Name: quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Edanz Group'tan (https://en-author-services.edanzgroup.com/) Bu el yazmasının taslağını düzenlediği için Doktora lı Michelle Goody'e teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneysel protokolleri Jichi Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Rehberi'nden Deneysel Hayvanların Kullanımı ve Bakımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Sahte cerrahi
<ol><li>Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: isoflurane, mantar levha, tüy dökücü krem, laboratuvar mendilleri, fosfat tamponlu salin (PBS), 4-0 naylon, cımbız, cerrahi makas, pamuklu swabs ve 8 haftalık C57BL ...

<ol>
	<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+functional+miRNA-mRNA+regulatory+modules+with+correspondence+latent+dirichlet+allocation.">Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation.</a> Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).</li><li>Rottiers, V., Naar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+metabolism+and+metabolic+disorders.">MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).</li><li>Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+in+Macrophage+Development+and+Function.">miRNA in Macrophage Development and Function.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).</li><li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+exosomal+miRNA+on+cancer+biology+and+clinical+applications.">Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications.</a> Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).</li><li>Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+liver+cirrhosis.">Pathogenesis of liver cirrhosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (23), 7312-7324 (2014).</li><li>Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+microRNA+expression+profiles+in+mouse+renal+cortical+tissue+after+177Lu-octreotate+administration.">Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration.</a> PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).</li><li>Blasco-Baque, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+hepatic+miRNA+expression,+liver+triacylglycerols+and+gut+microbiota+during+metabolic+adaptation+to+high-fat+diet+in+mice.">Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice.</a> Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).</li><li>Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+plasma+microvesicle+and+brain+profiles+of+microRNA+in+experimental+cerebral+malaria.">Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria.</a> Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).</li><li>Gao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+role+of+miR-19a/19b+in+cardiac+regeneration+and+protection+from+myocardial+infarction.">Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction.</a> Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocutaneous+revascularization+following+graded+ischemia+in+lean+and+obese+mice.">Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).</li><li>Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concurrent+mRNA+and+protein+extraction+from+the+same+experimental+sample+using+a+commercially+available+column-based+RNA+preparation+kit.">Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit.</a> Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).</li><li>Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+commercially-available+automated+and+manual+extraction+kits+for+the+isolation+of+total+RNA+from+small+tissue+samples.">A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples.</a> BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).</li><li>Mestdagh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+quantitative+miRNA+expression+platforms+in+the+microRNA+quality+control+(miRQC)+study.">Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study.</a> Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).</li><li>Kang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+real-time+PCR+assay+of+microRNAs+using+S-Poly(T),+a+specific+oligo(dT)+reverse+transcription+primer+with+excellent+sensitivity+and+specificity.">A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity.</a> PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).</li><li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD.">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li><li>Liu, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+homologous+protein+(CHOP)+deficiency+ameliorates+renal+fibrosis+in+unilateral+ureteral+obstructive+kidney+disease.">C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease.</a> Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).</li><li>Buchtler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Origin+and+Functional+Relevance+of+Collagen+I+Production+in+the+Kidney.">Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney.</a> Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improvement+of+the+2^(-delta+delta+CT)+method+for+quantitative+real-time+polymerase+chain+reaction+data+analysis.">An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis.</a> Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).</li><li>Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy.">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li><li>Radonic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guideline+to+reference+gene+selection+for+quantitative+real-time+PCR.">Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).</li><li>Zubakov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+markers+for+forensic+body+fluid+identification+obtained+from+microarray+screening+and+quantitative+RT-PCR+confirmation.">MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation.</a> International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).</li><li>Brazma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+microarray+experiment+(MIAME)-toward+standards+for+microarray+data.">Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data.</a> Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).</li></ol>

QRT-PCR ile yukarıda açıklanan protokol, hedeflenen miRNA'ların ifade düzeylerini başarıyla belirlemiştir. Anlamlı qRT-PCR verileri elde etmek isteyen ayıklanmış miRNA'ların değerlendirilmesi önemlidir ve qRT-PCR'yi gerçekleştirmeden önce miRNA'ların kalitesini doğrulamak için 260 nm'deki absorbans oranı 280 nm'de spektrofotometre ile kontrol edilmelidir. Beklenen uzunluk ve erime sıcaklığının tek bir PCR amplifikasyonu veya monomodal erime eğrisi qRT-PCR ile elde edilemiyorsa, reaksiyon plaka...

MikroRNA'lar (miRNA'lar) — haberci RNA'nın (mRNA)1 bozulmasına ve transkripsiyonel inhibisyonuna neden olan kısa, kodlayıcı olmayan RNA'ların, hem fizyolojide hem de hastalıkta (örn. inflamasyon, fibrozis, metabolik bozukluklar ve kanser) önemli rolleri olan çeşitli mRNA'ların ekspresyonunu düzenlediği gösterilmiştir. Bazı miRNA'lar bu nedenle çeşitlihastalıklariçin aday yeni biyobelirteçler ve tedavi hedefleri 2 ,3,,4,5olabilir. Beyin, kalp, akciğer, karaciğer ve böbrek gibi fare organlarıve dokularda miRNA ekspresyon profilleri6,7,8,9,10olarak tanımlanmış olmasına rağmen, böbrek interstisyel fibrozisli fare böbreği miRNA'ların çıkarılması ve değerlendirilmesi için standart bir yöntem bulunmamaktadır.6
Renal interstisyel fibrozisli farelerin böbreklerinde miRNA ifadelerini güvenilir bir şekilde arındırmak ve tespit etmek için bir protokol tasarladık. Protokol aşağıdaki gibi beş ana adımdan oluşur. (1) 8 haftalık C57BL/6 erkek fareler, renal interstisyel fibroza bağlı tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) sağlayan bir ameliyata tabi tutulan fare grupları (kontroller) ve farelere ayrılır. (2) Böbrek örnekleri sham ve UUO fareler, bir silikon homogenizer ayrı ayrı homojenize ve daha sonra bir mikrosantrifüj spin sütun11,,12bir biyopolimer parçalama sistemine aktarılır ayıklanır. (3) MiRNA içeren toplam RNA böbrek örneklerinden silika membran tabanlı spin sütun12,13ile elde edilir. (4) Bu çıkarılan toplam RNA kullanılarak, tamamlayıcı DNA (cDNA) ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT astar14,15kullanımı ile toplam RNA sentezlenir. (5) miRNA'ların ifadeleri kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)14,15ile incelenir.
Bu protokol, çeşitli dokularda miRNA'ların anlamlı ekstraksiyonve değerlendirmeleri elde edilen araştırmalara dayanmaktadır11,12,13,14,15, ve protokolde kullanılan biyopolimer-parçalama sistemi 2006 yılında dokulardan yüksek kaliteli, toplam RNA arındırmak için gösterilmiştir12. Buna ek olarak, önceki çalışmalar da protokolün yönlerinin doğruluğunu ve hassasiyetini (yani ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT astarları ile ekstre toplam RNA) qRT-PCR ile miRNA ekspresyonunun belirlenmesi için ters bir boya14,15. Yeni protokol basitlik, zaman tasarrufu ve teknik hataların azaltılması avantajlarına sahip olduğundan, protokol fare böbreği miRNA profilinin doğru ve hassas bir şekilde tanımlanmasını gerektiren araştırmalarda kullanılabilir. Ayrıca protokol birçok patolojik durum la ilgili araştırmalara da uygulanabilir.
Daha sonra uuo ile farelerde miRNA ekspresyon profillerinin belirlenmesi ni açıklayacağız, bu da renal interstisyel fibrozis ile bağlantılıdır. İnsanlarda renal interstisyel fibrozis hem kronik böbrek hastalığının hem de son dönem böbrek hastalıklarının16,17yaygın ve önemli bir özelliğidir. Bu renal interstisyel fibrozis böbrek yetmezliğinin ilerlemesi ile ilişkilidir, ve interstisyel alanlarda ekstrasellüler matriks bileşenlerinin artan ekspresyonları ile karakterizedir (örneğin, kollajen, fibronektin, ve α-düz kas aktin)17,18.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tokyo Laboratory Animals Science</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00001701</td>
			<td>5&#39;-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00065141</td>
			<td>5&#39;-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ASKUL</td>
			<td>GA04SW</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AS ONE</td>
			<td>ER1004NA45-KF2,62 -9968-32</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time pcr evaluation of microrna expressions in mouse kidney with unilateral ureteral obstruction

MicroRNA'lar (miRNA'lar), mRNA'nın çevirisini ve stabilitesini azaltan messenger RNA'nın (mRNA) 3' çevrilmemiş bölgesinde (UTR) kısmen tamamlayıcı hedef bölgelere bağlanarak gen ekspresyonunu transkripsiyon sonrası düzeyde düzenleyen tek iplikli, kodlamayan RNA molekülleridir. Farelerin çeşitli organ ve dokularında miRNA ekspresyonu profilleri araştırılmış, ancak fare böbreğindeki miRNA'nın saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için standart yöntemler bulunmamaktadır. Fare böbreğinde miRNA ekspresyonunun alınması ve değerlendirilmesi için etkili ve güvenilir bir yöntem oluşturduk. Protokol beş adım gerektiriyordu: (1) sahte ve tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) farelerin yaratılması; (2) UUO farelerböbrek örneklerinin çıkarılması; (3) böbrek örneklerinden miRNA içeren toplam RNA çıkarma; (4) tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi miRNA ters transkripsiyon ile; ve (5) qRT-PCR cDNA kullanarak. Bu protokolü kullanarak, kontrollere göre miRNA-3070-3p ekspresyonunun anlamlı olarak arttığını, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p ekspresyonunun renal interstisyel fibrozisin fare modelinin böbreklerinde önemli ölçüde azaldığını başarıyla doğruladık. Bu protokol UUO ile farelerin böbreklerinde miRNA ekspresyonu belirlemek için kullanılabilir.

UUO fare modeli, 20-25 g ağırlığındaki 8 haftalık erkek farelerde21'inde açıklandığı gibi sol üreteral ligasyon ile oluşturulmuştur. Üreterler 4-0 ipek sütürile çift ligasyon ile tamamen tıkandı. Ameliyat öncesi ve ameliyat sonrası 2 gün boyunca her gün analjezik (meloksikam 5 mg/kg, deri altı enjeksiyon) uygulandı. Ameliyat sonrası 8 gün sonra böbrekler toplandı, PBS ile durulandı, incelendi ve daha fazla analiz için sıvı nitrojende depolandı. Sham ile çalışa...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction at JoVE.com

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

Tek taraflı üreteral obstrüksiyonu (UUO) olan farelerin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol UUO ile farelerde ve diğer patolojik durumlar bağlamında böbrek mikroRNA ekspresyon profillerinin incelenmesi için uygundur.

Fare Böbreğinde Tek Taraflı Üreteral Obstrüksiyonile MikroRNA Ekspresyonlarının Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Değerlendirilmesi

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

Bu yöntem, böbrek fibrozisi gibi çok çeşitli patolojik rahatsızlıkları olan farelerin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonu sağlamayı mümkün kılmasıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, zaman kazandırır ve teknik hatayı önleyen basit bir işlem kullanarak mikroRNA ifade profillemesini yüksek doğruluk ve hassasiyetle mümkün kılmasını sağlamasıdır. Sahte cerrahi gerçekleştirmek için, karın deride bir kesi yapmak ve kaburga sol alt kenarına mesane kas ve periton zarı kesmek için cerrahi makas ve cımbız kullanın.PBS ile iki pamuklu bez nemlendirin ve dikkatle yan bağırsakçekin. Sol böbrek ve üreter tanımlamak için nemlendirilmiş bezleri yerleştirin. Periton zarını kapatın ve ardından kesiyi 4-0 naylon ile kapatın.Tek taraflı üretral obstrüksiyon, ya da UUO gerçekleştirmek için, karın deride bir kesi yapmak ve sahte cerrahi için gösterildiği gibi kas ve periton zarı kesti. Farenin altına 2,5 mililitrelik bir şırınga yerleştirin. PBS ile iki pamuklu bez nemlendirin, sonra cımbız ile dikkatle yan bağırsakçekin ve sol üreter tanımlamak için bezleri yerleştirin.Sol böbreği kaldırmak için cımbızkullanın. Yaklaşık bir santimetre arayla iki yerde sol üreter inilemek için 4-0 ipek kullanın. İki ligasyonun merkez noktasında üreteci kesin ve sonra periton zarını ve kesisini kapatmak için 4-0 naylon dikiş kullanın.Periton zarını kestikten sonra, daha önce de gösterildiği gibi, cımbızla kaldırın ve üst kenarda yan lara doğru bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın, sonra kaburgaların en alt kenarı boyunca kesi devam edin. Sol böbreği belirleyin ve böbrek sarı-beyaz olana kadar PBS ile reflü. Cerrahi makas ile sol böbrek arter ve ven keserek böbrek çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin, sonra PBS ile dikkatlice yıkayın.Cerrahi makas ve cımbız ile yaklaşık 10 miligramlık örnekler halinde böbreği kesin, böbreğin her bir parçasını kendi 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne koyun ve tüpün kapağını kapatın. Silikon homogenizer bir böbrek örneği koyun ve fenil / guanidin bazlı lizis reaktif 700 mikrolitre ekleyin. Homogenizer'in zararlısını böbrek örneğine doğru yavaşça bastırın ve bükerek homojenize edin.Numune lysis reaktifinde tamamen eriyene kadar presleme ve bükümtekrarlayın. Numuneyi daha da homojenize etmek için homojenize edilmiş lysat'ı biyopolimer spin sütununa aktarın ve 14.000 kez G'de üç dakika döndürün, sonra çökelmiş lysate'yi kullanılmayan 1,5 mililitrelik mikrosentrifüge tüpüne aktarın. Tüpteki lysat'ı 140 mikrolitre kloroform ile birleştirin ve tüpü sıkıca kaplayın.Lysat ve kloroformu karıştırmak için tüpü 15 kez ters çevirin. Örnekleri oda sıcaklığında 2-3 dakika kuluçkaya yatırın, sonra 12,000 kez G'de 15 dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. Çökeltiyi bozmadan, süpernatant'ı yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın ve %100 etanol hacminin 1,5 katını ekleyin.Karışımı beş saniye boyunca girdaplayın. Numunenin 700 mikrolitresini iki mililitrelik toplama tüpündeki membran bağlantılı spin sütununa yükleyin. Sütun kapağını kapatın ve 15,000 kez G sütunu döndürün, sonra toplama tüpündeki çökelmiş lysate'yi atın.İki mililitrelik toplama tüpündeki membran bağlantılı spin sütununa 700 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek numuneyi iyice yıkayın. Sonra santrifüj tekrarlayın ve toplama tüpü atmak. Yıkama başına iki yıkama tampon u 500 mikrolitre ile yıkama iki kez tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, membran alamış spin kolonu 15, 000 kez G'de iki mililitrelik bir toplama tüpünde bir dakika boyunca döndürün ve çökelmiş lysate'yi atın. Membran bağlantılı spin kolonu yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Sütuna 30 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyerek toplam RNA'yı çözün, sütun kapağını kapatın ve oda sıcaklığında beş dakika bekletin.Sonra bir dakika için 15,000 kez G sütun döndürün. Toplam RNA içeren numuneyi buz üzerindeki yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve spektrofotometri ile toplam RNA konsantrasyonu ölçün. El yazması yönlere göre bir ana karışım çözeltisi hazırlayın ve sekiz kuyulu bir tüp şeridinin her tüpüne sekiz mikrolitre ekleyin.Toplam RNA yoğunluğunu ayarladıktan sonra, her tüpe toplam RNA'dan 12 mikrolitrelik bir aliquot yerleştirin ve kapağı kapatın. Tüpleri 15 saniye santrifüj edin. Tüpleri termocycler'a koyun ve 37 derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın.Bittiğinde, cDNA sentezi için 95 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. CDNA'yı 1,5 mililitrelik yeni bir mikrosantrifüj tüpe aktarın ve distile suyla 10 kez seyreltin. Girdap ve beş saniye için tüp santrifüj, sonra metin el yazması açıklandığı gibi, nicel gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.Bu protokol, 20-25 gram ağırlığındaki sekiz haftalık erkek farelerde sol üreteral ligasyon yoluyla tek taraflı üretral obstrüksiyon fare modeli oluşturmak için kullanılmıştır. Üreterler 4-0 ipek sütürile çift ligasyon ile tamamen tıkandı. Böbrekler ameliyat tan sekiz gün sonra toplandı.MikroRNA qRT-PCR verileri, uuo farelerinin böbreklerinde mikroRNA 3070-3p seviyesinin anlamlı olarak arttığını ve kontrollere göre MikroRNA, 7218-5p ve mikroRNA 7219-5p seviyelerinin azaldığını göstermiştir. Bu protokolü denerken, iyi bir RNA ekstraksiyonu elde etmek için fenil/guanidin bazlı lisis reaktifinde tamamen eriyene kadar böbrek örneğini bükme yi tekrarlamayı unutmayın.

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

Mutlak ve Bağıl Kantitatif PCR Veri birleştirme STAT3 Splice Varyant Dökümünü belirlememize

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Yabani tip PCR Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonlar Tespiti için oldukça hassas bir yöntem olarak doğrudan bölme imkanı Kombine Engelleme

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Kullanarak Sıçanların Periton Membranındaki MikroRNA İfadesinin Saptanması

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Systemic Delivery of MicroRNA Using Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 to Treat Neuromuscular Diseases in Rodents

Kemirgen nöromusküler hastalıkları tedavi etmek için rekombinant Adeno ilişkili virüs serotip 9 kullanarak mikroRNA sistemik teslim

RNA interference via the endogenous miRNA pathway regulates gene expression by controlling protein synthesis through post-transcriptional gene silencing. ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Çift Yönlü Retroviral Entegrasyon Sitesi PCR Metodolojisi ve Kantitatif Veri Analizi İş Akışı

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

Bitkilerdeki MikroRNA Transkripsiyonlarını Doğru ve Verimli Bir Şekilde Analiz Eden Bir Biyoinformatik Boru Hattı

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...