Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Wir danken Michelle Goody, PhD, von der Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.

Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Animal Ethics Committee der Jichi Medical University genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren des Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals durchgeführt.
1. Die Scheinoperation
<ol><li>Bereiten Sie folgende Artikel vor: Isofluran, Korkblatt, Enthaarungscreme, Labortücher, Petrischale mit phosphatgepufferter Saline (PBS), 4-0 Nylon, Pinzette, chirurgische Schere, Wattestäbc...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. 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M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. 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Das oben beschriebene Protokoll mit qRT-PCR hat erfolgreich die Expressionsebenen der zielgerichteten miRNAs bestimmt. Die Bewertung der extrahierten miRNAs ist wichtig, wenn man sinnvolle qRT-PCR-Daten erhalten möchte, und um die Qualität der miRNAs vor der Durchführung der qRT-PCR zu bestätigen, sollte das Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu dem bei 280 nm mit einem Spektralphotometer überprüft werden. Wenn eine einzelne PCR-Verstärkung der erwarteten Länge und Schmelztemperatur oder eine monomodale Schmel...

MicroRNAs (miRNAs) – die kurzen, nicht kodierenden RNAs, die den Abbau und die transkriptionelle Hemmung von Boten-RNA (mRNA)1 verursachen – regulieren nachweislich die Expression verschiedener mRNAs, die sowohl in der Physiologie als auch bei Krankheiten eine entscheidende Rolle spielen (z. B. Entzündungen, Fibrose, Stoffwechselstörungen und Krebs). Einige der miRNAs können daher Kandidaten neuartige Biomarker und therapeutische Ziele für eine Vielzahl von Krankheiten2,3,4,5. Obwohl miRNA-Expressionsprofile in Mausorganen und Geweben einschließlich Gehirn, Herz, Lunge, Leber und Niere beschrieben wurden6,7,8,9,10, gab es keine Standardmethoden für die Extraktion und Bewertung von miRNAs in der Mausniere mit renaler interstitielle Fibrose.
Wir haben ein Protokoll entwickelt, um die Ausdrücke von miRNAs in den Nieren von Mäusen mit renaler interstitielle Fibrose zuverlässig zu reinigen und zu detektieren. Das Protokoll umfasst fünf Hauptschritte, wie folgt. (1) 8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden in Gruppen von Mäusen eingeteilt, die einer Scheinoperation (Kontrollen) unterzogen werden, und Mäusen, die einer Operation unterzogen werden, die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) bietet, die mit renaler interstitielle Fibrose verbunden ist. (2) Nierenproben werden aus den Schein- und UUO-Mäusen extrahiert, in einem Siliziumhomogenisator getrennt homogenisiert und dann auf eine Mikrozentrifugen-Spin-Säule11,12in ein Biopolymer-Zerkleinerungssystem übertragen. (3) Die gesamte RNA, die miRNA enthält, wird aus den Nierenproben durch eine Kieselsäuremembran-basierte Spinsäule12,13extrahiert. (4) Mit Dieser extrahierten Gesamt-RNA wird komplementäre DNA (cDNA) aus der gesamten RNA unter Verwendung von Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primer14,15synthetisiert. (5) Die Ausdrücke von miRNAs werden durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) mit einem interkalierenden Farbstoff14,15ausgewertet.
Dieses Protokoll basiert auf Untersuchungen, die sinnvolle Extraktionen und Auswertungen von miRNAs in einer Vielzahl von Geweben erhaltenhaben 11,12,13,14,15, und das im Protokoll verwendete Biopolymer-Zerkleinerungssystem wurde 2006 nachweislich hochwertige, gesamte RNA aus Geweben gereinigt12. Darüber hinaus haben frühere Studien die Genauigkeit und Empfindlichkeit von Aspekten des Protokolls (d. h. der cDNA-Synthese mit Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primern aus extrahierter Gesamt-RNA) zur Bestimmung der miRNA-Expression durch qRT-PCR mit einem interkalierenden Farbstoff14,15bestätigt. Da das neue Protokoll die Vorteile der Einfachheit, Zeitersparnis und Reduzierung von technischen Fehlern hat, kann das Protokoll in der Forschung verwendet werden, die eine genaue und sensible Identifizierung des miRNA-Profils in der Mausniere erfordert. Darüber hinaus könnte das Protokoll auf Untersuchungen unter vielen pathologischen Bedingungen angewendet werden.
Als nächstes beschreiben wir die Bestimmung der miRNA-Expressionsprofile bei Mäusen mit UUO, die mit renaler interstitielle Fibrose verbunden ist. Beim Menschen, renale interstitielle Fibrose ist ein häufiges und wichtiges Merkmal sowohl der chronischen Nierenerkrankung und im Endstadium Nierenerkrankungen, unabhängig von ihrer Ätiologie16,17. Diese renale interstitielle Fibrose ist mit dem Fortschreiten des Nierenversagens verbunden und zeichnet sich durch erhöhte Ausdrücke extrazellulärer Matrixkomponenten in den interstitiellen Räumen (z.B. Kollagen, Fibronectin und α-glatten Muskelakt)17,18aus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNAs (miRNAs) sind einsträngige, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die typischerweise die Genexpression auf posttranskriptionaler Ebene regulieren, indem sie an teilweise komplementäre Zielstandorte in der 3' unübersetzten Region (UTR) von Messenger RNA (mRNA) binden, was die Translation und Stabilität der mRNA reduziert. Die miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen Organen und Geweben von Mäusen wurden untersucht, standardmethoden zur Reinigung und Quantifizierung von miRNA in der Mausniere waren jedoch nicht verfügbar. Wir haben eine effektive und zuverlässige Methode zur Extraktion und Bewertung der miRNA-Expression in der Mausniere mit renaler interstitielle Fibrose durch quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) etabliert. Das Protokoll erforderte fünf Schritte: (1) Schaffung von Schein- und einseitigen Harnleiter-Obstruktions-Mäusen (UUO); (2) Extraktion von Nierenproben von den UUO-Mäusen; (3) Extraktion der gesamten RNA, einschließlich miRNA, aus den Nierenproben; (4) komplementäre DNA-Synthese (cDNA) mit umgekehrter Transkription aus miRNA; und (5) qRT-PCR mit dem cDNA. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich bestätigt, dass im Vergleich zu den Kontrollen die Expression von miRNA-3070-3p signifikant erhöht wurde und die von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p signifikant in den Nieren eines Mausmodells der renalen interstitiellen Fibrose verringert wurden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die miRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit UUO zu bestimmen.

Ein UUO-Mausmodell wurde durch linke Harnleiterligation erstellt, wie21 in 8 Wochen alten männlichen Mäusen mit einem Gewicht von 20–25 g beschrieben. Ureters wurden durch Doppelligation mit 4:0 Seidennähten völlig behindert. Ein Schmerzmittel (Meloxicam 5 mg/kg, subkutane Injektion) wurde vor der Operation und auch täglich an den 2 Tagen nach der Operation verabreicht. Nach 8 Tagen nach der Operation wurden Nieren gesammelt, mit PBS abgerinnen, seziert und zur weiteren Analyse in flüssige...

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Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der microRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit einseitiger Harnleiterobstruktion (UUO) durch quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion. Dieses Protokoll eignet sich zur Untersuchung von Nieren-MicroRNA-Expressionsprofilen bei Mäusen mit UUO und im Kontext anderer pathologischer Erkrankungen.

Quantitative Echtzeit-PCR-Bewertung von microRNA-Expressions in der Mausniere mit einseitiger ureteraler Obstruktion

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Diese Methode ermöglicht es, microRNA-Expression in Nieren von Mäusen mit einer breiten Palette von pathologischen Bedingungen, wie Nierenfibrose zu bieten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie microRNA-Expressionsprofilierung mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit ermöglicht, indem ein einfacher Prozess verwendet wird, der Zeit spart und technische Fehler verhindert. Um die Scheinoperation durchzuführen, verwenden Sie chirurgische Schere und Pinzette, um einen Schnitt in der Haut am Bauch zu machen und schneiden Sie den Muskel und die Peritonealmembran von der Blase bis zum linken unteren Rand der Rippen.Befeuchten Sie zwei Wattestäbchen mit PBS und ziehen Sie vorsichtig den Darm zur Seite. Legen Sie die befeuchteten Tupfer, um die linke Niere und Harnleiter zu identifizieren. Schließen Sie die Peritonealmembran und dann den Einschnitt mit 4-0 Nylon.Um die einseitige Harnröhre Obstruktion durchzuführen, oder UUO, machen einen Schnitt in der Haut am Bauch und schneiden Sie den Muskel und peritoneale Membran, wie für die Scheinchirurgie gezeigt. Legen Sie eine 2,5-Milliliter-Spritze unter die Maus. Befeuchten Sie zwei Wattestäbchen mit PBS, ziehen Sie dann den Darm vorsichtig zur Seite mit der Pinzette und legen Sie die Tupfer, um den linken Harnleiter zu identifizieren.Verwenden Sie die Pinzette, um die linke Niere zu heben. Verwenden Sie 4-0 Seide, um den linken Harnleiter an zwei Stellen etwa einen Zentimeter voneinander entfernt zu ligieren. Schneiden Sie den Harnleiter am Mittelpunkt der beiden Ligationen und verwenden Sie dann 4-0 Nylon Nähte, um die Peritonealmembran und Denkholz zu schließen.Nach dem Schneiden der Peritonealmembran, wie zuvor gezeigt, heben Sie sie mit einer Pinzette an und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen seitlichen Schnitt an der oberen Kante zu machen, und setzen Sie dann den Schnitt entlang der untersten Kante der Rippen fort. Identifizieren Sie die linke Niere und refluxen Sie sie mit PBS, bis die Niere gelb-weiß wird. Entfernen Sie die Niere, indem Sie die linke Nierenarterie und Vene mit der chirurgischen Schere schneiden und in eine Petrischale legen, dann waschen Sie sie sorgfältig mit PBS.Schneiden Sie die Niere mit der chirurgischen Schere und Pinzette in etwa 10-Milligramm-Proben, legen Sie jedes Stück der Niere in ein eigenes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und schließen Sie die Kappe des Rohres. Eine Nierenprobe in den Silikonhomogenisator geben und 700 Mikroliter eines Phenyl-/Guanidin-basierten Lysereagenz hinzufügen. Drücken und drehen Sie den Stößel des Homogenisators langsam gegen die Nierenprobe, um sie zu homogenisieren.Wiederholen Sie das Pressen und Verdrehen, bis die Probe vollständig im Lysereagegelöst ist. Um die Probe weiter zu homogenisieren, übertragen Sie das homogenisierte Lysat auf die Biopolymer-Spin-Säule und drehen Sie es drei Minuten lang bei 14.000-fachem G, und übertragen Sie dann das ausgefällte Lysat in ein ungenutztes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Kombinieren Sie das Lysat in der Röhre mit 140 Mikroliter Chloroform und kappen Sie das Rohr fest.Um das Lysat und Chloroform zu mischen, das Rohr 15 Mal invertieren. Inkubieren Sie die Proben für zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur, dann drehen Sie sie bei 12.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Ohne den Niederschlag zu stören, übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und fügen Sie das 1,5-fache seines Volumens von 100% Ethanol hinzu.Wirbel die Mischung für fünf Sekunden. 700 Mikroliter der Probe in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr auf eine membranverankerte Spinsäule laden. Schließen Sie die Säulenkappe und drehen Sie die Spalte 15 Sekunden lang bei 15.000 Mal G, und werfen Sie dann das ausgefällte Lysat im Sammelrohr weg.Waschen Sie die Probe gründlich, indem Sie 700 Mikroliter Waschpuffer eins zur membranverankerten Spinsäule in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr hinzufügen. Wiederholen Sie dann die Zentrifugation und werfen Sie das Sammelrohr weg. Wiederholen Sie die Wäsche zweimal mit 500 Mikroliter Waschpuffer zwei pro Wäsche.Nach der letzten Wäsche die membranverankerte Spinsäule in einem Zwei-Milliliter-Sammelrohr bei 15.000 mal G für eine Minute drehen und das gefällte Lysat wegwerfen. Übertragen Sie die membranverankerte Spinsäule in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Lösen Sie die gesamte RNA auf, indem Sie der Säule 30 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzufügen, die Säulenkappe schließen und bei Raumtemperatur fünf Minuten lang lassen.Drehen Sie dann die Spalte bei 15.000 mal G für eine Minute. Übertragen Sie die Probe mit der gesamten RNA auf eine neue Mikrozentrifugenröhre auf Eis und messen Sie die Konzentration der gesamten RNA durch Spektrophotometrie. Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung entsprechend den Manuskriptrichtungen vor und fügen Sie acht Mikroliter zu jedem Rohr eines Acht-Well-Rohrstreifens hinzu.Nach der Anpassung der gesamten RNA-Dichte legen Sie ein 12-Mikroliter-Aliquot der gesamten RNA in jede Röhre und schließen Sie die Kappe. Zentrifugieren Sie die Rohre für 15 Sekunden. Legen Sie die Schläuche in den Thermocycler und inkubieren Sie sie für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.Wenn fertig, sofort inkubieren sie für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius für die Synthese von cDNA. Übertragen Sie die cDNA in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr und verdünnen Sie sie 10-mal mit destilliertem Wasser. Wirbel und Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Sekunden, dann führen quantitative Echtzeit-PCR, wie in der Texthandschrift beschrieben.Dieses Protokoll wurde verwendet, um ein einseitiges Urethral-Obstruktions-Maus-Modell über linke Ureteralligation in acht Wochen alten männlichen Mäusen mit einem Gewicht von 20 bis 25 Gramm zu erstellen. Ureters wurden durch Doppelligation mit 4:0 Seidennähten völlig behindert. Die Nieren wurden acht Tage nach der Operation gesammelt.Die microRNA qRT-PCR-Daten zeigten, dass der Gehalt an microRNA 3070-3p signifikant erhöht war und die Konzentrationen von microRNA, 7218-5p und microRNA 7219-5p in den Nieren der UUO-Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen verringert wurden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, die Verdrehung der Nierenprobe zu wiederholen, bis sie vollständig in Phenyl/Guanidin-basiertem Lysereage gelöst ist, um eine gute RNA-Extraktion zu erreichen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Merging Absolute und relative quantitative PCR-Daten zu Quantifizieren STAT3 Spleißvariante Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Forschung

Genetik

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wildtyp-Blockierung PCR mit direkter Sequenzierung als hochempfindliche Methode Kombiniert zum Nachweis von Low-Frequency somatischer Mutationen

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemische Lieferung von MicroRNA mit rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 9 zur Behandlung von neuromuskulärer Erkrankungen bei Nagern

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Bidirektionale Retrovirale Integrationsstelle PCR Methodik und quantitative Datenanalyse Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Ein In-Vitro-Protokoll zur Bewertung von MicroRNA-Spiegeln, -Funktionen und assoziierten Zielgenen in Tumorzellen

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Eine Bioinformatik-Pipeline zur genauen und effizienten Analyse der MicroRNA-Transkriptome in Pflanzen

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...