Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Agradecemos a Michelle Goody, PhD, do Grupo Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) por editar um rascunho deste manuscrito.

Todos os protocolos experimentais animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Jichi Medical University e foram realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Guia da Universidade Médica jichi para animais de laboratório.
1. A falsa cirurgia
<ol><li>Prepare os seguintes itens: isoflurane, folha de cortiça, creme depilatório, lenços umedecidos de laboratório, placa de Petri com soro fisco tamponado de fosfato (PBS), 4-0 nylon, pinças, te...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

O protocolo acima descrito com qRT-PCR determinou com sucesso os níveis de expressão dos miRNAs direcionados. A avaliação das miRNAs extraídas é importante na busca de obter dados significativos de qRT-PCR, e a fim de confirmar a qualidade dos miRNAs antes de realizar o qRT-PCR, a razão de absorção em 260 nm para que em 280 nm deve ser verificada com um espectótmetro. Se uma única amplificação pcr do comprimento esperado e temperatura de fusão ou uma curva de fusão monomodal não pode ser obtida por qRT-PC...

MicroRNAs (miRNAs) — os RNAs curtos e não codificados que causam a degradação e inibição transcricional do RNA mensageiro (mRNA)1 — têm mostrado regular a expressão de vários mRNAs que têm papéis cruciais tanto na fisiologia quanto na doença (por exemplo, inflamação, fibrose, distúrbios metabólicos e câncer). Alguns dos miRNAs podem, portanto, ser novos biomarcadores candidatos e alvos terapêuticos para uma variedade de doenças2,3,,4,5. Embora os perfis de expressão do miRNA em órgãos e tecidos do camundongo, incluindo cérebro, coração, pulmão, fígado e rim tenham sido descritos6,7,8,9,10, não houve métodos padrão para a extração e avaliação de miRNAs em rim de camundongo com fibrose intersticial renal.
Nós projetamos um protocolo para purificar e detectar de forma confiável as expressões de miRNAs nos rins de camundongos com fibrose interstícia renal. O protocolo envolve cinco etapas principais, da seguinte forma. (1) Camundongos machos C57BL/6 de 8 semanas de idade são divididos em grupos de camundongos submetidos a uma operação falsa (controles) e camundongos submetidos a uma cirurgia que fornece obstrução ureteral unilateral (UUO), que está ligada à fibrose intersticial renal. (2) As amostras de rim são extraídas dos camundongos sham e UUO, homogeneizadas separadamente em um homogeneizador de silício e, em seguida, transferidas para um sistema de trituração de biopolímeros em uma coluna de spin de microcentrifuuge11,,12. (3) O RNA total contendo miRNA é extraído das amostras de rim por uma coluna de spin baseada em membrana sílica12,13. (4) Utilizando este RNA total extraído, o DNA complementar (cDNA) é sintetizado a partir do RNA total com o uso de transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primer oligo-dT14,15. (5) As expressões de miRNAs são avaliadas pela reação quantitativa da cadeia de polimerase de transcrição reversa (qRT-PCR) utilizando um corante intercalante14,15.
Este protocolo baseia-se em investigações que obtiveram extrações significativas e avaliações de miRNAs em uma variedade de tecidos11,,12,,13,,14,15, e o sistema de trituração de biopolímeros utilizado no protocolo foi mostrado para purificar RNA total de alta qualidade dos tecidos em 200612. Além disso, estudos anteriores confirmaram a exatidão e sensibilidade dos aspectos do protocolo (ou seja, a síntese de cDNA com transcriptase reversa, poli(A) polimerase e primers oligo-dT do RNA total extraído) para a determinação da expressão miRNA por qRT-PCR com um corante intercalante14,15. Como o novo protocolo tem as vantagens da simplicidade, economia de tempo e redução de erros técnicos, o protocolo pode ser usado em pesquisas que exigem a identificação precisa e sensível do perfil miRNA no rim do rato. Além disso, o protocolo poderia ser aplicado a investigações de muitas condições patológicas.
Em seguida, descrevemos a determinação dos perfis de expressão miRNA em camundongos com UUO, que está ligado à fibrose intersticial renal. Em humanos, a fibrose intersticial renal é uma característica comum e importante tanto da doença renal crônica quanto da doença renal em estágio terminal, independentemente de sua etiologia16,17. Esta fibrose intersticial renal está associada à progressão da insuficiência renal, e é caracterizada pelo aumento das expressões de componentes da matriz extracelular nos espaços intersticiais (por exemplo, colágeno, fibronectina e actina muscular α suave)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA não codificadas e não codificadas que normalmente regulam a expressão genética no nível pós-transcricional, vinculando-se a locais-alvo parcialmente complementares na região não traduzida (UTR) de RNA mensageiro (mRNA), o que reduz a tradução e estabilidade do mRNA. Os perfis de expressão miRNA em vários órgãos e tecidos de camundongos foram investigados, mas métodos padrão para a purificação e quantificação do miRNA no rim de camundongos não estão disponíveis. Estabelecemos um método eficaz e confiável para extrair e avaliar a expressão miRNA no rim do rato com fibrose intersticial renal por reação quantitativa de cadeia de polimerase de transcrição reversa (qRT-PCR). O protocolo exigia cinco etapas: (1) criação de camundongos de obstrução ureteral falsa e unilateral (UUO); (2) extração de amostras de rins dos camundongos UUO; (3) extração do RNA total, que inclui miRNA, a partir das amostras de rim; (4) síntese complementar de DNA (cDNA) com transcrição reversa do miRNA; e (5) qRT-PCR utilizando o cDNA. Usando este protocolo, confirmamos com sucesso que, em comparação com os controles, a expressão de miRNA-3070-3p foi significativamente aumentada e as de miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p foram significativamente diminuídas nos rins de um modelo de camundongo de fibrose interstícia renal. Este protocolo pode ser usado para determinar a expressão miRNA nos rins de camundongos com UUO.

Um modelo de rato UUO foi criado por ligadura ureteral esquerda, como descrito21 em camundongos machos de 8 semanas de idade pesando 20-25 g. Os ureteres foram completamente obstruídos por ligadura dupla com suturas de seda 4-0. Um analgésico (meloxicam 5 mg/kg, injeção subcutânea) foi administrado antes da cirurgia e também diariamente nos 2 dias pós-cirurgia. Aos 8 dias após a cirurgia, foram coletados rins, enxaguados com PBS, dissecados e armazenados em nitrogênio líquido para análi...

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Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Descrevemos um método para avaliar a expressão de microRNA nos rins de camundongos com obstrução ureteral unilateral (UUO) por reação quantitativa em cadeia de polimerase de transcrição reversa. Este protocolo é adequado para estudar perfis de expressão de microRNA renal em camundongos com UUO e no contexto de outras condições patológicas.

Avaliação quantitativa de PCR em tempo real de expressões de microRNA no rim do rato com obstrução ureteral unilateral

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Este método permite fornecer expressão de microRNA em rins de camundongos com uma ampla gama de condições patológicas, como a fibrose renal. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o perfil de expressão microRNA com alta precisão e sensibilidade usando um processo simples que economiza tempo e previne erros técnicos. Para realizar a falsa cirurgia, use tesoura cirúrgica e pinça para fazer uma incisão na pele no abdômen e cortar a membrana muscular e peritoneal da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas.Umedeça dois cotonetes de algodão com PBS e puxe cuidadosamente os intestinos para o lado. Coloque os cotonetes umedecidos para identificar o rim esquerdo e o ureter. Feche a membrana peritoneal e, em seguida, a incisão com 4-0 nylon.Para realizar a obstrução uretral unilateral, ou UUO, faça uma incisão na pele no abdômen e corte a membrana muscular e peritoneal como demonstrado para a cirurgia falsa. Coloque uma seringa de 2,5 mililitros debaixo do mouse. Umedeça dois cotonetes de algodão com PBS, depois puxe os intestinos cuidadosamente para o lado com a pinça e coloque os cotonetes para identificar o ureter esquerdo.Use a pinça para levantar o rim esquerdo. Use 4-0 de seda para ligar o ureter esquerdo em dois lugares com aproximadamente um centímetro de distância. Corte o ureter no ponto central das duas ligaduras e, em seguida, use suturas de nylon 4-0 para fechar a membrana peritoneal e incisão.Depois de cortar a membrana peritoneal, como demonstrado anteriormente, levante-a com pinças e use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão lateral na borda superior, em seguida, continuar a incisão ao longo da borda mais baixa das costelas. Identifique o rim esquerdo e refluxeá-lo com PBS até que o rim fique amarelo-branco. Remova o rim cortando a artéria renal esquerda e a veia com a tesoura cirúrgica e coloque-o em uma placa de Petri, em seguida, lave-o cuidadosamente com PBS.Corte o rim em aproximadamente 10 miligramas de amostras com a tesoura cirúrgica e a pinça, coloque cada pedaço do rim em seu próprio tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e feche a tampa do tubo. Coloque uma amostra de rim no homogeneizador de silicone e adicione 700 microliters de um reagente de lise à base de fenil/guanidina. Pressione lentamente e torça o pilão do homogeneizador contra a amostra de rim para homogeneizá-lo.Repita a prensagem e a torção até que a amostra esteja completamente dissolvida no reagente de lise. Para homogeneizar ainda mais a amostra, transfira o lise homogeneizado para a coluna de rotação biopolímera e gire-a a 14.000 vezes G por três minutos, depois transfira o lysato precipitado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro nãoutilizado. Misture o lise no tubo com 140 microliters de clorofórmio e tampe o tubo firmemente.Para misturar o liseto e o clorofórmio, inverta o tubo 15 vezes. Incubar as amostras por dois a três minutos em temperatura ambiente, depois gire-as a 12.000 vezes G por 15 minutos a quatro graus Celsius. Sem perturbar o precipitado, transfira o supernascer para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro, e adicione 1,5 vezes seu volume de 100% de etanol.Vórtice a mistura por cinco segundos. Carregue 700 microliters da amostra em uma coluna de spin ancorada em membrana em um tubo de coleta de dois mililitros. Feche a tampa da coluna e gire a coluna a 15.000 vezes G por 15 segundos, depois jogue fora o lise precipitado no tubo de coleta.Lave bem a amostra adicionando 700 microliters de tampão de lavagem um na coluna de giro ancorado na membrana em um tubo de coleta de dois mililitros. Em seguida, repita a centrifugação e jogue fora o tubo de coleta. Repita a lavagem duas vezes com 500 microliters de tampão de lavagem dois por lavagem.Após a última lavagem, gire a coluna de giro ancorada em membrana em um tubo de coleta de dois mililitros a 15.000 vezes G por um minuto e jogue fora o lise precipitado. Transfira a coluna de giro ancorada na membrana para um novo tubo de 1,5 mililitro. Dissolva o RNA total adicionando 30 microliters de água sem RNase à coluna, feche a tampa da coluna e deixe-a por cinco minutos em temperatura ambiente.Em seguida, gire a coluna a 15.000 vezes G por um minuto. Transfira a amostra contendo RNA total para um novo tubo de microcentrifuuge no gelo, e meça a concentração de RNA total por espectrofotometria. Prepare uma solução de mistura mestre de acordo com as instruções do manuscrito e adicione oito microliters a cada tubo de uma tira de tubo de oito poços.Depois de ajustar a densidade total de RNA, coloque uma alíquota de 12 microliter de RNA total em cada tubo e feche a tampa. Centrifugar os tubos por 15 segundos. Coloque os tubos no termociclador e incuba-os por 60 minutos a 37 graus Celsius.Quando terminar, incuba-os imediatamente por cinco minutos a 95 graus Celsius para a síntese de cDNA. Transfira o cDNA para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e dilui-o 10 vezes com água destilada. Vórtice e centrífuga do tubo por cinco segundos, em seguida, executar PCR quantitativo em tempo real, como descrito no manuscrito do texto.Este protocolo foi usado para criar um modelo unilateral de rato de obstrução uretral através de ligadura ureteral esquerda em camundongos machos de oito semanas de idade pesando de 20 a 25 gramas. Os ureteres foram completamente obstruídos por ligadura dupla com suturas de seda 4-0. Os rins foram coletados aos oito dias após a cirurgia.Os dados do microRNA qRT-PCR indicaram que o nível de microRNA 3070-3p foi significativamente aumentado e os níveis de microRNA, 7218-5p e microRNA 7219-5p foram diminuídos nos rins dos camundongos UUO em comparação com os controles. Ao tentar este protocolo, lembre-se de repetir torção da amostra de rim até que ela seja completamente dissolida em reagente de lise à base de fenil/guanidina para obter uma boa extração de RNA.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Mesclando Absoluto e dados relativos PCR quantitativo para quantificar STAT3 Splice Variant Transcrições

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Genética

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

De tipo selvagem Bloqueio de PCR combinada com sequenciação directa como um método altamente sensível para a detecção de Baixa Frequência mutações somáticas

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detecção da expressão de microRNA na Membrana Peritoneal de Ratos Usando PCR Quantitativa em Tempo Real

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Entrega sistêmica de MicroRNA utilizando vírus Adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Análise em tempo real do fator de transcrição, ligação, transcrição, tradução e volume de negócios para exibir eventos globais durante a ativação celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Um pipeline de bioinformática para analisar com precisão e eficiência os transcriptomas de MicroRNA em plantas

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...