Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Ringraziamo Michelle Goody, PhD, di Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) per aver modificato una bozza di questo manoscritto.

Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico Animale della Jichi Medical University e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida Sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. La chirurgia farsa
<ol><li>Preparare i seguenti elementi: isoflurane, foglio di sughero, crema depilatoria, salviette di laboratorio, piatto Petri con salina tamponata di fosfati (PBS), 4-0 nylon, pinzette...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

Il protocollo sopra descritto con qRT-PCR ha determinato con successo i livelli di espressione dei miRNA mirati. La valutazione dei miRNA estratti è importante quando si cerca di ottenere dati qRT-PCR significativi e, al fine di confermare la qualità dei miRNA prima di eseguire il qRT-PCR, il rapporto di assorbimento a 260 nm a quello a 280 nm deve essere controllato con uno spettrofotometro. Se una singola amplificazione PCR della lunghezza prevista e della temperatura di fusione o una curva di fusione monomodale non ...

I microRNA (miRNA) - gli RNA corti e non codificanti che causano la degradazione e l'inibizione trascrizionale dell'RNA messaggero (mRNA)1 - hanno dimostrato di regolare l'espressione di vari mRNA che hanno ruoli cruciali sia nella fisiologia che nella malattia (ad esempio, infiammazione, fibrosi, disturbi metabolici e cancro). Alcuni dei miRNA possono quindi essere candidati nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici per una varietà di malattie2,3,4,5. Anche se i profili di espressione del miRNA negli organi murini e nei tessuti, tra cui cervello, cuore, polmone, fegato e rene sono statidescritti 6,7,8,9,10, non ci sono stati metodi standard per l'estrazione e la valutazione dei miRNA nel rene del topo con fibrosi interstiziale renale.
Abbiamo progettato un protocollo per purificare e rilevare in modo affidabile le espressioni dei miRNA nei reni dei topi con fibrosi interstiziale renale. Il protocollo prevede cinque passaggi principali, come indicato di seguito. (1) I topi maschi C57BL/6 di 8 settimane sono divisi in gruppi di topi che subiscono un'operazione fittizia (controlli) e topi sottoposti a un intervento chirurgico che fornisce ostruzione ureterale unilaterale (UUO), che è collegata alla fibrosi interstiziale renale. (2) I campioni di rene vengono estratti dai topi finti e UUO, omogeneizzati separatamente in un omogeneizzatore di silicio, e poi trasferiti in un sistema di triturazione del biopolimero su una colonna di spin microcentrifuge11,12. (3) L'RNA totale contenente miRNA viene estratto dai campioni renali da una colonna di spin a base di membrana di silice12,13. (4) Utilizzando questo RNA totale estratto, il DNA complementare (cDNA) viene sintetizzato dall'RNA totale con l'uso di trascrizione inversa, polimerasi poli(A) e oligo-dT primer14,15. (5) Le espressioni dei miRNA sono valutate mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) utilizzando un colorante intercalante14,15.
Questo protocollo si basa su indagini che hanno ottenuto estrazioni significative e valutazioni di miRNA in una varietà di tessuti11,12,13,14,15, e il sistema di triturazione del biopolimero utilizzato nel protocollo è stato indicato per purificare alta qualità, RNA totale dai tessuti nel 200612. Inoltre, studi precedenti hanno confermato l'accuratezza e la sensibilità di aspetti del protocollo (cioè la sintesi cDNA con trascrizione inversa, polimerasi poli(A) e primer oligo-dT dall'RNA totale estratto) per la determinazione dell'espressione del miRNA da qRT-PCR con un colorante intercalante14,15. Dal momento che il nuovo protocollo ha i vantaggi di semplicità, risparmio di tempo, e la riduzione degli errori tecnici, il protocollo può essere utilizzato nella ricerca che richiede l'identificazione accurata e sensibile del profilo miRNA nel rene del topo. Inoltre, il protocollo potrebbe essere applicato alle indagini su molte condizioni patologiche.
Descriviamo poi la determinazione dei profili di espressione miRNA nei topi con UUO, che è legata alla fibrosi interstiziale renale. Nell'uomo, la fibrosi interstiziale renale è una caratteristica comune e importante sia della malattia renale cronica che della malattia renale dello stadio finale, indipendentemente dalla loro eziologia16,17. Questa fibrosi interstiziale renale è associata alla progressione dell'insufficienza renale, ed è caratterizzata da una maggiore espressione di componenti di matrice extracellulare negli spazi interstiziali (ad esempio, collagene, fibronectina e actin muscolare α liscio)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

I microRNA (miRNA) sono singole molecole di RNA non codificanti che in genere regolano l'espressione genica a livello post-trascrizionale legandole a siti bersaglio parzialmente complementari nella regione non tradotta (UTR) dell'RNA messaggero (mRNA), che riduce la traduzione e la stabilità dell'mRNA. I profili di espressione miRNA in vari organi e tessuti dei topi sono stati studiati, ma i metodi standard per la purificazione e la quantificazione del miRNA nel rene del topo non sono stati disponibili. Abbiamo stabilito un metodo efficace e affidabile per estrarre e valutare l'espressione del miRNA nel rene del topo con fibrosi interstiziale renale mediante reazione a catena di polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR). Il protocollo richiedeva cinque fasi: (1) creazione di topi finti e unilaterali di ostruzione ureterale (UUO); (2) estrazione di campioni renali dai topi UUO; (3) estrazione dell'RNA totale, che include il miRNA, dai campioni di rene; (4) sintesi del DNA complementare (cDNA) con trascrizione inversa dal miRNA; e (5) qRT-PCR utilizzando il cDNA. Utilizzando questo protocollo, abbiamo confermato con successo che rispetto ai controlli, l'espressione di miRNA-3070-3p è stata significativamente aumentata e quelli di miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p sono stati significativamente diminuiti nei reni di un modello murino di fibrosi interstiziale renale. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare l'espressione di miRNA nei reni dei topi con UUO.

Un modello di topo UUO è stato creato dalla legatura ureterale sinistra comedescritto 21 in topi maschi di 8 settimane di peso 20-25 g. Gli urester erano completamente ostruito dalla doppia legatura con suture di seta 4-0. Un analgesico (meloxicam 5 mg/kg, iniezione sottocutanea) è stato somministrato prima dell'intervento chirurgico e anche ogni giorno nei 2 giorni dopo l'intervento chirurgico. A 8 giorni dopo l'intervento chirurgico, i reni sono stati raccolti, sciacquati con PBS, sezionati e ...

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Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Descriviamo un metodo per valutare l'espressione del microRNA nei reni dei topi con ostruzione ureterale unilaterale (UUO) mediante reazione a catena di polimerasi di trascrizione inversa quantitativa. Questo protocollo è adatto per studiare i profili di espressione del microRNA renale nei topi con UUO e nel contesto di altre condizioni patologiche.

Valutazione PCR in tempo reale quantitativa delle espressioni di microRNA nel rene del topo con ostruzione ureterale unilaterale

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Questo metodo consente di fornire espressione di microRNA nei reni dei topi con una vasta gamma di condizioni patologiche, come la fibrosi renale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la profilazione dell'espressione del microRNA con elevata precisione e sensibilità utilizzando un processo semplice che consente di risparmiare tempo e previene gli errori tecnici. Per eseguire l'intervento chirurgico fittizio, utilizzare forbici chirurgiche e pinzette per fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole.Inumidire due tamponi di cotone con PBS e tirare con cura l'intestino di lato. Posizionare i tamponi inumiditi per identificare il rene sinistro e l'uretero. Chiudere la membrana peritoneale e quindi l'incisione con nylon 4-0.Per eseguire l'ostruzione uretrale unilaterale, o UUO, fare un'incisione nella pelle all'addome e tagliare il muscolo e la membrana peritoneale come dimostrato per l'intervento fittizio. Posizionare una siringa da 2,5 millilitri sotto il mouse. Inumidire due tamponi di cotone con PBS, quindi tirare accuratamente l'intestino di lato con le pinzette e posizionare i tamponi per identificare l'ureter sinistro.Usa le pinzette per sollevare il rene sinistro. Usa la seta 4-0 per ligare l'uretero sinistro in due punti a circa un centimetro di distanza. Tagliare l'uretro nel punto centrale delle due legature e quindi utilizzare suture di nylon 4-0 per chiudere la membrana peritoneale e l'incisione.Dopo aver tagliato la membrana peritoneale, come precedentemente dimostrato, sollevarla con una pinzetta e utilizzare forbici chirurgiche per fare un'incisione laterale sul bordo superiore, quindi continuare l'incisione lungo il bordo più basso delle costole. Identificare il rene sinistro e refluirlo con PBS fino a quando il rene diventa giallo-bianco. Rimuovere il rene tagliando l'arteria renale sinistra e la vena con le forbici chirurgiche e posizionarlo in una piastra di Petri, quindi lavarlo con cura con PBS.Tagliare il rene in circa campioni da 10 milligrammi con le forbici chirurgiche e le pinzette, mettere ogni pezzo di rene nel proprio tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e chiudere il tappo del tubo. Mettere un campione di rene nell'omogeneizzatore di silicone e aggiungere 700 microlitri di un reagente di lisi a base di fenile/guanidina. Premere e torcere lentamente il pestello dell'omogeneizzatore contro il campione di rene per omogeneizzarlo.Ripetere la pressatura e la torsione fino a quando il campione non viene completamente sciolto nel reagente dellalisi. Per omogeneizzare ulteriormente il campione, trasferire il lisato omogeneizzato nella colonna di spin del biopolimero e ruotarlo a 14.000 volte G per tre minuti, quindi trasferire il lisato precipitato in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri inutilizzato. Unire il lisato nel tubo con 140 microlitri di cloroformio e cappuccio saldamente il tubo.Per mescolare il llysato e il cloroformio, invertire il tubo 15 volte. Incubare i campioni per due o tre minuti a temperatura ambiente, quindi girarli a 12.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Senza disturbare il precipitato, trasferire il supernatante in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e aggiungere 1,5 volte il suo volume di etanolo al 100%.Vortice la miscela per cinque secondi. Caricare 700 microlitri del campione su una colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta a due millilitri. Chiudere il tappo della colonna e ruotare la colonna a 15.000 volte G per 15 secondi, quindi gettare via il lisato precipitato nel tubo di raccolta.Lavare accuratamente il campione aggiungendo 700 microlitri di tampone di lavaggio uno alla colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta a due millilitri. Quindi ripetere la centrifugazione e gettare via il tubo di raccolta. Ripetere il lavaggio due volte con 500 microlitri di tampone di lavaggio due per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, ruotare la colonna di spin ancorata a membrana in un tubo di raccolta da due millilitri a 15.000 volte G per un minuto e gettare via il lisato precipitato. Trasferire la colonna di spin ancorata a membrana in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Sciogliere l'RNA totale aggiungendo 30 microlitri di acqua priva di RNasi alla colonna, chiudere il cappuccio della colonna e lasciarlo per cinque minuti a temperatura ambiente.Quindi gira la colonna a 15.000 volte G per un minuto. Trasferire il campione contenente RNA totale in un nuovo tubo di microcentrifugo sul ghiaccio e misurare la concentrazione di RNA totale per spettrofotometria. Preparare una soluzione di mixaggio principale in base alle indicazioni del manoscritto e aggiungere otto microlitri a ciascun tubo di una striscia di tubi a otto pozzi.Dopo aver regolato la densità totale dell'RNA, posizionare un'aliquota di 12 microliter dell'RNA totale in ogni tubo e chiudere il cappuccio. Centrifugare i tubi per 15 secondi. Mettere i tubi nel termociclo e incubarli per 60 minuti a 37 gradi Celsius.Al termine, incubarli immediatamente per cinque minuti a 95 gradi Celsius per la sintesi di cDNA. Trasferire il cDNA in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e diluirlo 10 volte con acqua distillata. Vortice e centrifuga il tubo per cinque secondi, quindi eseguire PCR quantitativo in tempo reale, come descritto nel manoscritto testuale.Questo protocollo è stato utilizzato per creare un modello unilaterale di topo ostruzione uretrale tramite legatura ureterale sinistra in topi maschi di otto settimane del peso di 20-25 grammi. Gli ureteri erano completamente ostruito da una doppia legatura con suture di seta 4-0. I reni sono stati raccolti a otto giorni dopo l'intervento chirurgico.I dati del microRNA qRT-PCR indicavano che il livello di microRNA 3070-3p era significativamente aumentato e i livelli di microRNA, 7218-5p e microRNA 7219-5p sono diminuiti nei reni dei topi UUO rispetto ai controlli. Quando si tenta questo protocollo, ricordarsi di ripetere la torsione del campione di rene fino a quando non viene completamente sciolto nel reagente di lisi a base di fenil/ guanidina per ottenere una buona estrazione di RNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

La fusione assoluta e relativa PCR quantitativa dei dati per quantificare STAT3 Splice Variant Trascrizioni

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Ricerca

Genetica

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-type Blocco PCR Combinato con sequenziamento diretto come un metodo altamente sensibile per il rilevamento di bassa frequenza di mutazioni somatiche

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Rilevamento dell&#39;espressione di microRNA nella membrana peritoneale dei ratti usando il quantitativo PCR in tempo reale

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Sistema di integrazione bidirezionale retrovirale Metodo PCR e flusso di lavoro analitico dei dati quantitativi

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

In tempo reale analisi del fattore di trascrizione associazione, trascrizione, traduzione e fatturato per visualizzare eventi globali durante l'attivazione cellulare

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Una pipeline di bioinformatica per analizzare in modo accurato ed efficiente i trascrittomi di microRNA nelle piante

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...