Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Vi tackar Michelle Goody, PhD, från Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) för att ha redigerat ett utkast till detta manuskript.

Alla djurförsöksprotokoll godkändes av Husdjursetiska kommittén vid Jichi Medical University och utfördes i enlighet med riktlinjerna för användning och vård av försöksdjur från Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Den skenkirurgi
<ol><li>Förbered följande poster: isofluran, kork ark, depilatory grädde, vattenservetter laboratoriet, Petriskål med fosfat-buffrad saltlösning (PBS), 4-0 nylon, pincett, kirurgiska saxar, bomullspinne, och 8 veckor gamla C57BL...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

Det ovan beskrivna protokollet med qRT-PCR bestämde uttrycksnivåerna för de målinriktade miRNAsna framgångsrikt. Bedömningen av extraherade miRNAs är viktig när man försöker få meningsfulla qRT-PCR-data, och för att bekräfta kvalitén på miRNAs innan de utför qRT- PCR, förhållandet mellan absorbans vid 260 nm och det vid 280 nm bör kontrolleras med en spektrofotometer. Om en enda PCR-förstärkning av förväntad längd och smälttemperatur eller en monomodal smältkurva inte kan erhållas genom qRT-PCR...

MicroRNAs (miRNAs) — de korta, icke-kodande RNA som orsakar nedbrytning och transkriptionell hämning av budbärar-RNA (mRNA)1 — har visat sig reglera uttrycket av olika mRNAs som har avgörande roller i både fysiologi och sjukdom (t.ex. inflammation, fibros, metabola sjukdomar, och cancer). Några av miRNAs kan därför vara kandidat nya biomarkörer och terapeutiska mål för en mängd olika sjukdomar2,3,4,5. Även miRNA uttryck profiler i mus organ och vävnader inklusive hjärnan, hjärta, lunga, lever, och njure har beskrivits6,7,8,9,10, det har inte funnits några standardmetoder för extraktion och utvärdering av miRNAs i mus njure med njur-interstitiell fibros.
Vi har utformat ett protokoll för att på ett tillförlitligt sätt rena och upptäcka uttrycken av miRNAs i njurarna hos möss med renal interstitiell fibros. Protokollet omfattar fem huvudsteg, enligt följande. (1) 8 veckor gamla C57BL/6 hanmöss delas in i grupper av möss som genomgår en skenoperation (kontroller) och möss som utsätts för en operation som ger ensidigt ureteral obstruktion (UUO), som är kopplat till njurmedicinsk interstitiell fibros. (2) Njurprover extraheras från sken- och UUO-mössen, homogeniseras separat i en kisel homogenisator, och sedan överföras till ett biopolymer-fragmenteringssystem på en mikrocentrifugspinn kolumn11,12. (3) Det totala RNA som innehåller miRNA extraheras från njurproverna genom en kiselhinnabaserad spinnkolonn12,13. (4) Med hjälp av detta extraherade totala RNA syntetiseras komplementärt DNA (cDNA) från det totala RNA med användning av omvänd transkriptas, poly(A) polymeras och oligo-dT primer14,15. (5) Uttrycken för miRNAs utvärderas genom kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktion (qRT-PCR) med hjälp av en intercalatingfärgämne 14,15.
Detta protokoll är baserat på undersökningar som erhållit meningsfulla extraktioner och utvärderingar av miRNAs i en mängd olika vävnader11,12,13,14,15, och biopolymer-fragmentering system som används i protokollet visades att rena högkvalitativa, totala RNA från vävnader i 200612. Dessutom har tidigare studier bekräftat noggrannheten och känsligheten hos aspekter av protokollet (dvs. cDNA-syntesen med omvänd transkriptas, poly(A) polymeras och oligo-dT-primers från extraherade totala RNA) för bestämning av miRNA-uttryck genom qRT-PCR med ett interkalatingfärgämne 14,15. Eftersom det nya protokollet har fördelarna med enkelhet, tidsbesparande, och minskningen av tekniska fel, kan protokollet användas i forskning som kräver korrekt och känslig identifiering av miRNA-profilen i mus njure. Dessutom skulle protokollet kunna tillämpas på undersökningar av många patologiska tillstånd.
Vi beskriver nästa fastställandet av miRNA uttrycksprofilerna i möss med UUO, som är kopplad till renal interstitiell fibros. Hos människor är njurmedicinsk interstitiell fibros en vanlig och viktig egenskap hos både kronisk njursjukdom och njursjukdom i slutstadiet, oavsett deras etiologi16,17. Denna njurmedicinska interstitiell fibros är associerad med progression av njursvikt, och det kännetecknas av ökade uttryck för extracellulära matriskomponenter i de interstitiella utrymmena (t.ex. kollagen, fibronectin, och α-smooth muskel aktin)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MikroRNA (miRNAs) är enda strandsatta, icke-kodande RNA-molekyler som vanligtvis reglerar genuttryck på post-transkriptionell nivå genom att binda till delvis kompletterande målplatser i 3' oöversatta regionen (UTR) av budbärar-RNA (mRNA), vilket minskar mRNA:s översättning och stabilitet. MiRNA-uttrycksprofilerna i olika organ och vävnader hos möss har undersökts, men standardmetoder för rening och kvantifiering av miRNA i mus njure har inte varit tillgängliga. Vi har etablerat en effektiv och tillförlitlig metod för att extrahera och utvärdera miRNA uttryck i mus njure med renal interstitiell fibros genom kvantitativa omvänd-transkription polymeras kedjereaktion (qRT-PCR). Protokollet krävde fem steg: (1) skapande av sken- och ensidiga ureteralobstruktionsmöss (UUO) 2) utvinning av njurprover från UUO-mössen. 3) utvinning av totalt RNA, som omfattar miRNA, från njurproverna. (4) komplementär DNA (cDNA) syntes med omvänd transkription från miRNA; och (5) qRT-PCR med hjälp av cDNA. Med hjälp av detta protokoll, bekräftade vi framgångsrikt att jämfört med kontrollerna, var uttrycket av miRNA-3070-3p betydligt ökade och de av miRNA-7218-5 p och miRNA-7219-5p var betydligt minskade i njurarna i en mus modell av renal interstitiell fibros. Detta protokoll kan användas för att bestämma miRNA-uttrycket i njurarna hos möss med UUO.

En UUO musmodell skapades av vänster ureteralligering enligtbeskrivningen 21 i 8 veckor gamla hanmöss som väger 20–25 g. Ureters var helt hindras av dubbel ligatur med 4-0 silke suturer. Ett smärtstillande medel (meloxikaka 5 mg/kg, subkutan injektion) administrerades före operation och även dagligen den 2 dagar efter operationen. Vid 8 dagar efter operationen, njurar samlades, sköljdes med PBS, dissekeras, och lagras i flytande kväve för vidare analys. Sham-drivna möss fungerade som k...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Vi beskriver en metod för utvärdering av mikroRNA uttrycket i njurarna hos möss med ensidiga ureteral obstruktion (UUO) genom kvantitativa omvänd-transkription polymeras kedjereaktion. Detta protokoll är lämpligt för att studera njurmikroNARNA-uttrycksprofiler hos möss med UUO och i samband med andra patologiska tillstånd.

Kvantitativ Realtids PCR Utvärdering av mikroRNA-uttryck i Mus Njure med ensidig Ureteral obstruktion

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Denna metod gör det möjligt att ge mikroRNA-uttryck i njurar hos möss med ett brett spektrum av patologiska tillstånd, såsom njurfibros. Den största fördelen med denna teknik är att den möjliggör mikroRNA-uttrycksprofilering med hög noggrannhet och känslighet genom att använda en enkel process som sparar tid och förhindrar tekniskt fel. För att utföra den skenkirurgi, använd kirurgiska sax och pincett för att göra ett snitt i huden vid buken och skär muskel och peritoneal membran från urinblåsan till vänster nedre kanten av revbenen.Fukta två bomullspinner med PBS och dra försiktigt tarmarna åt sidan. Placera de fuktade svabbarna för att identifiera vänster njure och urinledare. Stäng peritonealmembranet och sedan snittet med 4-0 nylon.För att utföra den ensidiga urethral obstruktion, eller UUO, göra ett snitt i huden vid buken och skär muskel och peritoneal membran som visat för den skenkirurgi. Placera en 2,5-milliliter spruta under musen. Fukta två bomullspinner med PBS, dra sedan tarmarna försiktigt åt sidan med pincetten och placera svabbarna för att identifiera vänster urinledare.Använd pincetten för att lyfta vänster njure. Använd 4-0 silke för att ligate vänster urinledaren på två ställen ungefär en centimeter från varandra. Skär urinledaren i centrum punkt av de två ligations och sedan använda 4-0 nylon suturer för att stänga peritonealmembranet och snittet.Efter styckning peritoneal membranet, som tidigare visat, lyfta den med pincett och använda kirurgiska sax för att göra en sidledes snitt i den övre kanten, sedan fortsätta snittet längs den lägsta kanten av revbenen. Identifiera vänster njure och återflöde den med PBS tills njuren blir gul-vit. Ta bort njuren genom att skära den vänstra njurartären och venen med den kirurgiska saxen och placera den i en petriskål, tvätta den sedan försiktigt med PBS.Skär njuren i cirka 10-milligram prover med kirurgiska sax och pincett, lägg varje bit av njuren i sin egen 1,5-milliliter microcentrifug röret och stänga rörets mössa. Sätt ett njurprov i silikon homogenisator och tillsätt 700 mikroliter av en fenyl/guanidin-baserade lysreagens. Tryck långsamt och vrid homogenisatorens mortelstöt mot njurprovet för att homogenisera det.Upprepa pressningen och vridningen tills provet är helt upplöst i lysreagensen. För att ytterligare homogenisera provet, överför den homogeniserade lysate till biopolymer spinn kolumnen och snurra den på 14, 000 gånger G i tre minuter, sedan överföra utfälld lysate till en oanvänd 1,5-milliliter microcentrifuge rör. Kombinera lysate i röret med 140 mikroliter kloroform och locket röret tätt.För att blanda lysate och kloroform, invertera röret 15 gånger. Inkubera proverna i två till tre minuter vid rumstemperatur, snurra dem sedan på 12, 000 gånger G i 15 minuter vid fyra grader Celsius. Utan att rubba fällningen, överför supernatanten till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör, och tillsätt 1,5 gånger sin volym på 100%etanol.Vortexa blandningen i fem sekunder. Lasta 700 mikroliter av provet på en membranförankerad spinnkolonn i ett uppsamlingsrör med två milliliter. Stäng kolonlocket och snurra kolumnen vid 15, 000 gånger G i 15 sekunder och kasta sedan bort den utfällda lysate i uppsamlingsröret.Tvätta provet noggrant genom att tillsätta 700 mikroliter av tvättbuffert ett till membranförankrad spinnkolonn i ett uppsamlingsrör med två milliliter. Upprepa sedan centrifugeringen och kasta bort uppsamlingsröret. Upprepa tvätten två gånger med 500 mikroliter tvättbuffert två per tvätt.Efter den sista tvätten snurrar du den membranförankrade spinnkolonnen i ett två milliliter uppsamlingsrör vid 15 000 gånger G i en minut och kastar bort den utfällda lysate. Överför den membranförankrade spinnpelaren till ett nytt 1,5-milliliterrör. Lös upp det totala RNA genom att tillsätta 30 mikroliter RNase-fritt vatten till kolonnen, stäng kolonnlocket och låt det vara i fem minuter vid rumstemperatur.Snurra sedan kolumnen på 15, 000 gånger G i en minut. Överför provet som innehåller totalt RNA till ett nytt mikrocentrifugrör på is, och mät koncentrationen av totalt RNA genom spektrofotometri. Förbered en master mix lösning enligt manuskriptet riktningar och tillsätt åtta mikroliter till varje rör av en åtta-brunn rör band.Efter justering av den totala RNA-densiteten, placera en 12-mikroliter alikvot av totala RNA i varje rör och stänga locket. Centrifugera rören i 15 sekunder. Sätt rören i termocyklaren och inkubera dem i 60 minuter vid 37 grader Celsius.När du är klar, omedelbart inkubera dem i fem minuter vid 95 grader Celsius för syntes av cDNA. Överför cDNA i ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör och späd det 10 gånger med destillerat vatten. Vortex och centrifug röret i fem sekunder, sedan utföra kvantitativa realtid PCR, som beskrivs i texten manuskriptet.Detta protokoll användes för att skapa en ensidig urethral hinder mus modell via vänster ureteral ligatur i åtta veckor gamla manliga möss som väger 20 till 25 gram. Ureters var helt hindras av dubbel ligatur med 4-0 silke suturer. Njurar samlades in på åtta dagar efter operationen.MicroRNA qRT- PCR-data indikerade att nivån av microRNA 3070-3p ökades betydligt och nivåerna av microRNA, 7218-5p och microRNA 7219-5p minskades i njurarna hos UUO-mössen jämfört med kontrollerna. När du försöker detta protokoll, kom ihåg att upprepa vridning av njure provet tills det är helt upplöst i fenyl/guanidin-baserade lysreagens för att uppnå en bra RNA utvinning.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Sammanslagning Absolut och relativ kvantitativ PCR data för att kvantifiera STAT3 Splice Variant Avskrifter

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Vildtyp Blockering PCR kombination med direkt sekvensering som en mycket känslig metod för detektion av lågfrekventa somatiska mutationer

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detektion av mikroRNA-uttryck i peritonealt membran hos råttor med användning av kvantitativ realtids-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Systemiska leverans av mikroRNA använda rekombinant Adeno-associerade Virus serotyp 9 neuromuskulära sjukdomar hos gnagare

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Tvåriktad retroviral integrationsplats PCR-metodik och kvantitativ dataanalys arbetsflöde

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Realtidsanalys av transkriptionsfaktor som bindande, transkription, översättning och omsättning under cellulär aktivering med visning av globala händelser

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kvantitativ analys av alternativa Pre-mRNA Splicing i mus hjärnan sektioner med RNA In Situ hybridisering analys

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Ett in vitro-protokoll för utvärdering av mikroRNA nivåer, funktioner och associerade målgener i tumörceller

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digitalt PCR-baserat konkurrens index för högt dataflöde analys av lämplighet för salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

En bioinformatik pipeline för att noggrant och effektivt analysera MicroRNA Transcriptomes i växter

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...