Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Vi takker Michelle Goody, PhD, fra Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) for redigering av et utkast til dette manuskriptet.

Alle dyre eksperimentelle protokoller ble godkjent av Animal Ethics Committee of Jichi Medical University og ble utført i samsvar med bruk og omsorg for eksperimentelle dyr retningslinjer fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Sham kirurgi
<ol><li>Forbered følgende elementer: isofluran, korkark, hårfjerningskrem, laboratorieservietter, petriskål med fosfatbufret saltvann (PBS), 4-0 nylon, pinsett, kirurgisk saks, bomullspinner og 8 uker gamle C57BL/6 hannmus.</li>
...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

Ovennevnte protokoll med qRT-PCR klarte å bestemme uttrykksnivåene for de målrettede miRNAene. Vurderingen av ekstraherte miRNAs er viktig når man søker å få meningsfulle qRT-PCR-data, og for å bekrefte kvaliteten på miRNAs før du utfører qRT-PCR, bør forholdet mellom absorbans ved 260 nm til det ved 280 nm kontrolleres med et spektrofotometer. Hvis en enkelt PCR-forsterkning av forventet lengde og smeltetemperatur eller en monomodale smeltekurve ikke kan oppnås ved qRT-PCR, kan det være DNA-kontaminering e...

MicroRNAs (miRNAs) - de korte, ikke-koding RNA som forårsaker nedbrytning og transkripsjonshemming av messenger RNA (mRNA)1 - har vist seg å regulere uttrykket av ulike mRNAs som har avgjørende roller i både fysiologi og sykdom (f.eks betennelse, fibrose, metabolske forstyrrelser og kreft). Noen av miRNAs kan derfor være kandidat nye biomarkører og terapeutiske mål for en rekke sykdommer2,3,4,5. Selv om miRNA uttrykk profiler i museorganer og vev inkludert hjerne, hjerte, lunge, lever, og nyre har blitt beskrevet6,7,8,9,10, det har ikke vært noen standard metoder for utvinning og evaluering av miRNAs i mus nyre med nyre interstitiell fibrose.
Vi har utformet en protokoll for pålitelig å rense og oppdage uttrykkene til miRNAer i nyrene til mus med nyre interstitiell fibrose. Protokollen innebærer fem hovedtrinn, som følger. (1) 8 uker gamle C57BL/6 hannmus er delt inn i grupper av mus som gjennomgår en sham-operasjon (kontroller) og mus som blir utsatt for en operasjon som gir ensidig ureteral obstruksjon (UUO), som er knyttet til nyre interstitiell fibrose. (2) Nyreprøver ekstraheres fra sham og UUO mus, homogenisert separat i en silisium homogenisator, og deretter overført til en biopolymer-shredding system på en microcentrifuge spinnkolonne 11,12. (3) Den totale RNA som inneholder miRNA ekstraheres fra nyreprøvene av en silikamembranbasert spinnkolonne12,,13. (4) Ved hjelp av denne ekstraherte totale RNA, komplementære DNA (cDNA) syntetiseres fra den totale RNA med bruk av omvendt transkripsjon, poly (A) polymerase, og oligo-dT primer14,15. (5) Uttrykkene for miRNA-er evalueres ved kvantitativ reverstranskripsjonpolymerasekjedereaksjon (qRT-PCR) ved hjelp av et intercalatingfargestoff 14,15.
Denne protokollen er basert på undersøkelser som fikk meningsfulle utvinninger og evalueringer av miRNAs i en rekke vev11,12,13,14,15,og biopolymer-shredding systemet som brukes i protokollen ble vist å rense høy kvalitet, totalt RNA fra vev i 200612. I tillegg har tidligere studier bekreftet nøyaktigheten og følsomheten til aspekter av protokollen (det vil si cDNA-syntesen med omvendt transkripsjonase, poly(A) polymerase og oligo-dT primere fra ekstrahert total RNA) for bestemmelse av miRNA-uttrykk ved qRT-PCR med et intercalatingfargestoff 14,15. Siden den nye protokollen har fordelene med enkelhet, tidsbesparende og reduksjon av tekniske feil, kan protokollen brukes i forskning som krever nøyaktig og sensitiv identifikasjon av miRNA-profilen i musenyre. Videre kan protokollen brukes på undersøkelser av mange patologiske forhold.
Vi beskriver deretter fastsettelsen av miRNA-uttrykksprofilene hos mus med UUO, som er knyttet til nyreinterstitiell fibrose. Hos mennesker er nyre interstitiell fibrose et vanlig og viktig trekk ved både kronisk nyresykdom og terminal nyresykdom, uavhengig av deres etiologi16,17. Denne nyre interstitielle fibrose er forbundet med utviklingen av nyresvikt, og det er preget av økte uttrykk for ekstracellulære matrisekomponenter i interstitielle rom (f.eks kollagen, fibronectin og α-glatt muskel actin)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNAs (miRNAs) er enkelt strandet, ikke-koding RNA molekyler som vanligvis regulerer genuttrykk på post-transkripsjonsnivå ved å binde til delvis komplementære målsteder i 3 'uoversettet region (UTR) av messenger RNA (mRNA), noe som reduserer mRNA oversettelse og stabilitet. MiRNA-uttrykksprofilene i ulike organer og vev av mus har blitt undersøkt, men standardmetoder for rensing og kvantifisering av miRNA i musenyre har ikke vært tilgjengelige. Vi har etablert en effektiv og pålitelig metode for å trekke ut og evaluere miRNA-uttrykk i musenyre med nyreinterstitiell fibrose ved kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR). Protokollen krevde fem trinn: (1) opprettelse av sham og ensidige ureterale obstruksjon (UUO) mus; (2) ekstraksjon av nyreprøver fra UUO-musene; (3) ekstraksjon av total RNA, som inkluderer miRNA, fra nyreprøvene; (4) komplementær DNA (cDNA) syntese med omvendt transkripsjon fra miRNA; og (5) qRT-PCR ved hjelp av cDNA. Ved hjelp av denne protokollen, vi vellykket bekreftet at sammenlignet med kontrollene, uttrykket av miRNA-3070-3p ble betydelig økt og de av miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p ble betydelig redusert i nyrene av en musemodell av nyre interstitiell fibrose. Denne protokollen kan brukes til å bestemme miRNA-uttrykket i nyrene til mus med UUO.

En UUO-musemodell ble opprettet av venstre ureteral ligation som beskrevet21 i 8 uker gamle hannmus som veier 20–25 g. Ureters ble helt hindret av dobbel ligation med 4-0 silkesuturer. Et smertestillende (meloksikam 5 mg/kg, subkutan injeksjon) ble administrert før operasjonen og også daglig på 2 dager etter operasjonen. Ved 8 dager etter operasjonen ble nyrene samlet inn, skylt med PBS, dissekert og lagret i flytende nitrogen for videre analyse. Sham-opererte mus fungerte som kontroller. Den...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Vi beskriver en metode for evaluering av microRNA-uttrykket i nyrene til mus med ensidig ureteral obstruksjon (UUO) ved kvantitativ omvendt transkripsjon polymerasekjedereaksjon. Denne protokollen er egnet for å studere nyremikroRNA uttrykkprofiler hos mus med UUO og i sammenheng med andre patologiske forhold.

Kvantitativ real-time PCR evaluering av microRNA uttrykk i mus nyre med ensidig ureteral obstruksjon

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Denne metoden gjør det mulig å gi microRNA-uttrykk i nyrer av mus med et bredt spekter av patologiske forhold, for eksempel nyrefibrose. Den største fordelen med denne teknikken er at det gjør det mulig for microRNA uttrykk profilering med høy nøyaktighet og følsomhet ved hjelp av en enkel prosess som sparer tid og forhindrer teknisk feil. For å utføre sham kirurgi, bruk kirurgisk saks og pinsett for å gjøre et snitt i huden på magen og kutte muskel og bukhinneme fra blæren til venstre nedre kant av ribbeina.Fukt to bomullspinner med PBS og trekk forsiktig tarmene til siden. Plasser de fuktede vattpinnene for å identifisere venstre nyre og uriner. Lukk peritonealmembranen og deretter snittet med 4-0 nylon.For å utføre den ensidige urinrøret obstruksjon, eller UUO, gjøre et snitt i huden på magen og kutte muskel og peritoneal membran som demonstrert for sham kirurgi. Plasser en 2,5 ml sprøyte under musen. Fukt to bomullspinner med PBS, trekk deretter tarmene forsiktig til siden med pinsettene og plasser vattpinnene for å identifisere venstre ureter.Bruk pinsettene til å løfte venstre nyre. Bruk 4-0 silke til å ligate venstre ureter på to steder omtrent en centimeter fra hverandre. Klipp urineren i midten av de to ligasjonene og bruk deretter 4-0 nylonsuturer for å lukke bukhinnen og snittet.Etter å ha kuttet peritonealmembranen, som tidligere demonstrert, løft den med pinsett og bruk kirurgisk saks for å lage et sidelengs snitt på øvre kant, og fortsett deretter snittet langs den laveste kanten av ribbeina. Identifiser venstre nyre og refluks den med PBS til nyrene blir gulhvite. Fjern nyrene ved å kutte venstre nyrearterie og vene med kirurgisk saks og legg den i en petriskål, vask den deretter forsiktig med PBS.Skjær nyrene i ca 10 mg prøver med kirurgisk saks og pinsett, legg hvert stykke nyre i sitt eget 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør og lukk rørets hette. Sett en nyreprøve i silikonhomogenisatoren og tilsett 700 mikroliter av en fenyl/guanidinbasert lysisreagens. Trykk langsomt og vri homogenisatorens pestle mot nyreprøven for å homogenisere den.Gjenta trykkingen og vridningen til prøven er fullstendig oppløst i lysisreagensen. For ytterligere å homogenisere prøven, overfør den homogeniserte lysate til biopolymerspinsøylen og spinn den ved 14 000 ganger G i tre minutter, og overfør deretter det utfelte lysatet til et ubrukt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Kombiner lysatet i røret med 140 mikroliter kloroform og hette røret tett.For å blande lysate og kloroform, inverter røret 15 ganger. Inkuber prøvene i to til tre minutter ved romtemperatur, og spinn dem deretter ved 12 000 ganger G i 15 minutter ved fire grader Celsius. Uten å forstyrre bunnspranget, overfør det overnaturlige til et nytt 1,5-milliliter mikrocentrifugerør, og legg til 1,5 ganger volumet på 100% etanol.Vortex blandingen i fem sekunder. Legg 700 mikroliter av prøven på en membran-forankret spin kolonne i en to-milliliter oppsamlingsrør. Lukk kolonnehetten og spinn kolonnen med 15 000 ganger G i 15 sekunder, og kast deretter det utfelte lysatet i oppsamlingsrøret.Vask prøven grundig ved å legge til 700 mikroliter vaskebuffer en til membranankret spinkolonne i et to milliliter oppsamlingsrør. Gjenta deretter sentrifugeringen og kast oppsamlingsrøret. Gjenta vasken to ganger med 500 mikroliter vaskebuffer to per vask.Etter siste vask spinner du den membrananerte spin-kolonnen i et to milliliter oppsamlingsrør ved 15 000 ganger G i ett minutt og kaster bort det utfelte lysatet. Overfør den membran-forankrede spinnkolonnen til et nytt 1,5-milliliter rør. Oppløs den totale RNA ved å legge til 30 mikroliter RNase-fritt vann til kolonnen, lukk kolonnehetten og la det stå i fem minutter ved romtemperatur.Deretter spinner du kolonnen med 15 000 ganger G i ett minutt. Overfør prøven som inneholder totalt RNA til et nytt mikrocentrifugerør på is, og mål konsentrasjonen av total RNA ved spektrometri. Forbered en master mix løsning i henhold til manuskriptet retninger og legge åtte mikroliter til hvert rør av en åtte-brønns tube stripe.Etter justering av den totale RNA-tettheten, plasser en 12-mikroliter aliquot av total RNA i hvert rør og lukk hetten. Sentrifuger rørene i 15 sekunder. Sett rørene i termocycler og inkuber dem i 60 minutter ved 37 grader Celsius.Når du er ferdig, umiddelbart inkubere dem i fem minutter ved 95 grader Celsius for syntesen av cDNA. Overfør cDNA til et nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og fortynne det 10 ganger med destillert vann. Vortex og sentrifuger røret i fem sekunder, og utfør deretter kvantitativ sanntids-PCR, som beskrevet i tekstmanuskriptet.Denne protokollen ble brukt til å lage en ensidig urinveis obstruksjon mus modell via venstre ureteral ligation i åtte uker gamle hannmus som veier 20 til 25 gram. Ureters ble helt hindret av dobbel ligation med 4-0 silkesuturer. Nyrene ble samlet inn ved åtte dager etter operasjonen.MicroRNA qRT-PCR-dataene indikerte at nivået av microRNA 3070-3p ble betydelig økt og nivåene av microRNA, 7218-5p og microRNA 7219-5p ble redusert i nyrene til UUO-musene sammenlignet med kontrollene. Når du prøver denne protokollen, husk å gjenta vridning nyreprøven til den er fullstendig oppløst i fenyl / guanidin-basert lysis reagens for å oppnå en god RNA ekstraksjon.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Sammenslåing absolutt og relativ Kvantitativ PCR data for å kvantifisere Stat3 spleisevariant Avskrifter

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Villtype Blokkering PCR Kombinert med direkte sekvensering som en svært følsom metode for påvisning av lavfrekvent somatiske mutasjoner

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Påvisning av mikroRNA-ekspresjon i peritonealt membran av rotter ved bruk av kvantitativ sanntids-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemisk levering av MicroRNA ved hjelp av rekombinant Adeno-assosiert Virus Serotype 9 til å behandle Neuromuscular sykdommen i gnagere

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Toveis retroviral integrasjonssted PCR-metodikk og kvantitativ dataanalyse arbeidsflyt

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Analyse i sanntid av transkripsjon faktor bindende, transkripsjon, oversettelse og omsetning vise globale hendelser under aktivering

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analyse av Alternative Pre-mRNA skjøting i musen hjernen inndelinger ved hjelp av RNA i Situ hybridisering analysen

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

En in vitro-protokoll for evaluering av MicroRNA nivåer, funksjoner og assosierte mål gener i tumor celler

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-basert konkurransedyktig indeks for høy-produksjon analyse av Anvendelighet inne Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

En bioinformatikk rørledning til nøyaktig og effektivt analysere MicroRNA Transcriptomes i planter

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...