Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

이 원고의 초안을 편집한 에단츠 그룹(https://en-author-services.edanzgroup.com/)의 미셸 구디 박사에게 감사드립니다.

모든 동물 실험 프로토콜은 지치의과대학의 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, 지치의과대학 실험실 동물가이드의 실험동물 사용 및 관리 지침에 따라 시행되었다.
1. 가짜 수술
<ol><li>이소플루란, 코르크 시트, 탈취 크림, 실험실 물티슈, 인산염 완충식살린 살린 페트리 접시(PBS), 4-0 나일론, 핀셋, 수술 가위, 면봉, 8주된 C57BL/6 수컷 마우스 를 준비한다.</li>
	<li>1.5%의 이소?...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

qRT-PCR을 사용하는 전술한 프로토콜은 표적 miRNAs의 발현 수준을 성공적으로 결정했습니다. 추출된 miRNAs의 평가는 의미 있는 qRT-PCR 데이터를 얻기 위하여 길들이기 위하여, qRT-PCR를 수행하기 전에 miRNAs의 질을 확인하기 위하여, 280 nm에서 그280 nm에 흡수의 비율을 분광광계로 검사되어야 합니다. 예상 길이및 용융 온도 또는 모노모달 용융 곡선의 단일 PCR 증폭이 qRT-PCR에 의해 얻을 수 없는 경우, 반응...

MicroRNAs (miRNA) - 메신저 RNA (mRNA)1의 분해 및 전사 억제를 일으키는 짧은 비코딩 RNA -는 생리학 과 질병 (예를 들어, 염증, 섬유증, 대사 장애 및 암)에서 중요한 역할을하는 다양한 mRNA의 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 일부 miRNAs는 따라서 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커 및2치료 대상이 될 수 있다2,3,,4,,5. 마우스 장기 및 뇌, 심장, 폐, 간 및 신장을 포함하는 조직에서 miRNA 발현 프로파일이6,7,,8,,9,,10을기재했지만 신장 간 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNAs의 추출 및 평가를 위한 표준 방법이 없었습니다.6
우리는 신장 간질 섬유증을 가진 마우스의 신장에 있는 miRNAs의 표정을 안정적으로 정화하고 검출하기 위하여 프로토콜을 디자인했습니다. 프로토콜에는 다음과 같이 다섯 가지 주요 단계가 포함됩니다. (1) 8주 된 C57BL/6 수컷 마우스는 신장 간질 섬유증에 연결되는 일방적인 요관 방해(UUO)를 제공하는 수술을 받는 가짜 작동(대조군) 및 마우스의 그룹으로 나뉩니다. (2) 신장 샘플은 샴 과 UUO 마우스로부터 추출되고, 실리콘 균질화로 별도로 균질화한 다음, 마이크로센심분리기 스핀컬럼(11,,12)에바이오 폴리머 분쇄 시스템으로 이송된다. (3) miRNA를 함유하는 총 RNA는 실리카 막 계 스핀컬럼(12,,13)에의해 신장 샘플로부터 추출된다. (4) 이 추출된 총 RNA를 이용하여, 상호 보완적인 DNA(cDNA)는 역전사, 폴리(A) 폴리머라제, 및 올리고-dT 프라이머14,,15를사용하여 총 RNA로부터 합성된다. (5) miRNAs의 발현은 상호염료(14,,15)를이용하여 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)에 의해 평가된다.
본 프로토콜은 다양한조직(11,12,,13,,14,,15)에서miRNAs의 의미 있는 추출 및 평가를 획득한 조사에 기초하여, 프로토콜에 사용된 생체 중합체 분쇄 시스템은 2006년조직으로부터고품질, 총 RNA를 정제하는 것으로 나타났다., 또한, 선행 연구는 계열염,14,15를갖는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현의 판정을 위해 프로토콜(즉, 역실래, 폴리(A) 폴리머라제 및 올리고-dT 프라이머를 갖는 cDNA 합성의 양태의 정확성 및 민감도를 확인하였다. 새로운 프로토콜은 단순성, 시간 절약 및 기술적 오류의 감소의 장점을 가지고 있기 때문에, 프로토콜은 마우스 신장에서 miRNA 프로필의 정확하고 민감한 식별을 필요로하는 연구에서 사용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 많은 병리학 적 조건의 조사에 적용 될 수있다.
우리는 신장 간질 섬유증에 연결되는 UUO를 가진 마우스에 있는 miRNA 발현 단면도의 결정을 기술합니다. 인간에서, 신장 간질 섬유증은 그들의 병인학에 관계없이 만성 신장 질환과 말기 신장 질환 모두의 일반적이고 중요한 특징이다16,,17. 이러한 신장 간질 섬유증은 신부전의 진행과 관련이 있으며, 간질 공간에서 세포외 매트릭스 성분의 증가된 발현(예를 들어, 콜라겐, 섬유넥틴 및 α-부드러운 근육 액틴)을 특징으로 한다.17,18

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNAs(miRNAs)는 mRNA의 번역 및 안정성을 감소시키는 메신저 RNA(mRNA)의 3'번역되지 않은 영역(UTR)에서 부분적으로 상호 보완적인 표적 부위에 결합하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 전형적으로 조절하는 단일 좌초, 비코딩 RNA 분자이다. 마우스의 다양한 장기 및 조직에서 miRNA 발현 프로파일을 조사하였지만 마우스 신장에서 miRNA의 정제 및 정량화를 위한 표준 방법은 제공되지 않았다. 우리는 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 신장 간질 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNA 발현을 추출하고 평가하기위한 효과적이고 신뢰할 수있는 방법을 설립했습니다. 프로토콜은 다섯 단계를 필요로: (1) 가짜와 일방적 인 요관 방해 (UUO) 마우스의 생성; (2) UUO 마우스로부터 신장 시료의 추출; (3) 신장 샘플에서 miRNA를 포함하는 총 RNA의 추출; (4) miRNA에서 역 전사를 가진 보완 DNA (cDNA) 합성; 및 (5) cDNA를 사용하여 qRT-PCR. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 대조군과 비교하여, miRNA-3070-3p의 발현이 현저하게 증가되었고 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현이 신장 간질 섬유증의 마우스 모델의 신장에서 현저히 감소되었다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스의 신장에 있는 miRNA 발현을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다.

UUO 마우스 모델은 20-25g의 8주 된 수컷 마우스에서21에 설명된 바와 같이 왼쪽 요관 결찰에 의해 만들어졌습니다. 우레는 4-0 실크 봉합사로 더블 리그에 완전히 막혀 있었다. 진통제 (멜록시캠 5 mg/kg, 피하 주사) 수술 전과 수술 후 2 일 동안 매일 투여되었습니다. 수술 후 8일 동안 신장을 채취하고, PBS로 헹구고, 해부하고, 추가 분석을 위해 액체 질소에 저장하였다. 샴 작동 마우스?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

이 방법은 신장 섬유증과 같은 광범위한 병리학 적 조건을 가진 마우스의 신장에서 microRNA 발현을 제공할 수 있게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스를 사용하여 높은 정확도와 감도로 마이크로RNA 발현 프로파일링을 가능하게 한다는 것입니다. 가짜 수술을 수행하려면 외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 자른다.PBS로 두 면봉을 적시고 창자를 조심스럽게 옆으로 당깁니다. 왼쪽 신장과 요관을 식별하기 위해 촉촉한 면봉을 놓습니다. 회막을 닫은 다음 4-0 나일론으로 절개를 합니다.일방적인 요도 방해, 또는 UUO를 수행하기 위해 복부의 피부에 절개를하고 가짜 수술에 대해 입증 된 바와 같이 근육과 복막을 잘라냅니다. 마우스 아래에 2.5 밀리리터 주사기를 놓습니다. PBS로 두 면 봉기를 모은 다음 핀셋으로 창자를 조심스럽게 옆으로 당기고 면봉을 놓아 왼쪽 요관자를 식별합니다.핀셋을 사용하여 왼쪽 신장을 들어 올립니다. 4-0 실크를 사용하여 왼쪽 요관을 두 곳에서 약 1센티미터 떨어진 곳에 장식합니다. 두 결찰의 중심 지점에서 요관을 잘라 한 다음 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 회막과 절개를 닫습니다.이전에 설명한 대로 회막을 절단한 후 핀셋으로 들어 올려 외과 가위를 사용하여 상단 가장자리에서 옆으로 절개를 한 다음 갈비뼈의 가장 낮은 가장자리를 따라 절개를 계속합니다. 왼쪽 신장을 확인하고 신장이 황백색으로 변할 때까지 PBS로 역류합니다. 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 수술 가위로 절단하여 신장을 제거하고 페트리 접시에 넣은 다음 PBS로 조심스럽게 씻으신다.수술 가위와 핀셋으로 신장을 약 10밀리그램 샘플로 자르고 신장의 각 조각을 자체 1.5 밀리리터 미세 센트심분리기 튜브에 넣고 튜브의 캡을 닫습니다. 실리콘 균질화에 신장 샘플을 넣고 페닐 / 구아니딘 기반 용액 시약의 700 마이크로 리터를 추가합니다. 신장 샘플에 대해 균질화제의 봉헌을 천천히 누르고 비틀어 균질화합니다.샘플이 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 누르고 비틀기 반복합니다. 시료를 균질화하기 위해 균질화된 용재를 생체 폴리머 스핀 컬럼으로 옮기고 3분 동안 14, 000회 G로 회전한 다음 침전된 용액을 사용하지 않은 1.5밀리리터 미세원심분리튜브로 이송한다. 튜브에 140 마이크로리터의 클로로폼을 결합하고 튜브를 단단히 덮습니다.lysate와 클로로폼을 혼합하려면 튜브를 15 번 반전시하십시오. 실온에서 2~3분 동안 샘플을 배양한 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000배 G로 회전합니다. 침전을 방해하지 않고, 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상체를 전송하고, 100 % 에탄올의 1.5 배를 추가합니다.혼합물을 5초 동안 소용돌이시다. 2밀리리터 수집 튜브의 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 시료 700 마이크로리터를 적재합니다. 컬럼 캡을 닫고 컬럼을 15, 000회 G로 15초 간 돌린 다음 수집 튜브에 침전된 용액을 버리십시오.2밀리리터 수집 튜브의 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 700 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하여 샘플을 철저히 세척하십시오. 그런 다음 원심 분리를 반복하고 수집 튜브를 버리십시오. 워시 당 2 개의 세척 버퍼 500 마이크로 리터로 두 번 세척을 반복하십시오.마지막 세척 후 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 15, 000회 G에서 1분 동안 000회 회전하고 침전된 용액을 버리십시오. 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮킵니다. 총 RNA를 컬럼에 RNase 가 없는 물 30마이크로리터를 추가하여 녹이고 컬럼 캡을 닫고 실온에서 5분간 둡니다.그런 다음 1분 동안 15, 000회 G로 컬럼을 회전시합니다. 총 RNA를 함유한 샘플을 얼음 위에 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고, 분광광법에 의한 총 RNA의 농도를 측정한다. 원고 방향에 따라 마스터 믹스 솔루션을 준비하고 8웰 튜브 스트립의 각 튜브에 8 개의 마이크로 리터를 추가하십시오.총 RNA 밀도를 조정한 후, 각 튜브에 총 RNA의 12 마이크로리터 알리쿼트를 배치하고 캡을 닫습니다. 튜브를 15초 동안 원심분리합니다. 튜브를 온도 순환기에 넣고 섭씨 37도에서 60 분 동안 배양하십시오.완료되면, 즉시 cDNA의 합성을 위해 섭씨 95도에서 5 분 동안 배양하십시오. cDNA를 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 증류수로 10회 희석합니다. 소용돌이와 원심분리기를 5초 동안 튜브에 대고 텍스트 원고에 설명된 대로 정량적 실시간 PCR을 수행합니다.이 프로토콜은 20~25그램의 8주된 수컷 마우스에서 좌측 요관 결찰을 통해 일방적인 요도 방해 마우스 모델을 만드는 데 사용되었다. 우레는 4-0 실크 봉합사로 더블 리그에 완전히 막혀 있었다. 신장은 수술 후 8 일 에서 수집되었다.microRNA qRT-PCR 데이터는 마이크로RNA 3070-3p의 수준이 현저하게 증가하고 마이크로RNA, 7218-5p 및 microRNA 7219-5p의 수준이 대조군과 비교하여 UUO 마우스의 신장에서 감소되었다는 것을 나타냈다. 이 프로토콜을 시도할 때, 좋은 RNA 추출을 달성하기 위하여 페닐/구아니딘 기지를 둔 용해 시약에 완전히 용해될 때까지 신장 견본을 비틀기 반복하는 것을 기억하십시오.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

연구

유전학

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

대체 사전 mRNA 접합 교 잡 시험 현장에서 RNA를 사용 하 여 마우스 뇌 섹션에서의 정량 분석

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

식물의 MicroRNA 전사체를 정확하고 효율적으로 분석하는 생물정보학 파이프라인

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...