Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

Forfatterne anerkender fundação para a Ciência e a Tecnologia gennem Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 og stipendiet SFRH/BD/135936/2018 til JP, af ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" gennem projektet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 og finansiering til PPBI-Portuguese Platform of BioImaging gennem projektet POCI-01-0145-FEDER-022122.

Alle anvendte dyr er opdrættet på CICS-UBI Health Science Research Centre i overensstemmelse med de nationale etiske krav til dyreforskning og med den europæiske konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (direktiv 2010/63/EU).
1. Rotte embryo cortex primære cellekultur
<ol><li>Kultur medium forberedelse<ol>
<li>Neurobasal Medium (NBM) klargøres ved at tilsætte følgende kosttilskud: 2% B27, 0,5 mM glutamin, 25 μM glutamat og 120 ...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

Metoden her består af astrocyt og neuron isolation fra rotte embryonale kortikale væv, så etablering af neuron- eller astrocyt-beriget kulturer eller neuron-glia kulturer. Det blev tilpasset fra en tidligere undersøgelse af voresgruppe 5, hvor den kortikale neuron-glia og neuron-beriget embryonale kulturer isolation blev beskrevet, og de to kulturer karakteriseret. Ved hjælp af disse kulturer, Roque et al. fandt, at astrocytter spiller en central rolle i at reagere på en iskæmisk skade og t...

Ifølge data fra Verdenssundhedsorganisationen, omkring 5,5 millioner mennesker dør hvert år fra iskæmisk slagtilfælde1. Denne betingelse er karakteriseret ved afbrydelse af blodgennemstrømningen til en bestemt hjerne region, hvilket resulterer i en reversibel eller irreversibel tab i udbuddet af ilt og næringsstoffer til vævet, som ændrer vævsfunktion og fører til mitokondriel dysfunktion, calcium dysregulation, glutamat excitotoxicity, betændelse og celletab2,3.
Bortset fra vaskulære celler, neuronal og gliaceller er involveret i patofysiologi af iskæmiskslagtilfælde 4. Især astrocytter er afgørende for vedligeholdelsen af neuroner og for nylig blev vist sig at spille en afgørende rolle i reaktionen på den iskæmiske læsion5. Denne type gliacelle udfører funktioner af strukturel støtte, forsvar mod oxidativstress, syntese af neurotransmittere, stabilisering af celle-celle kommunikation, blandt andre6. Sammen med neuroner, astrocytter spiller en direkte rolle i synaptisk transmission, regulerer frigivelsen af molekyler såsom adenosin tripfosfat, gamma-aminosmørsyre og glutamat7. En del af den skade, der forårsages af iskæmi er forårsaget af overdreven frigivelse af glutamat og dens akkumulering på synaptic kløft, fører til overaktivering af N-methyl-D-aspartat receptorer, aktivering downstream signalering kaskader, i sidste ende resulterer i excitotoxicity8. Da astrocytter er i stand til at fjerne glutamat fra den synaptiske kløft og omdanne det til glutamin, de er afgørende for at forsvare sig mod excitotoxicity, og dermed udøve en neuroprotektive virkning på iskæmi. Disse celler spiller også en rolle i iskæmi-induceret neuroinflammation. Efter den iskæmiske fornærmelse, aktiverede astrocytter gennemgå morfologiske ændringer (hypertrofi), formere sig, og viser en stigning i glia fibrillary sure protein (GFAP) udtryk. De kan blive reaktive (astrogliose), frigive pro-inflammatoriske cytokiner såsom tumor nekrose faktor-α, interleukin-1α og interleukin-1β, og producerer frie radikaler, herunder nitrogenoxid og superoxid, som igen kan fremkalde neuronal død9,10. I modsætning hertil kan reaktive astrocytter også spille en neuroprotektive effekt, da de frigiver anti-inflammatoriske cytokiner, såsom at omdanne vækstfaktor-β, der er upregulated efter slagtilfælde11. Desuden kan de generere et glia ar, som kan begrænse væv regenerering ved at hæmme axonal spiring; dette glia-ar kan dog isolere skadesstedet fra levedygtigt væv og dermed forhindre en kaskadebølge af ukontrolleret vævsskade12,13.
Således er det bydende nødvendigt at etablere modeller, der tillader at studere neuron-glia interaktioner under en iskæmisk skade for at finde terapeutiske strategier, der begrænser eller vende virkningerne af iskæmisk skade. Sammenlignet med andremodeller,der anvendes til at studere iskæmisk skade, nemlig in vivo modeller14,15,16, organotypic kulturer17,18,19 ogakut hjerne skiver20,21,22, primære cellekulturer er mindre komplekse, hvilket gør det muligt at undersøge individuelle bidrag af hver celletype i den iskæmiske slagtilfældes patofysiologi, og hvordan hver type celle reagerer på terapeutiske mulige mål. Typisk, for at studere samspillet mellem neuron-beriget kulturer og astrocyt-beriget kulturer, neuroner og gliaceller af postnatal oprindelse anvendes23,,24, eller postnatal gliaceller og embryonale neuroner25,26. Heri foreslås en enkel tilgang til at etablere neuron- eller astrocyt-beriget kulturer og neuron-glia kulturer fra samme væv. Disse primære celler er fremstillet af rotte embryonale cortex, en region ofte påvirket afslagtilfælde 27,28. Desuden foretages dissociationen af vævet kun ved en mekanisk procedure. Derfor giver denne protokol mulighed for at isolere celler i samme udviklingsfase, på en hurtig og billig måde og med høj ydeevne og reproducerbarhed.
Krydstale mellem astrocytter og neuroner kan udforskes ved hjælp af en co-kultur system, hvor neuroner dyrket i coverslips opretholdes i kontakt med en monolayer af astrocytter seedet i multiwell plader. Små paraffinkugler kan bruges til at sikre adskillelsen af de to cellekulturer. Denne fremgangsmåde giver mulighed for uafhængig manipulation af hver celletype, før de bringes i kontakt. For eksempel er det muligt at lukke munden på et bestemt gen i astrocytter og se, hvordan det kan påvirke den neuronale sårbarhed eller beskyttelse mod iskæmisk-induceret skade. En etableret metode til at fremkalde iskæmisk-lignende forhold in vitro er ilt og glukosemangel (OGD)3, som består i at erstatte den regelmæssige atmosfære (95% luft og 5% CO2)med en anoxisk atmosfære (95% N2 og 5% CO2), forbundet med udeladelse af glukose.
Den beskrevne metode er egnet til at studere samspillet mellem neuroner og astrocytter i forbindelse med iskæmisk slagtilfælde, på en enkel, hurtig, reproducerbar og billig måde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

Iskæmisk slagtilfælde er en klinisk tilstand karakteriseret ved hypoperfusion af hjernevæv, fører til ilt og glukose afsavn, og den deraf følgende neuronal tab. Talrige beviser tyder på, at samspillet mellem glia og neuronal celler udøve gavnlige virkninger efter en iskæmisk begivenhed. Derfor, at udforske potentielle beskyttende mekanismer, Er det vigtigt at udvikle modeller, der tillader at studere neuron-glia interaktioner i et iskæmisk miljø. Heri præsenterer vi en enkel tilgang til at isolere astrocytter og neuroner fra rotte embryonale cortex, og at ved hjælp af specifikke kultur medier, giver mulighed for etablering af neuron- eller astrocyt-beriget kulturer eller neuron-glia kulturer med højt udbytte og reproducerbarhed.
For at studere krydstale mellem astrocytter og neuroner, foreslår vi en tilgang baseret på en co-kultur system, hvor neuroner dyrket i coverslips opretholdes i kontakt med en monolayer af astrocytter belagt i multiwell plader. De to kulturer bevares af små paraffinsfærer. Denne fremgangsmåde giver mulighed for uafhængig manipulation og anvendelse af specifikke behandlinger til hver celletype, hvilket udgør en fordel i mange undersøgelser.
For at simulere, hvad der sker under en iskæmisk slagtilfælde, er kulturerne udsat for en ilt og glukose afsavn protokol. Denne protokol repræsenterer et nyttigt værktøj til at studere den rolle, neuron-glia interaktioner i iskæmisk slagtilfælde.

For at karakterisere de kulturer, immunocytokemi at vurdere antallet af celler, der udtrykte GFAP eller MAP2, udbredte markører for astrocytter og neuroner (Figur 2), blev udført i hver type kortikale kultur. Denne analyse viste, at astrocyteberigede kulturer præsenterede 97 % af de celler, der udtrykker GFAP (figur 2A). Med hensyn til neuronberiget kultur udtrykte 78 % af cellerne MAP2, 4 % af cellerne gfap, og 18 % af cellerne var både GFAP og MAP2-negativ...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Her præsenterer vi en enkel tilgang ved hjælp af specifikke kulturmedier, der gør det muligt at etablere neuron- og astrocytberigede kulturer eller neurongliakulturer fra embryonale cortex, med højt udbytte og reproducerbarhed.

En cellekultur model for at studere den rolle, Neuron-Glia interaktioner i Iskæmi

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Iskæmisk slagtilfælde er en klinisk tilstand karakteriseret ved hypoperfusion af hjernevæv og resulterer i neuronal tab. Talrige beviser tyder på, at samspillet mellem glia og urinalceller udøve trykvirkninger efter en iskæmisk begivenhed. For at udforske potentielle beskyttende mekanismer, Er det vigtigt at udvikle modeller, der tillader at studere neuron-glia interaktioner i et iskæmisk miljø.Her præsenterer vi en enkel tilgang til at isolere astrocytter og neuroner fra rotte embryonale cortex, og at ved hjælp af specifikke kulturelle medium giver mulighed for etablering af neuron eller astrocyt-beriget kulturer eller neo-glia kulturer med højt udbytte og reproducerbarhed. For at studere krydstale mellem astrocytter og neuroner, foreslår vi en tilgang, baseret på en co-kultur system, hvor neuroner dyrket i dækning slips opretholdes i kontakt med en monolayer af astrocytter belagt i multi-brønd plader. De to kulturer opretholdes en del af små paraffin kugler.Denne fremgangsmåde giver mulighed for uafhængig manipulation og anvendelse af specifik behandling på hver celletype, hvilket udgør en fordel i mange undersøgelser. For at simulere, hvad der sker under en iskæmisk slagtilfælde, er kulturerne udsat for en ilt og glukose afsavn protokol. Denne protokol repræsenterer et nyttigt værktøj til at studere den rolle, neuron-glia interaktioner i iskæmisk slagtilfælde.Start med rotte embryonale cortex isolering. Embryonerne blev fremstillet af en familie af rotter efter 15 dages drægtighed og anbringes i et sterilt Falcon-rør indeholdende PBS. Stadig inde i æggeblomme pose embryoner er placeret inde i en petriskål, der indeholder kolde PBS.Ved hjælp af saks og pincet brydes blommesækken, og fosteret fjernes og placeres i en anden petriskål, der indeholder kold PBS over en ispose. Det er nødvendigt at være meget forsigtig, når bryde blomme sæk ikke at beskadige fosteret. Anbring fosteret under et dissekerende mikroskop, fastgør forsigtigt embryonet med en twizzer.Det indledende snit bør være parallelt med cortex. Pas på ikke at halshugge dyret. Hovedbunden og fjernes omhyggeligt for ikke at beskadige det kortikale hjernevæv.Dette næste snit adskiller cortex. Fjern blodkarrene til stede i vævet. Endelig, ved hjælp af en pipette, overføre kortikale væv til en Falcon rør med PBS.Den encellede suspension opnås gennem mekanisk fordøjelse af det kortikale hjernevæv ved hjælp af spidser med faldende diameter. Sørg for, at vævet er godt homogeniseret Efter fordøjelsen centrifuger materialet ved 400 Gs i tre minutter. Kassér supernatanten, og resuspend sedimentet i kulturmedium, der tidligere blev opvarmet til 37 grader.Det samlede antal celler, der er til stede i suspensionen, beregnes ved hjælp af et Neubauerkammer, og fortyndelsen for den passende celletæthed beregnes. Endelig frø cellerne i multi-brønd og inkubere ved 37 grader. For at forberede materialet til co-kultursystemet opvarmes paraffinen i en varmeblok, indtil det bliver flydende.Derefter, ved hjælp af et stereoglas Pasteur pipette forberede små kugler over dækslet glider, der tidligere blev placeret i en multi-godt, og belagt med Poly-D-Lysin. 24 timer før de to kulturer bringes i kontakt, ændre kultur medium af neuroner og astrocytter at supplere det NBM med eller uden varme inaktiveret FBS. Når de to kulturer er klar til brug, overføre neuron, siddende i dækslet glider med paraffin kugler til brønde, der indeholder astrocytter ved hjælp af en pincet tidligere nedsænket i 70% ethanol.Efter at have placeret begge celletyper i kontakt, skal du vente otte til 12 timer og derefter starte de forskellige stimuli og procedurer. Ilt og glukose afsavn udføres i en kultur med syv dages vækst. Fjern kulturmediet, og vask cellerne to gange med HBSS medium uden glukosetilskud.Sørg for, at alt medium, der indeholder glukose, vaskes. Forsegle Hypoxi Afdeling og tilsæt gasmix indeholder 95% kvælstof og 5% kuldioxid i fire minutter med en strøm af 20 liter i minutter for at erstatte ilt til stede inde i kammeret. Derefter stoppe strømmen og placere Hypoxi Afdeling i en inkubator på 37 grader.Efter perioden med ilt og glukose afsavn, erstatte medium, HBSS uden glukose tilskud med passende kultur medium for de resterende procedurer og inkubere cellerne ved 37 grader. For at karakterisere den type kortikal kultur, vi udførte immunhistrokemi i de tre typer af kortikale kulturer til at vurdere antallet af celler, der udtrykte GFPA eller MAP2, som er markører meget udbredt for astrocytiske og neuronale celler hhv. Disse analyser viste, at når denne protokol, vi var i stand til at opnå en ren beriget kultur af astrocytter med omkring 97% af cellerne udtrykker GFAP.Med hensyn til neuron-beriget kultur, vi verificeret omkring 78% af de celler, der udtrykker MAP2. Men vi identificerer omkring 18% af GFAP og MAP2 negative celler. For neuron-glia kortikale kultur, Det blev observeret, at omkring 49% af cellerne er MAP2 positive.31% er GFAP positiv. Og 20% de er ikke ansvarlige for GFAP eller MAP2. Syv dage efter den kortikale kulturvirksomhed blev neurongliakulturen og den neuronberigede kultur underkastet en OGD-procedure i 4 og 6 timer.Efter denne procedure blev celler mærket med MAP2, og derefter blev antallet af MAP2-positive celler kvantificeret ved hjælp af fluorescensmikroskopi. I neuron-glia kultur, Det blev observeret et fald på omkring 30% i antallet af neuroner, når kulturen blev forelagt en OGD periode på 4 timer. Efter en OGD periode på 6 timer, udvidelsen af læsionen stiger, nå omkring 60% af neuronal tab.Med hensyn til den berigede kultur af neuroner udsat for OGD, det blev observeret omkring 41% og 64% fald i antallet af MAP2 celler. Desuden blev det bemærket, at der i den neuronberigede kultur var en lille stigning i skadesforlængelsen sammenlignet med neurongliakulturen, der også blev eksponeret for OGD i løbet af 4 timer. Afslutningsvis repræsenterer her en in vitro model til at studere iskæmisk slagtilfælde etableret på en enkel, hurtig og dyr og reproducerbar måde.Derudover, den beskrevne metode giver også mulighed for at gennemføre neuroner og astrocyte-beriget primære kulturer, men også en neuron-glia kultur. Således giver en stor in-vitro model for modellering flere hjernesygdomme med et højere niveau af kompleksitet, end udødeliggjorte cellelinjer og ren neuronal eller glia kulturer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dobbelte Elektrofysiologiske Optagelser af synaptisk-evoked astrogliale og Neuronal respons i Akut hippocampusskiver

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder til undersøgelse af virkningsmekanismer for antipsykotika i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende plasticitet astrocytisk receptorer ved manipulation af neuronfyring priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Voksen Mouse Muskel-nerve Forberedelse til at studere affyringen Egenskaber af Muscle afferenter

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging af Nikotin induceret Calcium Signaling og neurotransmitterfrigivelse Langs ventrale Hippocampale Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Udnytte Kombineret Metoder til Definer rolle plasmamembranen Delivery Under Axon Forgrening og neuronal Morfogenese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Den Indirekte Neuron-astrocyt cokultur assay: En<em&gt; In vitro</em&gt; Opsætning for detaljeret undersøgelse af Neuron-glia Interaktioner

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Den optiske fraktioneringsteknik til estimering af celle tal i en rotte model for elektrokonvulsiv terapi

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...