Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

エダンツ・グループ(https://en-author-services.edanzgroup.com/)のミシェル・グッディ博士は、この原稿の草稿を編集してくれたことに感謝します。

すべての動物実験プロトコルは、吉地医科大学動物倫理委員会によって承認され、実験動物のための吉地医科大学ガイドから実験動物の使用とケアのガイドラインに従って行われました。
1. 恥の手術
<ol><li>イゾフルラン、コルクシート、脱毛剤クリーム、実験室用ワイプ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)付きのペトリ皿、4-0ナイロン、ピンセット、外科用ハサミ、綿棒、8週...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. 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M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. 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qRT-PCR を用いた上記のプロトコルは、標的 miRNA の発現レベルを正常に決定しました。抽出されたmiRNAの評価は、意味のあるqRT-PCRデータを得るために重要であり、そしてqRT-PCRを行う前にmiRNAの品質を確認するために、260nmでの吸光度の比率を280nmで分光光度計で確認する必要があります。qRT-PCRでは、予想される長さおよび融点または単一性融解曲線の単一PCR増幅が得られない場合、反応板の各?...

マイクロRNA(miRNA)は、メッセンジャーRNA(mRNA)1の分解および転写阻害を引き起こす短い非コードRNAであり、生理学1と疾患(例えば、炎症、線維症、代謝障害、癌)の両方において重要な役割を果たしている様々なmRNAの発現を調節することが示されている。したがって、miRNAの一部は,、様々な疾患2、3、4、53の新しい2バイオマーカーおよび治療標的の候補である可能性がある。,45脳、心臓、肺、肝臓、腎臓を含むマウスの臓器および組織におけるmiRNA発現プロファイルは66、7、8、9、107,8,9,10と記載されているが、腎間質線維症を有するマウス腎臓におけるmiRNAの抽出および評価のための標準的な方法は存在しなかった。
腎間質線維症を有するマウスの腎臓におけるmiRNAの表現を確実に精製し、検出するプロトコルを設計した。このプロトコルには、次の 5 つの主要な手順が含まれます。(1) 8週齢のC57BL/6雄マウスは、恥ずかし操作(コントロール)を受けるマウスと、腎間質線維症に結合する一方的な尿管閉塞(UUO)を提供する手術を受けるマウスのグループに分けられる。(2)腎臓試料は、シャムマウスとUUOマウスから抽出され、ケイ素ホモジナイザーで別々にホモジナイズされ、次いでマイクロ遠心分離機スピンカラム11,12,12上の生体高分子シュレッディングシステムに移される。(3)miRNAを含む全RNAは、シリカ膜ベースのスピンカラム12、13,13によって腎臓サンプルから抽出される。(4)この抽出された全RNAを用いて、逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、及びオリゴdTプライマー14,15,15を用いて全RNAから相補的DNA(cDNA)を合成する。(5)miRNAの式は、インターカレート色素14,15,15を用いて定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)により評価される。
このプロトコル,は、様々な組織11、12、13、14、15の様々な組織11,12,13,14でmiRNAの有意義な抽出と評価を得た調査に基づいており、プロトコルで使用される生体高分子細断システムは、200612年に組織から高品質の総RNAを精製することが示された。15さらに、以前の研究では、インターカレートダイ14,15を用いてqRT-PCRによるmiRNA発現の測定に用いるプロトコルの側面(すなわち、逆転写酵素によるcDNA合成、ポリ(A)ポリメラーゼ、および抽出された全RNAからのオリゴ-dTプライマー)の正確性と15感度を確認した。新しいプロトコルは、簡便さ、時間節約、および技術的なエラーの削減の利点を有するため、このプロトコルは、マウス腎臓におけるmiRNAプロファイルの正確かつ敏感な同定を必要とする研究に使用することができる。さらに、このプロトコルは、多くの病理学的状態の調査に適用することができる。
次に、腎間質線維症に関連するUUOを有するマウスにおけるmiRNA発現プロファイルの決定について説明する。ヒトにおいて、腎間質線維症は、病因16,17,17に関係なく慢性腎疾患および末期腎疾患の両方の共通かつ重要な特徴である。この腎間質線維症は、腎不全の進行に関連しており、そして間質空間における細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、およびα平滑筋アクチン)17,18,18の表現の増加によって特徴付けられる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

マイクロRNA(miRNA)は、一本鎖で非コード化されたRNA分子であり、メッセンジャーRNA(mRNA)の3'非翻訳領域(UTR)の部分的に相補的な標的部位に結合することによって転写後レベルで遺伝子発現を調節するのが一般的であり、mRNAの翻訳および安定性を低下させる。マウスの様々な臓器や組織におけるmiRNA発現プロファイルは検討されているが、マウス腎臓におけるmiRNAの精製および定量のための標準的な方法は利用できなかった。我々は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)による腎間質線維化によるマウス腎におけるmiRNA発現を抽出し、評価するための効果的かつ信頼できる方法を確立した。このプロトコルには、(1)シャムと一方的な尿管閉塞(UUO)マウスの作成の5つのステップが必要でした。(2) UUOマウスからの腎臓サンプルの抽出;(3) 腎臓サンプルからのmiRNAを含む全RNAの抽出;(4) 相補的 DNA (cDNA) miRNA からの逆転写による合成;(5) cDNAを用いたqRT-PCRを用いた。このプロトコルを用いて、対照と比較してmiRNA-3070-3pの発現が有意に増加し、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現が腎間質線維症のマウスモデルの腎臓において有意に減少したことを確認した。このプロトコルは、UUOを有するマウスの腎臓におけるmiRNA発現を決定するために使用することができる。

UUOマウスモデルは、20〜25gの体重を量る8週齢の雄マウスの21を記述した左尿管結紮によって作成された。4-0シルク縫合糸による二重結紮により、尿管は完全に妨害された。鎮痛薬(メロキシカム5mg/kg、皮下注射)は手術前および手術後2日間毎日投与された。手術後8日間で、腎臓を採取し、PBSですすいだ、解剖し、さらに分析するために液体窒素に貯蔵した。シャム作動したマ?...

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Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。

一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

この方法により、腎線維症などの広範囲の病理的状態を有するマウスの腎臓にマイクロRNA発現を提供することができる。この技術の主な利点は、時間を節約し、技術的なエラーを防ぐ簡単なプロセスを使用して、高精度かつ感度でマイクロRNA発現プロファイリングを可能にすることです。恥ずかしの手術を行うには、外科的なはさみとピンセットを使用して腹部の皮膚を切開し、膀胱から肋骨の左端まで筋肉と腹膜を切断する。PBSで綿棒2本を湿らせ、腸を慎重に横に引っ張ります。湿らせた綿棒を置いて、左腎臓と尿管を識別します。腹膜を閉じ、4-0ナイロンで切開します。一方的な尿道閉塞、またはUUOを行うには、腹部の皮膚に切開を行い、恥の手術のために示されるように筋肉と腹膜を切断します。マウスの下に2.5ミリリットルの注射器を置きます。PBSで綿棒を2本湿らせ、ピンセットで腸を慎重に横に引っ張り、綿棒を置いて左尿管を識別します。ピンセットを使用して左腎臓を持ち上げます。4-0シルクを使用して、約1センチメートル離れた2つの場所で左尿管をリゲートします。2つの結紮の中心点で尿管を切り、4-0ナイロン縫合糸を使用して腹膜と切開部を閉じます。腹膜を切断した後、先に示したように、ピンセットでそれを持ち上げ、上端で横方向の切開を行うために外科用のはさみを使用し、その後、肋骨の最も低い端に沿って切開を続ける。左腎臓を識別し、腎臓が黄白になるまでPBSでそれを還流します。左腎動脈と静脈を外科用ハサミで切断して腎臓を取り除き、ペトリ皿に入れ、PBSで慎重に洗います。外科用ハサミとピンセットで腎臓を約10ミリグラムのサンプルに切り、腎臓の各部分を独自の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、チューブのキャップを閉じます。シリコーンホモジナイザーに腎臓サンプルを入れ、フェニル/グアニジンベースのリシス試薬を700マイクロリットル添加します。ホモジナイザーの害虫を腎臓サンプルに対してゆっくりと押してねじり、ホモジナイズを均質化します。サンプルが溶解試薬に完全に溶解するまで押し、ねじれを繰り返します。さらに試料を均質化するには、ホモゲン化したリセートを生体高分子スピンカラムに移し、Gを14,000回Gで3分間回転させ、沈殿したライセートを未使用の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。チューブ内のライセートと140マイクロリットルのクロロホルムを組み合わせ、チューブをしっかりとキャップします。ライセートとクロロホルムを混合するには、チューブを15回反転する。サンプルを室温で2〜3分間インキュベートし、摂氏4度で15分間Gの12,000倍に回転させます。沈殿物を乱すことなく、上澄み液を新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、100%エタノールの体積の1.5倍を加えます。混合物を5秒間渦液します。サンプル700マイクロリットルを2ミリリットルの回収チューブの膜固定スピンカラムに積み込みます。カラムキャップを閉じ、Gの15,000倍の位置で15秒間回転させ、集塵したライセートを回収管に捨てる。2ミリリットルの回収チューブの膜固定スピンカラムに700マイクロリットルの洗浄バッファー1を加えてサンプルを十分に洗浄します。その後、遠心分離を繰り返し、コレクションチューブを捨てる。洗浄ごとに500マイクロリットルの洗浄バッファー2で2回洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、膜固定スピンカラムを2ミリリットルのコレクションチューブで15,000倍Gで1分間回転させ、沈殿したライセートを捨てる。膜固定スピンカラムを新しい1.5ミリリットルチューブに移します。カラムに30マイクロリットルのRNaseフリー水を加えてRNA全体を溶解し、カラムキャップを閉じ、室温で5分間放置します。その後、15,000回Gで1分間列を回転させます。全RNAを含むサンプルを氷上の新しいマイクロ遠心分離管に移し、分光光測定により全RNAの濃度を測定します。原稿の方向に従ってマスターミックス溶液を準備し、8ウェルチューブストリップの各チューブに8マイクロリットルを追加します。RNAの全密度を調整した後、各チューブに12マイクロリットルのRNAのアリコートを入れ、キャップを閉じます。チューブを15秒間遠心分離します。チューブをサーモサイクラーに入れ、摂氏37度で60分間インキュベートします。終了したら、すぐにcDNAの合成のために摂氏95度で5分間インキュベートします。cDNAを新しい1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、蒸留水で10回希釈します。渦および遠心分離管を5秒間、次に、テキスト原稿に記載されているように定量的リアルタイムPCRを行う。このプロトコルは、体重20〜25グラムの8週齢の雄マウスで左尿管結紮を介して一方的な尿道閉塞マウスモデルを作成するために使用された。4-0シルク縫合糸による二重結紮により、尿管は完全に妨害された。腎臓は手術後8日間で採取された。マイクロRNA qRT-PCRデータは、マイクロRNA 3070-3pのレベルが有意に増加し、マイクロRNAのレベル、7218-5pおよびマイクロRNA 7219-5pがコントロールと比較してUUOマウスの腎臓で減少したことを示した。このプロトコルを試みるとき、腎臓サンプルがフェニル/グアニジンベースの溶解試薬に完全に溶解するまで、腎臓サンプルを繰り返して、良好なRNA抽出を達成することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

STAT3スプライスバリアント転写産物を定量化するために絶対的および相対的定量PCRのデータをマージ

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

マイクロ Rna の齧歯動物の神経筋疾患を治療する遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス血清型 9 を使用しての全身配信

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

サルモネラ菌におけるフィットネスのハイスループット分析に関するデジタルPCRベースの競争指数

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

植物におけるマイクロRNA転写物を正確かつ効率的に分析するバイオインフォマティクスパイプライン

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...