Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

يعترف المؤلفون بالدعم التمويلي الذي قدمته Fundação para a Ciência e a Tecnologia من خلال المشاريع UIDB/00709/2020 و POCI-01-0145-FEDER-029311 والزمالة SFRH/BD/135936/2018 إلى JP، بواسطة ''Programa Operacional do Centro، Centro 2020" من خلال مشروع CENTRO-01-0145-FEDER-000013 والتمويل إلى منصة PPBI البرتغالية ل BioImaging من خلال مشروع POCI-01-0145-FEDER-022122.

وقد تم تربية جميع الحيوانات المستخدمة في مركز بحوث العلوم الصحية CICS-UBI وفقا للمتطلبات الأخلاقية الوطنية للبحوث الحيوانية وللاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة للأغراض التجريبية وغيرها من الأغراض العلمية (التوجيه 2010/63/EU).
1. الجرذ الجنين قشرة ثقافة الخلية...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

الطريقة الموصوفة هنا تتكون من العزلة الفلكية والخلايا العصبية من الأنسجة القشرية الجنينية الفئران، مما يسمح بإنشاء الثقافات المخصبة بالخلايا العصبية أو الخلايا الفلكية أو الثقافات العصبية غليا. وقد تم تكييفها من دراسة سابقة لمجموعتنا5, حيث وصفت الخلايا العصبية القشرية - glia ...

وفقا لبيانات من منظمة الصحة العالمية، يموت حوالي 5.5 مليون شخص كل عام بسبب السكتة الدماغية الإقفارية1. يتميز هذا الشرط بانقطاع تدفق الدم إلى منطقة معينة من الدماغ ، مما يؤدي إلى فقدان عكسه أو لا رجعة فيه في إمدادات الأكسجين والمواد المغذية للأنسجة ، مما يغير وظيفة الأنسجة ويؤدي إلى خلل الميتوكوندريا ، dysregulation الكالسيوم ، استثارة الجلوتامات ، الالتهاب وفقدان الخلايا2،3.
وبصرف النظر عن الخلايا الوعائية، وتشارك الخلايا العصبية والزبقية في الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغيةالإقفارية 4. على وجه الخصوص، الخلايا الفلكية ضرورية للحفاظ على الخلايا العصبية، ومؤخرا تبين أن تلعب دورا حاسما في الاستجابة للآفات الإقفاري5. هذا النوع من الخلايا الدبقية يؤدي وظائف الدعم الهيكلي، والدفاع ضد الأكسدة، وتركيب الناقلات العصبية، واستقرار الاتصالات الخلوية، من بين أمور أخرى6. جنبا إلى جنب مع الخلايا العصبية، تلعب الخلايا الفلكية دورا مباشرا في انتقال متشابك، وتنظيم إطلاق جزيئات مثل الأدينوسين ثلاثي الفوسفات، حمض غاما أمينوبوتيريك والغلوتامات7. جزء من الإصابة الناجمة عن نقص التروية سببه الافراط في إطلاق الغلوتامات وتراكمه عند الشق المشبكى ، مما يؤدي إلى فرط تنشيط مستقبلات N-methyl-D-aspartate ، وتفعيل الشلالات الإشارات المصب ، مما أدى في نهاية المطاف إلى استثارة8. منذ الخلايا الفلكية قادرة على إزالة الغلوتامات من الشق متشابك وتحويلها إلى الجلوتامين، فهي حاسمة في الدفاع ضد السمية، وبالتالي ممارسة تأثير العصبية على نقص تروية. هذه الخلايا تلعب أيضا دورا في نقص التروية الناجمة عن العصبية. بعد الإهانة الإقفاريّة، تخضع الخلايا الفلكية المنشطة لتغييرات مورفولوجية (تضخم)، وتتكاثر، وتظهر زيادة في تعبير البروتين الهرفي الهرفي الحمضي (GFAP). يمكن أن تصبح رد الفعل (astrogliosis), إطلاق السيتوكينات الموالية للالتهابات مثل الورم نخر عامل α, interleukin-1α وinterleukin-1β, وإنتاج الجذور الحرة, بما في ذلك أكسيد النيتريك و superoxide, والتي بدورها يمكن أن تحفز الموت العصبي9,10. في المقابل، قد تلعب الخلايا الفلكية التفاعلية أيضًا تأثيرًا عصبيًا، نظرًا لأنها تطلق السيتوكينات المضادة للالتهابات، مثل تحويل عامل النمو β، الذي يتم تنظيمه بعد السكتة الدماغية11. وعلاوة على ذلك, أنها يمكن أن تولد ندبة الدبقية, التي يمكن أن تحد من تجديد الأنسجة عن طريق تثبيط تنبت محور عصبي; ومع ذلك، يمكن لهذه الندبة الدبقية عزل موقع الإصابة من الأنسجة القابلة للحياة، وبالتالي منع موجة متتالية من تلف الأنسجة غير المنضبط12،13.
وبالتالي، لا بد من إنشاء نماذج تسمح بدراسة التفاعلات العصبية-غليا تحت إصابة إقفاري من أجل العثور على استراتيجيات علاجية تحد أو تعكس آثار الإصابة الإقفاري. مقارنة مع النماذج الأخرى المستخدمة لدراسة إصابة الإقفار، وهي في نماذج vivo 14,15,16, الثقافات العضوية17,18,19 و شرائح الدماغ الحادة20,21,22, الثقافات الأولية الخلية هي أقل تعقيدا, مما يجعل من الممكن دراسة المساهمات الفردية لكل نوع خلية في الفيزيولوجيا المرضية من السكتة الدماغية وكيف يستجيب كل نوع خلية للأهداف العلاجية المحتملة. عادة، من أجل دراسة التفاعلات بين الثقافات المخصبة بالخلايا العصبية والثقافات المخصبة الفلكية، وتستخدم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من أصل ما بعد الولادة23،24، أو الخلايا الدبقية بعد الولادة والخلايا العصبية الجنينية25،26. ويقترح هنا نهجا بسيطا لإنشاء العصبية أو الثقافات المخصب استروينية الخلايا العصبية والخلايا العصبية- غليا الثقافات من نفس الأنسجة. يتم الحصول على هذه الخلايا الأولية من قشرة الجنين الفئران، وهي منطقة تتأثر كثيرا من السكتة الدماغية27،28. وعلاوة على ذلك ، يتم فصل الأنسجة فقط عن طريق إجراء ميكانيكي. لذلك ، يسمح هذا البروتوكول عزل الخلايا في نفس مرحلة التطوير ، بطريقة سريعة وغير مكلفة ، ومع الأداء العالي وقابلية التكاثر.
يمكن استكشاف الحديث المتبادل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام نظام الثقافة المشتركة التي يتم الحفاظ على الخلايا العصبية المستزرعة في الأغطية على اتصال مع أحادية الطبقة من الخلايا الفلكية مبذرة في لوحات متعددة. ويمكن استخدام مجالات البارافين الصغيرة لضمان الفصل بين ثقافتي الخلية. يسمح هذا النهج بمعالجة مستقلة لكل نوع خلية قبل أن يتم الاتصال بها. على سبيل المثال، من الممكن إسكات جين معين في الخلايا الفلكية ونرى كيف يمكن أن تؤثر على ضعف الخلايا العصبية أو الحماية ضد الضرر الناجم عن الإقفار. وهناك طريقة راسخة للحث على حالات تشبه الإقفارية في المختبر هو الأكسجين والحرمان من الجلوكوز (OGD)3، والذي يتكون في استبدال الغلاف الجوي العادي (95٪ الهواء و 5 ٪ CO2)عن طريق الغلاف الجوي anoxic (95 ٪ N2 و 5 ٪ CO2) ، المرتبطة إغفال الجلوكوز.
الطريقة الموصوفة مناسبة لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا الفلكية في سياق السكتة الدماغية الإقفارية ، بطريقة بسيطة وسريعة وقابلة للتكرار وغير مكلفة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

السكتة الدماغية هي حالة سريرية تتميز بنقص في الدم في أنسجة الدماغ ، مما يؤدي إلى الحرمان من الأكسجين والجلوكوز ، وما يترتب على ذلك من فقدان الخلايا العصبية. تشير العديد من الأدلة إلى أن التفاعل بين الخلايا الدبقية والخلايا العصبية يمارس تأثيرات مفيدة بعد حدث نقص تروية. لذلك، لاستكشاف آليات الحماية المحتملة، من المهم تطوير نماذج تسمح بدراسة التفاعلات العصبية-غليا في بيئة نقص تروية. هنا نقدم نهجا بسيطا لعزل الخلايا الفلكية والخلايا العصبية من قشرة الجنين الفئران، وذلك باستخدام وسائل الإعلام ثقافة محددة، ويسمح بإنشاء الثقافات العصبية أو استروينست أو الثقافات العصبية glia مع قابلية إنتاج عالية.
لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، نقترح نهجا يستند إلى نظام الثقافة المشتركة التي يتم الحفاظ على الخلايا العصبية المستزرعة في الأغطية في اتصال مع أحادية من الخلايا الفلكية مطلية في لوحات متعددة. يتم الحفاظ على الثقافتين بعيدا عن طريق مجالات البارافين الصغيرة. هذا النهج يسمح للتلاعب مستقلة وتطبيق علاجات محددة لكل نوع الخلية، والذي يمثل ميزة في العديد من الدراسات.
لمحاكاة ما يحدث أثناء السكتة الدماغية، وتخضع الثقافات إلى الأكسجين والجلوكوز بروتوكول الحرمان. يمثل هذا البروتوكول أداة مفيدة لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في السكتة الدماغية.

لتوصيف الثقافات، تم تنفيذ الكيمياء المناعية لتقييم عدد الخلايا التي أعربت عن GFAP أو MAP2، علامات تستخدم على نطاق واسع من الخلايا الفلكية والخلايا العصبية(الشكل 2)،في كل نوع من الثقافة القشرية. وكشف هذا التحليل أن الثقافات المخصبة الفلكية قدمت 97٪ من الخلايا التي تعبر عن GFAP (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

هنا، نقدم نهجا بسيطا باستخدام وسائل الإعلام الثقافة المحددة التي تسمح بإنشاء الثقافات المخصبة الخلايا العصبية و الفلكية، أو الثقافات العصبية غليا من القشرة الجنينية، مع ارتفاع العائد والتكرار.

نموذج ثقافة الخلية لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في الإقفاري

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

السكتة الدماغية هي حالة سريرية تتميز hypoperfusion من أنسجة الدماغ والنتائج في فقدان الخلايا العصبية. تشير العديد من الأدلة إلى أن التفاعل بين خلايا غليا والمبولة يمارس تأثيرات الضغط بعد حدوث حدث نقص تروية. من أجل استكشاف آليات الحماية المحتملة، من المهم تطوير نماذج تسمح بدراسة التفاعلات العصبية-غليا في بيئة نقص تروية.هنا نقدم نهجا بسيطا لعزل الخلايا الفلكية والخلايا العصبية من قشرة الجنين الفئران، وذلك باستخدام وسيلة ثقافية محددة يسمح بإنشاء الثقافات العصبية أو استروينست أو الثقافات الجديدة غليا مع ارتفاع العائد والتكرار. لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، نقترح نهجا، على أساس نظام الثقافة المشتركة، التي يتم الحفاظ على الخلايا العصبية المستزرعة في زلات الغطاء في اتصال مع أحادية من الخلايا الفلكية مطلية في لوحات متعددة جيدا. حافظت الاثنان ثقافة جزء بصغيرة برافين مجالات.يسمح هذا النهج بالتلاعب المستقل وتطبيق علاج محدد على كل نوع من أنواع الخلايا ، مما يمثل ميزة في العديد من الدراسات. لمحاكاة ما يحدث أثناء السكتة الدماغية، وتخضع الثقافات إلى الأكسجين والجلوكوز بروتوكول الحرمان. يمثل هذا البروتوكول أداة مفيدة لدراسة دور التفاعلات العصبية-غليا في السكتة الدماغية.ابدأ بعزل قشرة الجنينية للفئران. تم الحصول على الأجنة من عائلة من الفئران في 15 يوما من الحمل ويتم وضعها في أنبوب فالكون العقيمة التي تحتوي على PBS. لا تزال داخل أجنة كيس الصفار توضع داخل طبق بتري يحتوي على PBS الباردة.مع مساعدة من مقص والملاقط، وكسر كيس صفار، ويتم إزالة الجنين ووضعها في طبق آخر بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة على حزمة الثلج. من الضروري أن نكون حذرين للغاية عند كسر كيس الصفار لا لتلف الجنين. ضع الجنين تحت مجهر تشريح، وأصلح الجنين بلطف باستخدام الـ twizzer.يجب أن يكون الشق الأولي موازياً للقشرة. يجب الحرص على عدم قطع رأس الحيوان. فروة الرأس ويتم إزالتها بعناية لا لتلف أنسجة الدماغ القشرية.هذا الشق القادم يفصل القشرة إزالة الأوعية الدموية الموجودة في الأنسجة. وأخيرا، باستخدام ماصة، نقل الأنسجة القشرية إلى أنبوب فالكون مع برنامج تلفزيوني.يتم الحصول على تعليق الخلية الواحدة من خلال الهضم الميكانيكي للأنسجة الدماغية القشرية باستخدام نصائح مع انخفاض القطر. تأكد من أن الأنسجة متجانسة جيدا بعد الهضم، والطرد المركزي المواد في 400 Gs لمدة ثلاث دقائق. تجاهل الماوسين، وإعادة تعليق الرواسب في وسط الثقافة، ارتفعت درجة الحرارة سابقا إلى 37 درجة.حساب العدد الإجمالي للخلايا الموجودة في التعليق باستخدام غرفة Neubauer وإعداد التخفيف لكثافة الخلايا الكافية. وأخيرا، بذور الخلايا في متعدد جيدا واحتضان في 37 درجة. من أجل إعداد المواد لنظام الثقافة المشتركة، تسخين البارافين في كتلة التدفئة حتى يصبح السائل.ثم، مع مساعدة من ماصة بستريو الزجاج باستور إعداد المجالات الصغيرة على زلات الغطاء التي كانت وضعت سابقا في بئر متعددة، ومغلفة مع بولي-D-ليسين. 24 ساعات قبل يتم إحضارها الثقافات اثنين في الاتصال, تغيير وسيلة الثقافة من الخلايا العصبية وstrocytes لتكملة ذلك NBM مع أو بدون الحرارة المعطل FBS. عندما تكون الثقافتان جاهزتين للاستخدام ، قم بنقل الخلايا العصبية ، الجالسة في الغطاء مع قسائم البارافين إلى الآبار التي تحتوي على الخلايا الفلكية باستخدام ملاقط مغمورة سابقًا في الإيثانول بنسبة 70٪.بعد وضع كلا النوعين الخلية في الاتصال، انتظر من 8 إلى 12 ساعة، ومن ثم بدء المحفزات المختلفة والإجراءات. يتم تنفيذ الحرمان من الأكسجين والجلوكوز في ثقافة مع سبعة أيام من النمو. إزالة المتوسطة الثقافة، وغسل الخلايا مرتين مع HBSS المتوسطة دون مكملات الجلوكوز.تأكد من غسل جميع الوسيلة التي تحتوي على الجلوكوز. ختم غرفة نقص الأكسجة وإضافة مزيج الغاز التي تحتوي على 95٪ من النيتروجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع دقائق مع تدفق 20 لترا للدقائق من أجل استبدال الأكسجين الموجود داخل الغرفة. ثم، وقف تدفق ووضع غرفة نقص الأكسجة في حاضنة في 37 درجة.بعد فترة من الحرمان من الأوكسجين والجلوكوز، واستبدال المتوسطة، HBSS دون مكملات الجلوكوز مع وسيلة الثقافة المناسبة للإجراءات المتبقية واحتضان الخلايا في 37 درجة. من أجل توصيف نوع من الثقافة القشرية، قمنا بإجراء الكيمياء المناعية في الأنواع الثلاثة من الثقافات القشرية لتقييم عدد الخلايا التي أعرب عن GFPA أو MAP2، والتي هي علامات تستخدم على نطاق واسع للخلايا الفلكية والخلايا العصبية على التوالي. وكشف هذا التحليل أنه عندما هذا البروتوكول، كنا قادرين على الحصول على ثقافة نقية المخصب من الخلايا الفلكية مع حوالي 97٪ من الخلايا التي تعبر عن GFAP.فيما يتعلق بثقافة الخلايا العصبية المخصب، قمنا بالتحقق من حوالي 78٪ من الخلايا التي تعبر عن MAP2. ومع ذلك فإننا نحدد حوالي 18٪ من الخلايا السلبية GFAP و MAP2. بالنسبة لثقافة الخلايا العصبية-glia القشرية, لوحظ أن حوالي 49٪ من الخلايا هي خطة ماب2 إيجابية.31٪ هي GFAP إيجابية. و 20٪ انهم ليسوا مسؤولين عن GFAP ولا MAP2. بعد سبعة أيام من مؤسسة الثقافة القشرية ، خضعت ثقافة الخلايا العصبية -glia والثقافة الغنية بالخلايا العصبية لإجراء OGD لمدة 4 و 6 ساعات.بعد هذا الإجراء، تم تصنيف الخلايا بـ MAP2 ثم تم تحديد عدد الخلايا الإيجابية MAP2 باستخدام المجهر الفلوري. في ثقافة الخلايا العصبية-glia, لوحظ انخفاض حوالي 30٪ في عدد الخلايا العصبية, عندما تم تقديم الثقافة إلى فترة OGD من 4 ساعات. بعد فترة OGD من 6 ساعات ، يزيد امتداد الآفة ، ليصل إلى حوالي 60 ٪ من فقدان الخلايا العصبية.فيما يتعلق بالثقافة المخصب من الخلايا العصبية المعرضة لـ OGD ، لوحظ حوالي 41٪ و 64٪ انخفاض في عدد خلايا MAP2. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن في الثقافة المخصب بالخلايا العصبية، كان هناك زيادة طفيفة في تمديد الإصابة بالمقارنة مع ثقافة الخلايا العصبية-غليا التي تتعرض أيضا لـ OGD خلال 4 ساعات. في الختام، هنا تمثل نموذجا في المختبر لدراسة السكتة الدماغية الإقفارية التي أنشئت بطريقة بسيطة وسريعة ومكلفة وقابلة للتكرار.بالإضافة إلى ذلك، الطريقة المذكورة يسمح أيضا لتنفيذ الخلايا العصبية والثقافات الأولية المخصب الفلكية، ولكن أيضا ثقافة الخلايا العصبية-غليا. وهكذا، وتوفير نموذج كبير في المختبر لنمجة العديد من أمراض الدماغ مع مستوى أعلى من التعقيد، من خطوط الخلايا الخالدة والخلايا العصبية النقية أو الثقافات الدبقية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

إجراء دراسة لإعادة Footshock الناتج عن السعي من الكوكايين في فئران التجارب

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

العزلة والثقافة من الخلايا العصبية كريست من الأنبوبة العصبية الجنينية الفئران

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

أساليب لدراسة آليات عمل المضادة للذهان من أدوية في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

حمل اللدونة من نجمي المستقبلات بواسطة التلاعب أسعار اطلاق النار متعلق بالخلايا العصبية

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

و<em&gt; في المختبر</em&gt; ماوس الكبار إعداد العضلات العصبية لدراسة خصائص اطلاق Afferents العضلات

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

تصوير لايف من النيكوتين المستحثة اشارة الكالسيوم وناقل عصبي الإصدار جنبا إلى جنب بطني الحصين المحاوير

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك<em&gt; في المختبر</em&gt; مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

تقنية الكسور البصرية لتقدير أرقام الخلايا في نموذج الجرذ من العلاج إليكتروكونفولزيف

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...