Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Мы благодарим Мишель Гуди, доктора философии, из Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) за редактирование проекта этой рукописи.

Все экспериментальные протоколы для животных были одобрены Комитетом по этике животных Медицинского университета Джити и были выполнены в соответствии с руководящими принципами использования и ухода за экспериментальными животными из руководства Медицинского университета Джичи д?...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

Вышеупомянутый протокол с qRT-PCR успешно определил уровни выражения целевых миРНК. Оценка извлеченных миРНК имеет важное значение при поиске значимых данных qRT-PCR, и для того, чтобы подтвердить качество миРНК перед выполнением qRT-PCR, соотношение поглощения на 260 нм к 280 нм должно быть провер...

МикроРНК (миРНК) - короткие, некодирующие РНК, которые вызывают деградацию и транскрипционные ингибирование РНК-мессенджера (мРНК)1 - регулируют выражение различных РНК, которые играют решающую роль как в физиологии, так и в заболеваниях (например, воспаление, фиброз, нарушения обмена веществ и рак). Некоторые из miRNAs поэтому может быть кандидатом новых биомаркеров и терапевтическихцелей для различных заболеваний 2,,3,,4,,5. Хотя профили экспрессии миРНК в органах и тканях мыши, включая мозг, сердце, легкие,печень и почки, были описаны 6,,7,,8,,9,,10,не было никаких стандартных методов для извлечения и оценки миРНК в почках мыши с почечным интерстициальным фиброзом.
Мы разработали протокол для надежной очистки и обнаружения выражений миРНК в почках мышей с почечным интерстициальным фиброзом. Протокол включает в себя пять основных шагов, следующим образом. (1) 8-недельные мыши C57BL/6 разделены на группы мышей, которые проходят фиктивную операцию (контроль) и мышей, которые подвергаются операции, обеспечивающей одностороннее мочеточник (UUO), которая связана с почечным интерстициальным фиброзом. (2) Образцы почек извлекаются из фиктивных и UUO мышей, гомогенизированы отдельно в кремниевом гомогенизаторе, а затем передаются в биополимерную систему измельчения на микроцентрифуге спинаколонки 11,12. (3) Общая РНК, содержащая миРНК извлекается из образцов почек кремнеземной мембраны на основеспина колонке 12,13. (4) Используя эту извлеченную общую РНК, комплементарная ДНК (cDNA) синтезируется из общей РНК с использованием обратной транскриптазы, поли(A) полимеразы и олиго-ДТгрунтовки 14,15. (5) Выражения миРНК оцениваются по количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) с использованием интеркалирующегокрасителя 14,,15.
Этот протокол основан на исследованиях, которые получили значимые извлечения и оценки miRNAs вразличных тканях 11,12,13,14,15,и биополимер-измельчения системы, используемой в протоколе было показано, чтобы очистить высококачественные, общая РНК из тканей в 2006году 12. Кроме того, предыдущие исследования подтвердили точность и чувствительность аспектов протокола (т.е. синтез кДНК с обратной транскриптазой, поли(А) полимеразой и олиго-ДТ праймерами из извлеченной общей РНК) для определения экспрессии миРНК по qRT-PCR с интеркалирующимкрасителем 14,,15. Поскольку новый протокол имеет преимущества простоты, экономии времени и уменьшения технических ошибок, протокол может быть использован в исследованиях, которые требуют точной и чувствительной идентификации профиля miRNA в почках мыши. Кроме того, протокол может быть применен к исследованиям многих патологических состояний.
Затем мы описываем определение профилей экспрессии miRNA у мышей с UUO, который связан с почечным интерстициальным фиброзом. У людей, почечный интерстициальный фиброз является общей и важной особенностью как хронических заболеваний почек и почечной болезни конечной стадии, независимо от ихэтиологии 16,17. Этот почечный интерстициальный фиброз связан с прогрессированием почечной недостаточности, и характеризуется повышенными проявлениями внеклеточных матричных компонентов в интерстициальных пространствах (например, коллагена, фибронектина и α-гладкого мышечного актина)17,,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

МикроРНК (миРНК) являются одиночными мель, некодирующие молекулы РНК, которые обычно регулируют экспрессию генов на посттранскриптном уровне путем связывания с частично взаимодополняющими целевыми объектами в 3' непереведенной области (UTR) РНК-мессенджера (мРНК), что снижает перевод и стабильность мРНК. Профили экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей были исследованы, но стандартные методы для очистки и количественной оценки миРНК в почках мыши не были доступны. Мы создали эффективный и надежный метод извлечения и оценки экспрессии миРНК в почках мыши с почечным интерстициальным фиброзом путем количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (qRT-PCR). Протокол требовал пяти этапов: (1) создание фиктивных и односторонних мочеточников (UUO) мышей; (2) извлечение образцов почек у мышей UUO; (3) извлечение общей РНК, которая включает в себя миРНК, из образцов почек; (4) дополнительный синтез ДНК (кДНК) с обратной транскрипцией из миРНК; и (5) qRT-PCR с использованием cDNA. Используя этот протокол, мы успешно подтвердили, что по сравнению с контролем, экспрессия miRNA-3070-3p была значительно увеличена и у миРНК-7218-5p и miRNA-7219-5p были значительно снижены в почках мыши модели почечного интерстициального фиброза. Этот протокол может быть использован для определения экспрессии миРНК в почках мышей с UUO.

Модель мыши UUO была создана левой мочегонной перевязки,как описано 21 в 8-недельный мышей мужского пола весом 20-25 г. Уретры были полностью затруднены двойной перевязкой с 4-0 шелковыми швами. Обезболивающее (мелоксикам 5 мг/кг, подкожная инъекция) вводили перед операцией, а такж...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Мы описываем метод оценки экспрессии микроРНК в почках мышей с односторонней мочеизъемной обструкцией (UUO) по количественной обратной транскрипции полимеразной цепной реакции. Этот протокол подходит для изучения профилей экспрессии микроРНК почек у мышей с UUO и в контексте других патологических состояний.

Количественная оценка ПЦР в реальном времени микроРНК выражений в мышеловой почки с односторонним мочеборным препятствием

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Этот метод позволяет обеспечить экспрессию микроРНК в почках мышей с широким спектром патологических состояний, таких как почечный фиброз. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет микроРНК экспрессии профилирования с высокой точностью и чувствительностью с помощью простого процесса, который экономит время и предотвращает техническую ошибку. Для выполнения фиктивной операции используйте хирургические ножницы и пинцет, чтобы сделать разрез в коже живота и сократить мышцы и брюшной мембраны от мочевого пузыря до левого нижнего края ребер.Смочите два ватных тампона с PBS и осторожно потяните кишечник в сторону. Поместите увлажненые тампоны для идентификации левой почки и мочеточника. Закройте перитонеальную мембрану, а затем разрез с 4-0 нейлона.Для выполнения односторонней уретальной обструкции, или UUO, сделать разрез в коже на животе и сократить мышцы и брюшной мембраны, как попродемонстрировано для фиктивной хирургии. Поместите 2,5-миллилитровый шприц под мышь. Смочите два ватных тампона с PBS, затем осторожно потяните кишечник в сторону с пинцетом и поместите тампоны для идентификации левого мочеточника.Используйте пинцет, чтобы поднять левую почку. Используйте 4-0 шелка, чтобы ligate левый мочеточник в двух местах примерно на один сантиметр друг от друга. Вырезать мочеточник в центральной точке двух лигов, а затем использовать 4-0 нейлоновых швов, чтобы закрыть брюшной мембраны и разрез.После резки брюшной мембраны, как было продемонстрировано ранее, поднимите его пинцетом и используйте хирургические ножницы, чтобы сделать боковой разрез на верхнем краю, а затем продолжить разрез вдоль самого низкого края ребер. Определите левую почку и рефлюкс его с PBS до тех пор пока почка не станет желто-белой. Удалите почку, разрезав левую почечную артерию и вену хирургическими ножницами и поместите ее в чашку Петри, затем тщательно промойте ее с помощью PBS.Разрежьте почку примерно на 10-миллиграммовые образцы хирургическими ножницами и пинцетом, положите каждый кусок почки в свою 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку и закройте крышку трубки. Положите образец почки в силиконовый гомогенизатор и добавьте 700 микролитров реагента на основе фенила/гуанидина. Медленно нажмите и поверните пестик гомогенизатора против образца почки, чтобы гомогенизировать его.Повторите нажатие и скручивание до тех пор, пока образец полностью не растворится в реагенте лиза. Для дальнейшей гомогенизации образца, передача гомогенизированного лизата в биополимер спина колонки и спина его на 14000 раз G в течение трех минут, а затем передать осажденный лизат в неиспользованные 1,5-миллилитровый микроцентрифуг трубки. Смешайте лизат в трубке со 140 микролитров хлороформа и крышка трубки плотно.Чтобы смешать лизат и хлороформ, инвертировать трубку 15 раз. Инкубировать образцы в течение двух-трех минут при комнатной температуре, а затем спина их на 12000 раз G в течение 15 минут при четырех градусах по Цельсию. Не нарушая осадка, перенесите супернатант в новую микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитров и добавьте в 1,5 раза ее объем в 100% этанола.Вихрь смеси в течение пяти секунд. Загрузите 700 микролитров образца на мембранную колонку в двухми миллилитровой трубке. Закройте крышку столбца и вращайте колонку 15 000 раз G в течение 15 секунд, а затем выбрось осажденный лисат в трубке сбора.Тщательно промыть образец, добавив 700 микролитров буфера мытья один к мембране якорь спина колонки в двухми миллилитровой трубки сбора. Затем повторите центрифугу и выбросит коллекторную трубку. Повторите мыть дважды с 500 микролитров мыть буфера два за стирку.После последней стирки, спина мембраны якорь спина колонки в двухми миллилитровую трубку сбора на 15000 раз G в течение одной минуты и выбросить осажденный лисат. Перенесите мембранную колонку спина в новую 1,5-миллилитровую трубку. Растворите общую РНК, добавив 30 микролитров воды без RNase к колонке, закройте крышку столбца и оставьте ее на пять минут при комнатной температуре.Затем вращай столбец 15 000 раз G в течение одной минуты. Перенесите образец, содержащий общую РНК, в новую микроцентрифуговую трубку на льду и измерьте концентрацию общей РНК с помощью спектрофотометрии. Подготовьте мастер-микст-решение в соответствии с рукописными указаниями и добавьте восемь микролитров к каждой трубе из восьми хорошо трубчатой полосы.После корректировки общей плотности РНК поместите 12-микролитер алицит общей РНК в каждую трубку и закройте крышку. Центрифуга труб в течение 15 секунд. Положите трубки в термоциклер и инкубировать их в течение 60 минут при 37 градусах по Цельсию.После завершения, немедленно инкубировать их в течение пяти минут при 95 градусов по Цельсию для синтеза cDNA. Перенесите cDNA в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку и разбавляют ее 10 раз дистиллированной водой. Vortex и центрифуга трубки в течение пяти секунд, а затем выполнить количественные ПЦР в режиме реального времени, как описано в тексте рукописи.Этот протокол был использован для создания односторонней урефальной модели обструкции мыши через левую мочегонное перевязку у восьминедельных мышей мужского пола весом от 20 до 25 граммов. Уретры были полностью затруднены двойной перевязкой с 4-0 шелковыми швами. Почки были собраны в восемь дней после операции.Данные microRNA qRT-PCR показали, что уровень микроРНК 3070-3p был значительно увеличен, а уровни микроРНК, 7218-5p и микроРНК 7219-5p были снижены в почках мышей UUO по сравнению с контролем. При попытке этого протокола, не забудьте повторить скручивания образца почки, пока он полностью растворяется в фенил / гуанидин основе лиза реагент для достижения хорошей экстракции РНК.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Слияние абсолютной и относительной количественной ПЦР данных для количественного определения Stat3 сплайсированный вариант Transcripts

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Дикого типа Блокирование ПЦР в сочетании с прямым секвенированием как высоко чувствительный метод обнаружения низкочастотных соматические мутации

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Обнаружение экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крыс с использованием количественной ПЦР в реальном времени

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Системные поставки микроРНК с использованием рекомбинантного аденоассоциированный вирус серотипа 9 для лечения нервно-мышечных заболеваний у грызунов

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Количественный анализ альтернативных пре мРНК сплайсинга в разделах мозга мыши, с помощью РНК в Situ гибридизация Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Протокол In Vitro для оценки уровней, функций и связанных с ними целевых генов в опухолевых клетках

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Цифровой ПЦР на основе конкурентного индекса для высокой пропускной способностью анализ фитнеса в сальмонелле

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Биоинформатика трубопровод точно и эффективно анализировать microRNA транскриптомы в растениях

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...