Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Agradecemos a Michelle Goody, PhD, del Grupo Edanz (https://en-author-services.edanzgroup.com/) por editar un borrador de este manuscrito.

Todos los protocolos experimentales de animales fueron aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las directrices de Uso y Cuidado de Animales Experimentales de la Guía de la Universidad Médica de Jichi para Animales de Laboratorio.
1. La cirugía falsa
<ol><li>Prepare los siguientes elementos: isoflurano, lámina de corcho, crema depilatoria, toallitas de laboratorio, plato de Petri con solución salina tamponada con fosfato...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

El protocolo descrito anteriormente con qRT-PCR determinó con éxito los niveles de expresión de los miRNAs de destino. La evaluación de los miRNAs extraídos es importante cuando se trata de obtener datos significativos de qRT-PCR, y con el fin de confirmar la calidad de los miRNAs antes de realizar el qRT-PCR, la relación de absorbancia a 260 nm a la que a 280 nm debe comprobarse con un espectrofotómetro. Si no se puede obtener una sola amplificación de PCR de la longitud esperada y la temperatura de fusión o un...

Se ha demostrado que los microRNAs (miRNAs) —los ARN cortos que no codifican que causan la degradación y la inhibición transcripcional del ARN mensajero (ARNM)1— regulan la expresión de varios ARNN que tienen funciones cruciales tanto en la fisiología como en la enfermedad (por ejemplo, inflamación, fibrosis, trastornos metabólicos y cáncer). Por lo tanto, algunos de los miRNAs pueden ser nuevos biomarcadores candidatos y dianas terapéuticas para una variedad de enfermedades2,3,4,5. Aunque se han descrito perfiles de expresión de miRNA en órganos y tejidos de ratón, incluyendo cerebro, corazón, pulmón, hígado y riñón6,7,8,9,10, no ha habido métodos estándar para la extracción y evaluación de miRNAs en riñón de ratón con fibrosis intersticial renal.
Hemos diseñado un protocolo para purificar y detectar de forma fiable las expresiones de miRNAs en los riñones de ratones con fibrosis intersticial renal. El protocolo implica cinco pasos principales, como se indica a continuación. (1) Los ratones macho C57BL/6 de 8 semanas de edad se dividen en grupos de ratones que se someten a una operación falsa (controles) y ratones sometidos a una cirugía que proporciona obstrucción ureteral unilateral (UUO), que está relacionada con la fibrosis intersticial renal. (2) Las muestras de riñón se extraen de los ratones falsos y UUO, se homogeneizan por separado en un homogeneizador de silicio y luego se transfieren a un sistema de trituración de biopolímeros en una columna de giro de microcentrífuga11,12. (3) El ARN total que contiene miRNA se extrae de las muestras de riñón mediante una columna de espín a base de membrana de sílice12,13. (4) Utilizando este ARN total extraído, el ADN complementario (ADNc) se sintetiza a partir del ARN total con el uso de transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa, y oligo-dT primer14,15. (5) Las expresiones de los miRNas se evalúan mediante una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR) utilizando un tinte intercalante14,15.
Este protocolo se basa en investigaciones que obtuvieron extracciones y evaluaciones significativas de miRNAs en una variedad de tejidos11,12,13,14,15, y el sistema de trituración de biopolímeros utilizado en el protocolo se demostró para purificar arnesón total de alta calidad de los tejidos en 200612. Además, estudios previos han confirmado la exactitud y sensibilidad de los aspectos del protocolo (es decir, la síntesis de ADNc con transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y las imprimaciones oligo-dT del ARN total extraído) para la determinación de la expresión de miRNA por qRT-PCR con un tinte intercalante14,15. Dado que el nuevo protocolo tiene las ventajas de la simplicidad, el ahorro de tiempo y la reducción de errores técnicos, el protocolo se puede utilizar en investigaciones que requieren la identificación precisa y sensible del perfil miRNA en el riñón del ratón. Además, el protocolo podría aplicarse a las investigaciones de muchas condiciones patológicas.
A continuación describimos la determinación de los perfiles de expresión de miRNA en ratones con UUO, que está relacionado con la fibrosis intersticial renal. En los seres humanos, la fibrosis intersticial renal es una característica común e importante tanto de la enfermedad renal crónica como de la enfermedad renal terminal, independientemente de su etiología16,17. Esta fibrosis intersticial renal se asocia con la progresión de la insuficiencia renal, y se caracteriza por el aumento de las expresiones de los componentes de la matriz extracelular en los espacios intersticiales (por ejemplo, colágeno, fibronectina y actina muscular α suave)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

Los microARNas (miRNA) son moléculas de ARN no codificantes de una sola cadena que normalmente regulan la expresión génica a nivel post-transcripción mediante la unión a sitios diana parcialmente complementarios en la región no traducida (UTR) de 3' de ARN mensajero (ARNm), lo que reduce la traducción y estabilidad del ARNm. Se han investigado los perfiles de expresión de miRNA en varios órganos y tejidos de ratones, pero no se han disponibles métodos estándar para la purificación y cuantificación del miRNA en el riñón de ratón. Hemos establecido un método eficaz y fiable para extraer y evaluar la expresión de miRNA en riñón de ratón con fibrosis intersticial renal mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (qRT-PCR). El protocolo requería cinco pasos: (1) creación de ratones falsos y unilaterales de obstrucción ureteral (UUO); (2) extracción de muestras de riñón de los ratones UUO; (3) extracción del ARN total, que incluye miRNA, de las muestras de riñón; (4) síntesis complementaria de ADN (ADNC) con transcripción inversa de miRNA; y (5) qRT-PCR utilizando el ADNc. Usando este protocolo, confirmamos con éxito que en comparación con los controles, la expresión de miRNA-3070-3p se incrementó significativamente y los de miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p se redujeron significativamente en los riñones de un modelo de ratón de fibrosis intersticial renal. Este protocolo se puede utilizar para determinar la expresión de miRNA en los riñones de ratones con UUO.

Un modelo de ratón UUO fue creado por ligadura ureteral izquierda como se describe21 en ratones macho de 8 semanas de edad que pesan 20-25 g. Los uréteres estaban completamente obstruidos por doble ligadura con 4-0 suturas de seda. Se administró un analgésico (meloxicam 5 mg/kg, inyección subcutánea) antes de la cirugía y también diariamente los 2 días posteriores a la cirugía. A los 8 días posteriores a la cirugía, los riñones se recogieron, enjuagaron con PBS, se diseccionaron y alm...

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Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Describimos un método para evaluar la expresión del microRNA en los riñones de ratones con obstrucción ureteral unilateral (UUO) mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa de transcripción inversa. Este protocolo es adecuado para el estudio de perfiles de expresión de microARN renal en ratones con UUO y en el contexto de otras condiciones patológicas.

Evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real de expresiones de microARN en riñón de ratón con obstrucción ureteral unilateral

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Este método permite proporcionar expresión de microARN en riñones de ratones con una amplia gama de afecciones patológicas, como la fibrosis renal. La principal ventaja de esta técnica es que permite el perfilado de expresiones de microARN con alta precisión y sensibilidad mediante el uso de un proceso simple que ahorra tiempo y evita errores técnicos. Para realizar la cirugía falsa, utilice tijeras quirúrgicas y pinzas para hacer una incisión en la piel en el abdomen y cortar el músculo y la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas.Humedezca dos hisopos de algodón con PBS y tire cuidadosamente de los intestinos hacia un lado. Coloque los hisopos humedecidos para identificar el riñón izquierdo y el uréter. Cierre la membrana peritoneal y luego la incisión con nylon 4-0.Para realizar la obstrucción uretral unilateral, o UUO, haga una incisión en la piel en el abdomen y corte el músculo y la membrana peritoneal como se demostró para la cirugía falsa. Coloque una jeringa de 2,5 mililitros debajo del ratón. Humedezca dos hisopos de algodón con PBS, luego tire de los intestinos cuidadosamente hacia un lado con las pinzas y coloque los hisopos para identificar el uréter izquierdo.Use las pinzas para levantar el riñón izquierdo. Use 4-0 de seda para ligar el uréter izquierdo en dos lugares de aproximadamente un centímetro de distancia. Corte el uréter en el punto central de las dos ligaduras y luego use suturas de nylon 4-0 para cerrar la membrana peritoneal y la incisión.Después de cortar la membrana peritoneal, como se ha demostrado anteriormente, levantarla con pinzas y utilizar tijeras quirúrgicas para hacer una incisión lateral en el borde superior, luego continuar la incisión a lo largo del borde más bajo de las costillas. Identifique el riñón izquierdo y reflujo con PBS hasta que el riñón se vuelva amarillo-blanco. Retire el riñón cortando la arteria renal izquierda y la vena con las tijeras quirúrgicas y colóquelo en una placa de Petri, luego lávelo cuidadosamente con PBS.Cortar el riñón en muestras de aproximadamente 10 miligramos con las tijeras quirúrgicas y pinzas, poner cada pedazo del riñón en su propio tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y cerrar la tapa del tubo. Ponga una muestra de riñón en el homogeneizador de silicona y agregue 700 microlitros de un reactivo de lysis a base de fenilo/guanidina. Presione y retuerza lentamente el peste del homogeneizador contra la muestra de riñón para homogeneizarla.Repita el prensado y la torsión hasta que la muestra se disuelva por completo en el reactivo de lelisis. Para homogeneizar aún más la muestra, transfiera el izado homogeneizado a la columna de giro del biopolímero y gírrela a 14.000 veces G durante tres minutos, luego transfiera el izado precipitado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros no utilizado. Combine el ésato en el tubo con 140 microlitros de cloroformo y tapón el tubo firmemente.Para mezclar el izado y el cloroformo, invierta el tubo 15 veces. Incubar las muestras durante dos o tres minutos a temperatura ambiente, luego girarlas a 12.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Sin perturbar el precipitado, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, y agregue 1,5 veces su volumen de 100% etanol.Vórtice la mezcla durante cinco segundos. Cargue 700 microlitros de la muestra en una columna de centrifugado anclada a membrana en un tubo de recogida de dos mililitros. Cierre la tapa de la columna y gire la columna a 15.000 veces G durante 15 segundos y, a continuación, tire el izado precipitado en el tubo de recogida.Lave bien la muestra añadiendo 700 microlitros de tampón de lavado uno a la columna de centrifugado anclada a la membrana en un tubo de recogida de dos mililitros. A continuación, repita la centrifugación y tire el tubo de recogida. Repita el lavado dos veces con 500 microlitros de tampón de lavado dos por lavado.Después del último lavado, gire la columna de espín anclada a la membrana en un tubo de recogida de dos mililitros a 15.000 veces G durante un minuto y tire el lysate precipitado. Transfiera la columna de centrifugado anclada a la membrana a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Disuelva el ARN total añadiendo 30 microlitros de agua libre de RNase a la columna, cierre la tapa de la columna y déjela durante cinco minutos a temperatura ambiente.Luego gira la columna a 15.000 veces G durante un minuto. Transfiera la muestra que contiene ARN total a un nuevo tubo de microcentrífuga sobre hielo y mida la concentración de ARN total por espectrofotometría. Prepare una solución de mezcla maestra de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y agregue ocho microlitros a cada tubo de una tira de tubo de ocho pozos.Después de ajustar la densidad total de ARN, coloque una alícuota de 12 microlitros del ARN total en cada tubo y cierre la tapa. Centrifugar los tubos durante 15 segundos. Poner los tubos en el termociclo e incubarlos durante 60 minutos a 37 grados centígrados.Cuando haya terminado, incubarlos inmediatamente durante cinco minutos a 95 grados centígrados para la síntesis de ADNc. Transfiera el ADNc a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y diluya 10 veces con agua destilada. Vórtice y centrifugar el tubo durante cinco segundos, luego realizar PCR cuantitativo en tiempo real, como se describe en el manuscrito de texto.Este protocolo se utilizó para crear un modelo unilateral de ratón de obstrucción uretral a través de la ligadura ureteral izquierda en ratones macho de ocho semanas de edad que pesan de 20 a 25 gramos. Los uréteres estaban completamente obstruidos por doble ligadura con 4-0 suturas de seda. Los riñones se recolectaron a los ocho días después de la cirugía.Los datos de microRNA qRT-PCR indicaron que el nivel de microRNA 3070-3p aumentó significativamente y los niveles de microARN, 7218-5p y microRNA 7219-5p disminuyeron en los riñones de los ratones UUO en comparación con los controles. Al intentar este protocolo, recuerde repetir la torsión de la muestra de riñón hasta que se disuelva completamente en el reactivo de lysis a base de fenilo/guanidina para lograr una buena extracción de ARN.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

La fusión absoluta y relativa de datos de PCR cuantitativa para cuantificar STAT3 variante de empalme transcripciones

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Investigación

Genética

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Entrega sistémica de microARN mediante Virus Adeno-asociado recombinante serotipo 9 para tratar enfermedades neuromusculares en roedores

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Análisis cuantitativo de empalmes alternativos del Pre-mRNA en secciones de cerebro de ratón usando análisis de ARN In Situ hibridación

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Un protocolo in vitro para evaluar los niveles, funciones y genes objetivo asociados de MicroRNA en células tumorales

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Un gasoducto de bioinformática para analizar de forma precisa y eficiente los transcriptomes de microRNA en las plantas

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...