Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

אנו מודים למישל גודי, PhD, מ-Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) על עריכת טיוטה של כתב יד זה.

כל הפרוטוקולים הניסיוניים של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ובוצעו בהתאם להנחיות השימוש והטיפול בבעלי חיים ניסיוניים ממדריך האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לבעלי חיים במעבדה.
1. הניתוח המזויפ
<ol><li>הכינו את הפריטים הבאים: isoflurane, סדין...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

הפרוטוקול שתואר לעיל עם qRT-PCR קבע בהצלחה את רמות הביטוי של miRNAs המיועדים. ההערכה של miRNAs שחולצו חשובה כאשר מבקשים להשיג נתוני qRT-PCR משמעותיים, ועל מנת לאשר את איכות miRNAs לפני ביצוע qRT-PCR, היחס של ספיגה ב 260 טנומטר כי ב 280 טנ"מ צריך להיבדק עם ספקטרופוטומטר. אם לא ניתן להשיג התעצמות PCR אחת של האורך הצפו?...

MicroRNAs (miRNAs) — RNAs קצר, noncoding שגורמים להשפלה ועיכוב שעתוק של RNA שליח (mRNA)1 — הוצגו לווסת את הביטוי של mRNAs שונים שיש להם תפקידים מכריעים הן פיזיולוגיה ומחלה (למשל, דלקת, פיברוזיס, הפרעות מטבוליות, וסרטן). חלק miRNAs ולכן עשוי להיות מועמד רומן סמנים ביולוגיים ומטרות טיפוליותעבור מגוון רחב של מחלות 2,,3,,4,,5. למרות פרופילי ביטוי miRNA באיברי עכבר ורקמות כולל המוח, הלב, הריאה, הכבד, וכליהתוארו 6,7,88,9,10, לא היו שיטות סטנדרטיות לחילוץ והערכה של miRNAs בכליות עכבר עם פיברוזיס בין-כליתי.
עיצבנו פרוטוקול כדי לטהר ולזהות באופן אמין את הביטויים של miRNAs בכליות של עכברים עם פיברוזיס interstitial כליות. הפרוטוקול כולל חמישה שלבים עיקריים, כדלקמן. (1) עכברים זכרים בני 8 שבועות מחולקים לקבוצות של עכברים העוברים ניתוח מזויף (פקדים) ועכברים הנתונים לניתוח המספק חסימה חד-צדדית של שופכות (UUO), המקושר לפיברוזיס בין-גזעי של כליות. (2) דגימות כליות מופקות מעכברי זיוף וUO, homogenized בנפרד הומוגנייזר סיליקון, ולאחר מכן מועברים למערכת גריסה biopolymer על עמודה ספין microcentrifuge11,12. (3) RNA הכולל המכיל miRNA מופק מדגימות הכליה על ידי עמודת ספין מבוססת קרוםסיליקה 12,13. (4) באמצעות RNA הכולל שחולץ זה, DNA משלים (cDNA) מסונתז מן RNA הכולל עם השימוש תעתיק הפוך, פולימראז פולימראז, פריימר oligo-dT14,,15. (5) הביטויים של miRNAs מוערכים על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי (qRT-PCR) באמצעות צבע intercalating14,15.
פרוטוקול זה מבוסס על חקירות שהשיגו עקירות משמעותיות והערכות של miRNAsבמגוון רקמות 11,12,13,14,15, ואת מערכת גריסה biopolymer בשימוש בפרוטוקול הוצג לטהר באיכות גבוהה, סך RNA מרקמות ב 200612., בנוסף, מחקרים קודמים אישרו את הדיוק והרגישות של היבטים של הפרוטוקול (כלומר, סינתזה cDNA עם תעתיק הפוך, פולימראז פולימראז, פריימרים oligo-dT מ RNA הכולל שחולצו) לקביעת ביטוי miRNA על ידי qRT-PCR עםצבע intercalating 14,15. מאז הפרוטוקול החדש יש את היתרונות של פשטות, חיסכון בזמן, והפחתת שגיאות טכניות, הפרוטוקול יכול לשמש במחקר הדורש זיהוי מדויק ורגיש של פרופיל miRNA בכליות העכבר. יתר על כן, הפרוטוקול יכול להיות מיושם על חקירות של תנאים פתולוגיים רבים.
אנו מתארים בשלב הבא את הקביעה של פרופילי ביטוי miRNA בעכברים עם UUO, אשר מקושר פיברוזיס interstitial כליות. אצל בני אדם, פיברוזיס interstitial כליות היא תכונה נפוצה וחשובה של מחלת כליות כרונית ומחלת כליות סוף שלב, ללא קשר אטיולוגיהשלהם 16,17. פיברוזיס זה של כליות קשור להתקדמות אי ספיקת כליות, והוא מאופיין בביטויים מוגברים של רכיבי מטריצה חוץ-תאיים בחללים הבין-מערכתיים (לדוגמה, קולגן, פיברונטין ו-α-smooth muscle actin)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNAs (miRNAs) הם מולקולות RNA נטושות בודדות, שאינן מקודדות, שבדרך כלל מווסתות את ביטוי הגנים ברמה שלאחר שעתוק על-ידי כריכה לאתרי יעד משלימים חלקית באזור 3' לא מתורגם (UTR) של מסנג'ר RNA (mRNA), מה שמפחית את התרגום והיציבות של ה-mRNA. פרופילי ביטוי miRNA באיברים שונים ורקמות של עכברים נחקרו, אבל שיטות סטנדרטיות לטיהור וכמת של miRNA בכליות העכבר לא היו זמינים. הקמנו שיטה יעילה ואמינה לחילוץ והערכה של ביטוי miRNA בכליות העכבר עם פיברוזיס בין-זמני של הכליה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך (qRT-PCR). הפרוטוקול דרש חמישה שלבים: (1) יצירת עכברים מזויפים וחד-צדדיים של חסימה שופך (UUO). (2) חילוץ דגימות כליות מעכברי UUO; (3) חילוץ של RNA הכולל, הכולל miRNA, מדגימות הכליה; (4) סינתזה משלימה DNA (cDNA) עם שעתוק הפוך מmiRNA; ותונומתה (5) qRT-PCR באמצעות ה- cDNA. באמצעות פרוטוקול זה, אישרנו בהצלחה כי בהשוואה לפקדים, הביטוי של miRNA-3070-3p גדל באופן משמעותי ואלה של miRNA-7218-5p ו miRNA-7219-5p ירדו באופן משמעותי בכליות של מודל העכבר של פיברוזיס בין-גזעי הכליה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע את ביטוי miRNA בכליות של עכברים עם UUO.

מודל עכבר UUO נוצר על ידי קשירה שופה שמאלית כפי שתואר21 בעכברים זכרים בני 8 שבועות במשקל 20-25 גרם. שופשופים היו חסומים לחלוטין על ידי קשירה כפולה עם 4-0 תפרים משי. משכך כאבים (מלוקסיאם 5 מ"ג/ק"ג, הזרקה תת עורית) ניתנה לפני הניתוח וגם מדי יום ביומיים שלאחר הניתוח. ב 8 ימים לאחר הניתוח, כלי?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

אנו מתארים שיטה להערכת ביטוי microRNA בכליות של עכברים עם חסימה חד צדדית שופכה (UUO) על ידי תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי. פרוטוקול זה מתאים לחקר פרופילי ביטוי microRNA של כליה בעכברים עם UUO ובהקשר של תנאים פתולוגיים אחרים.

הערכת PCR בזמן אמת כמותית של ביטויי microRNA בכליות עכבר עם חסימה חד צדדית שופך

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

שיטה זו מאפשרת לספק ביטוי microRNA בכליות של עכברים עם מגוון רחב של תנאים פתולוגיים, כגון פיברוזיס כליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת פרופיל ביטוי microRNA עם דיוק גבוה ורגישות באמצעות תהליך פשוט החוסך זמן ומונע שגיאה טכנית. כדי לבצע את הניתוח המזויף, השתמש במספריים כירורגיים פינצטה לעשות חתך בעור בבטן לחתוך את השריר ואת קרום הצפק משלפוחית השתן לקצה התחתון השמאלי של הצלעות.להרדים שתי צמר גפן עם PBS בזהירות למשוך את המעיים לצד. מניחים את ספוגיות לחות כדי לזהות את הכליה השמאלית ואת השופכה. סגור את קרום צפדית ולאחר מכן את החתך עם 4-0 ניילון.כדי לבצע את חסימת השופכה החד צדדית, או UUO, לבצע חתך בעור בבטן לחתוך את השריר ואת קרום צפק כפי שהוכח לניתוח מזויף. מניחים מזרק 2.5 מיליליטר מתחת לעכבר. להרדים שתי צמר גפן עם PBS, ולאחר מכן למשוך את המעיים בזהירות לצד עם פינצטה ולהנחות את ספוגיות לזהות את השופכה השמאלית.השתמש פינצטה כדי להרים את הכליה השמאלית. השתמש 4-0 משי כדי לייגד את השופכה השמאלית בשני מקומות כ סנטימטר אחד זה מזה. חותכים את השופכה בנקודת המרכז של שתי ליגות ולאחר מכן להשתמש 4-0 תפרים ניילון כדי לסגור את קרום צפדית חתך.לאחר חיתוך קרום הצפי, כפי שהוכח בעבר, להרים אותו עם פינצטה ולהשתמש מספריים כירורגיים לעשות חתך לצדדים בקצה העליון, ולאחר מכן להמשיך את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות. לזהות את הכליה השמאלית reflux אותו עם PBS עד הכליה הופכת צהוב לבן. הסר את הכליה על ידי חיתוך עורק הכליה השמאלית ואת וריד עם מספריים כירורגיים למקם אותו בצלחת פטרי, ולאחר מכן לשטוף אותו בזהירות עם PBS.חותכים את הכליה לדגימות של כ -10 מיליגרם עם המספריים הכירורגיים והפינצטה, שמים כל חתיכה של הכליה בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר משלה וסגרו את כובע הצינור. שים דגימת כליות homogenizer סיליקון ולהוסיף 700 microliters של ריאגנט תמוגה מבוסס פניל / גואנידין. לאט לאט ללחוץ ולסובב את העלי של homogenizer נגד דגימת הכליה כדי הומוגניזציה זה.חזור על הלחיצה והתפתל עד שהדגימה תתמוסס לחלוטין בריג'נט התמיס. כדי להומוגניזציה נוספת של המדגם, העבר את ה-lysate ההומוגני לעמוד הסיבוב הביופולימרי וסובב אותו במהירות של 14,000 פעמים G למשך שלוש דקות, ולאחר מכן העבר את ה-lysate המזרז לצינור מיקרוצנטריפוגה לא נוצל של 1.5 מיליליטר. מערבבים את ה-lysate בצינור עם 140 מיקרוליטרים של כלורופורם ומכסים את הצינור בחוזקה.כדי לערבב את ליסט וכלורופורם, להפוך את הצינור 15 פעמים. דגירה הדגימות במשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לסובב אותם ב 12, 000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מבלי להפריע למשקעים, העבר את העל-טבעי לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, והוסף פי 1.5 מנפחו של 100%אתנול.מערבולת את התערובת במשך חמש שניות. לטעון 700 microliters של המדגם על עמוד ספין מעוגן קרום בצינור איסוף שני מיליליטר. סגור את מכסה העמודה וסובב את העמודה במהירות של 15,000 פעמים G למשך 15 שניות, ולאחר מכן השלך את ה- lysate המזרז בצינור האיסוף.לשטוף את המדגם ביסודיות על ידי הוספת 700 microliters של חיץ לשטוף אחד לטור ספין מעוגן קרום בצינור איסוף שני מיליליטר. ואז לחזור על הצנטריפוגה ולזרוק את צינור האיסוף. חזור על לשטוף פעמיים עם 500 microliters של חיץ לשטוף שני לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, לסובב את עמוד ספין מעוגן קרום בצינור איסוף שני מיליליטר ב 15, 000 פעמים G לדקה אחת ולזרוק את lysate זירז. מעבירים את עמוד הסיבוב המעוגן קרום לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. ממיסים את ה-RNA הכולל על ידי הוספת 30 מיקרוליטרים של מים נטולי RNase לעמוד, סוגרים את מכסה העמודה ומשאירים אותו לחמש דקות בטמפרטורת החדר.ואז לסובב את הטור ב 15, 000 פעמים G לדקה אחת. מעבירים את הדגימה המכילה RNA כולל לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש על קרח, ולמדוד את הריכוז של RNA הכולל על ידי ספקטרופוטומיטריה. הכינו פתרון תמהיל ראשי בהתאם לכיווני כתב היד והוסיפו שמונה מיקרוליטרים לכל צינור של רצועת צינור בת שמונה בארות.לאחר התאמת צפיפות ה- RNA הכוללת, מניחים אליטקוט 12 מיקרוליטר של RNA כולל לתוך כל צינור וסגרו את המכסה. צנטריפוגה הצינורות במשך 15 שניות. שים את הצינורות בתרמוצ'ילר ודגירה אותם במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.בסיום, מיד דגירה אותם במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס לסינתזה של cDNA. מעבירים את ה-cDNA לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר ומדללים אותו 10 פעמים במים מזוקקים. Vortex ו צנטריפוגה הצינור במשך חמש שניות, ולאחר מכן לבצע PCR כמותי בזמן אמת, כמתואר בכתב היד טקסט.פרוטוקול זה שימש ליצירת מודל עכבר חסימת שופכה חד צדדי באמצעות רצועות השופכה השמאלית בעכברים זכרים בני שמונה שבועות במשקל של 20 עד 25 גרם. השופכים נחסמו לחלוטין על ידי רצועות כפולות עם תפרי משי 4-0. הכליות נאספו בשמונה ימים לאחר הניתוח.נתוני microRNA qRT-PCR הצביעו על כך שרמת המיקרו-רנ"א 3070-3p עלתה באופן משמעותי ורמות המיקרו-רנ"א, 7218-5p ו-microRNA 7219-5p ירדו בכליות של עכברי UUO בהשוואה לפקדים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לחזור לסובב את דגימת הכליה עד שהוא מומס לחלוטין בריאגנט תמיסת תמיסה מבוסס פניל / גואנידין כדי להשיג מיצוי RNA טוב.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

מיזוג במונחים מוחלטים ובאופן יחסי PCR כמותי נתונים לכמת STAT3 אחוי Variant תעתיקים

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

משלוח מערכתית של MicroRNA באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-הקשורים Serotype 9 לטיפול מחלות נוירומוסקולריות אצל מכרסמים

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

דו כיווני Retroviral אינטגרציה אתר PCR מתודולוגיה וניתוח נתונים כמותיים זרימת עבודה

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

פרוטוקול מחוץ לגופית להערכת רמות מיקרוארנה, פונקציות, וגנים היעד הקשורים בתאי הגידול

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

דיגיטלי PCR מבוססי אינדקס תחרותי עבור ניתוח תפוקה גבוהה של כושר בסלמונלה

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

צינור ביואינפורמטיקה לנתח באופן מדויק ויעיל את המייקרואורפה בצמחים

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...