèse de l’ADC avec la transcriptase inverse, la polymérase polymérase, et les amorces oligo-dT de l’ARN total extrait) pour la détermination de l’expression miRNA par qRT-PCR avec un colorant intercalant14,15. Puisque le nouveau protocole a les avantages de la simplicité, de l’économie de temps, et la réduction des erreurs techniques, le protocole peut être utilisé dans la recherche qui nécessite l’identification précise et sensible du profil miRNA dans le rein de souris. En outre, le protocole pourrait être appliqué aux investigations de beaucoup de conditions pathologiques.
Nous décrivons ensuite la détermination des profils d’expression de miRNA chez les souris avec UUO, qui est lié à la fibrose interstitielle rénale. Chez l’homme, la fibrose interstitielle rénale est une caractéristique commune et importante de la maladie rénale chronique et de la maladie rénale terminale, indépendamment de leur étiologie16,17. Cette fibrose interstitielle rénale est associée à la progression de l’insuffisance rénale, et elle se caractérise par une augmentation des expressions des composants de matrice extracellulaire dans les espaces interstitiels (p. ex., collagène, fibronectine et actine musculaire lisse α)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

Les microARN (miARN) sont des molécules d’ARN uniques et non codantes qui régulent généralement l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel en se liant à des sites cibles partiellement complémentaires dans la région non traduite (UTR) de l’ARN messager (ARNm) 3', ce qui réduit la traduction et la stabilité de l’ARNm. Les profils d’expression miRNA dans divers organes et tissus de souris ont été étudiés, mais les méthodes standard pour la purification et la quantification du miRNA dans le rein de souris n’ont pas été disponibles. Nous avons établi une méthode efficace et fiable pour extraire et évaluer l’expression de miRNA dans le rein de souris avec la fibrose interstitielle rénale par la réaction quantitative de la polymérase de transcription inverse (qRT-PCR). Le protocole exigeait cinq étapes : (1) la création de souris d’obstruction uterérale et unilatérales ( UUO); (2) l’extraction d’échantillons de rein sur les souris UUO; (3) l’extraction de l’ARN total, qui comprend le miARN, à partir des échantillons de rein; (4) synthèse complémentaire de l’ADN (ADC) avec transcription inversée du miARN; et (5) qRT-PCR à l’aide de l’ADD. En utilisant ce protocole, nous avons confirmé avec succès que par rapport aux contrôles, l’expression de miRNA-3070-3p a été significativement augmentée et ceux de miRNA-7218-5p et miRNA-7219-5p ont été significativement diminués dans les reins d’un modèle de souris de la fibrose interstitielle rénale. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer l’expression miRNA dans les reins des souris avec UUO.

Un modèle de souris UUO a été créé par la ligature uretérale gauche comme décrit21 chez les souris mâles de 8 semaines pesant 20–25 g. Les Uréters ont été complètement obstrués par la double ligature avec des sutures de soie 4-0. Un analgésique (meloxicam 5 mg/kg, injection sous-cutanée) a été administré avant la chirurgie et aussi tous les jours sur les 2 jours après la chirurgie. À 8 jours après la chirurgie, les reins ont été recueillis, rincés avec PBS, disséqués, e...

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Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Nous décrivons une méthode pour évaluer l’expression de microARN dans les reins des souris avec l’obstruction ureterale unilatérale (UUO) par la réaction quantitative de la chaîne de transcription inverse-polymérase. Ce protocole convient pour étudier les profils d’expression de microARN de rein chez les souris avec UUO et dans le contexte d’autres conditions pathologiques.

Évaluation quantitative en temps réel du PCR des expressions microARN dans le rein de souris avec obstruction urérale unilatérale

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Cette méthode permet de fournir l’expression de microARN dans les reins des souris avec un large éventail de conditions pathologiques, telles que la fibrose rénale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet le profilage d’expression microARN avec une grande précision et sensibilité en utilisant un processus simple qui permet de gagner du temps et d’éviter les erreurs techniques. Pour effectuer la chirurgie simulée, utilisez des ciseaux chirurgicaux et des pinces à épiler pour faire une incision dans la peau à l’abdomen et couper le muscle et la membrane péritonéale de la vessie au bord inférieur gauche des côtes.Humidifier deux cotons-tiges avec PBS et tirer soigneusement les intestins sur le côté. Placez les écouvillons humidifiés pour identifier le rein gauche et l’uretrée. Fermer la membrane péritonéale, puis l’incision avec du nylon 4-0.Pour effectuer l’obstruction urétrale unilatérale, ou UUO, faire une incision dans la peau à l’abdomen et couper le muscle et la membrane péritonéale comme démontré pour la chirurgie simulée. Placez une seringue de 2,5 millilitres sous la souris. Humidifiez deux cotons-tiges avec du PBS, puis tirez soigneusement les intestins sur le côté avec les pinces et placez les écouvillons pour identifier l’uretères gauche.Utilisez la pince à épiler pour soulever le rein gauche. Utilisez de la soie 4-0 pour ligate l’uretier gauche à deux endroits à environ un centimètre l’un de l’autre. Couper l’uretère au point central des deux ligatures, puis utiliser des sutures de nylon 4-0 pour fermer la membrane péritonéale et l’incision.Après avoir coupé la membrane péritonéale, comme démontré précédemment, soulevez-la avec des pinces à épiler et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision latérale au bord supérieur, puis continuez l’incision le long du bord le plus bas des côtes. Identifiez le rein gauche et reflux avec PBS jusqu’à ce que le rein devient jaune-blanc. Retirez le rein en coupant l’artère rénale gauche et la veine avec les ciseaux chirurgicaux et placez-le dans une boîte de Pétri, puis lavez-le soigneusement avec PBS.Couper le rein en échantillons d’environ 10 milligrammes avec les ciseaux chirurgicaux et les pinces à épiler, mettre chaque morceau du rein dans son propre tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et fermer le bouchon du tube. Mettre un échantillon de rein dans l’homogénéiseur en silicone et ajouter 700 microlitres d’un phényle / guanidine à base de lyse reagent. Appuyez lentement et tordez le pilon de l’homogénéisateur contre l’échantillon rénal pour l’homogénéiser.Répétez le pressage et la torsion jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement dissous dans le reagent de lyse. Pour homogénéiser davantage l’échantillon, transférez le lysate homogénéisé à la colonne de spin biopolymère et tournez-le à 14 000 fois G pendant trois minutes, puis transférez le lysate précipité dans un tube de microcentrifugeuse inutilisé de 1,5 millilitre. Mélanger le lysate dans le tube avec 140 microlitres de chloroforme et bien capifier le tube.Pour mélanger le lysate et le chloroforme, inverser le tube 15 fois. Incuber les échantillons pendant deux à trois minutes à température ambiante, puis les faire tourner à 12 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Sans perturber le précipité, transférez le supernatant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et ajoutez 1,5 fois son volume de 100 % d’éthanol.Vortex le mélange pendant cinq secondes. Chargez 700 microlitres de l’échantillon sur une colonne de spin à ancrage membranaire dans un tube de collecte de deux millilitres. Fermez le capuchon de colonne et faites tourner la colonne à 15 000 fois G pendant 15 secondes, puis jetez le lysate précipité dans le tube de collecte.Lavez soigneusement l’échantillon en ajoutant 700 microlitres de tampon de lavage un à la colonne de spin ancré par membrane dans un tube de collecte de deux millilitres. Répétez ensuite la centrifugation et jetez le tube de collecte. Répétez le lavage deux fois avec 500 microlitres de tampon de lavage deux par lavage.Après le dernier lavage, faites tourner la colonne de spin ancrée dans un tube de collecte de deux millilitres à 15 000 fois G pendant une minute et jetez le lysate précipité. Transférer la colonne de spin ancré par membrane dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Dissoudre l’ARN total en ajoutant 30 microlitres d’eau sans RNase à la colonne, fermer le bouchon de colonne et le laisser pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, faites tourner la colonne à 15 000 fois G pendant une minute. Transférer l’échantillon contenant l’ARN total dans un nouveau tube de microcentrifugeuse sur la glace et mesurer la concentration totale d’ARN par spectrophotométrie. Préparez une solution de mélange maître selon les instructions manuscrites et ajoutez huit microlitres à chaque tube d’une bande de tube de huit puits.Après ajustement de la densité totale de l’ARN, placez un aliquot de 12 microlitres d’ARN total dans chaque tube et fermez le bouchon. Centrifuger les tubes pendant 15 secondes. Mettez les tubes dans le thermocycleur et incubez-les pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius.Une fois terminés, incubez-les immédiatement pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius pour la synthèse de l’ADN. Transférer l’ADRC dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et le diluer 10 fois avec de l’eau distillée. Vortex et centrifugeuse du tube pendant cinq secondes, puis effectuer quantitative en temps réel PCR, tel que décrit dans le manuscrit du texte.Ce protocole a été employé pour créer un modèle unilatéral de souris d’obstruction urétrale par ligature urétrale gauche dans les souris mâles de huit semaines pesant 20 à 25 grammes. Les uretères ont été complètement obstrués par la double ligature avec des sutures de soie 4-0. Des reins ont été rassemblés à huit jours après chirurgie.Les données qRT-PCR de microARN ont indiqué que le niveau de microARN 3070-3p a été sensiblement augmenté et les niveaux de microARN, 7218-5p et microARN 7219-5p ont été diminués dans les reins des souris d’UUO comparées aux contrôles. Lorsque vous essayez ce protocole, n’oubliez pas de répéter la torsion de l’échantillon de rein jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous dans le reagent de lyse à base de phényle/guanidine pour obtenir une bonne extraction d’ARN.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

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Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Recherche

Génétique

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Détection de l&#39;expression de microARN dans la membrane peritoneale des rats en utilisant une PCR quantitative en temps réel

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Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Délivrance systémique des micro-ARN, à l’aide de Recombinant Adeno-associated Virus sérotype 9 pour traiter des maladies neuromusculaires chez les rongeurs

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Site d&#39;intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse en temps réel du facteur de Transcription Binding, Transcription, traduction et chiffre d’affaires pour afficher des événements mondiaux au cours de l’Activation cellulaire

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Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

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Analyse quantitative de l’épissage alternatif pré-ARNm dans les Sections de cerveau de souris à l’aide de RNA essai In Situ hybridation avec

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Un protocole in vitro pour évaluer les niveaux de microARN, les fonctions et les gènes cibles associés dans les cellules tumorales

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Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

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A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

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