Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

De auteurs erkennen de financieringssteun van Fundação para a Ciência e a Tecnologia via Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 en de beurs SFRH/BD/135936/2018 aan JP, door ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" via het project CENTRO-01-0145-FEDER-000013 en financiering aan het PPBI-Portugees Platform of BioImaging via het project POCI-01-0145-FEDER-022122.

Alle gebruikte dieren werden gefokt in het CICS-UBI Health Science Research Centre in overeenstemming met de nationale ethische eisen voor dieronderzoek en met het Europees Verdrag tot bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (Richtlijn 2010/63/EU).
1. Rat embryo cortex primaire celcultuur
<ol><li>Cultuur medium voorbereiding<ol>
<li>Bereid het Neurobasal Medium (NBM) voor door de volgende supplementen toe te voegen: 2% B...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

De hier beschreven methode bestaat uit de astrocyten- en neuronisolatie van ratembryonal corticaal weefsel, waardoor neuron- of astrocytenverrijkte culturen of neuron-gliaculturen kunnen worden opgericht. Het werd aangepast aan een eerdere studie van onze groep5, waar de corticale neuron-glia en neuron-verrijkte embryonale culturen isolatie werden beschreven en de twee culturen gekenmerkt. Met behulp van deze culturen, Roque et al. vond dat astrocyten een belangrijke rol spelen bij het reageren op...

Volgens gegevens van de Wereldgezondheidsorganisatie sterven jaarlijks ongeveer 5,5 miljoen mensen aan ischemische beroerte1. Deze aandoening wordt gekenmerkt door de onderbreking van de bloedtoevoer naar een bepaald hersengebied, wat resulteert in een omkeerbaar of onomkeerbaar verlies in de toevoer van zuurstof en voedingsstoffen naar het weefsel, wat de weefselfunctie verandert en leidt tot mitochondriale disfunctie, calciumdysregulatie, glutamaat excitotoxiciteit, ontsteking en celverlies2,3.
Afgezien van vasculaire cellen, neuronale en gliacellen zijn betrokken bij de pathofysiologie van de ischemische beroerte4. In het bijzonder, astrocyten zijn essentieel voor het onderhoud van neuronen en onlangs bleek een cruciale rol te spelen in de reactie op de ischemische laesie5. Dit type gliacel vervult functies van structurele ondersteuning, verdediging tegen oxidatieve stress, synthese van neurotransmitters, stabilisatie van celcelcommunicatie, onder andere6. Samen met neuronen, astrocyten spelen een directe rol in synaptische transmissie, het reguleren van de afgifte van moleculen zoals adenosine triphosfat, gamma-aminoboterzuur en glutamaat7. Een deel van de schade veroorzaakt door ischemie wordt veroorzaakt door de overmatige afgifte van glutamaat en de accumulatie ervan op de synaptische kloof, wat leidt tot de overactivatie van N-methyl-D-aspartaatreceptoren, het activeren van downstream signaalcascades, wat uiteindelijk resulteert in excitotoxiciteit8. Aangezien astrocyten glutamaat uit de synaptische kloof kunnen verwijderen en omzetten in glutamine, zijn ze cruciaal in het verdedigen tegen excitotoxiciteit, waardoor een neuroprotectief effect op ischemie wordt uitgeoefend. Deze cellen spelen ook een rol in ischemie-geïnduceerde neuro-ontsteking. Na de ischemische belediging ondergaan geactiveerde astrocyten morfologische veranderingen (hypertrofie), vermenigvuldigen, en tonen een toename van de gliafibrillaire zure eiwit (GFAP) expressie. Ze kunnen reactief worden (astroglise), het vrijgeven van pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrose factor-α, interleukine-1α en interleukine-1β, en het produceren van vrije radicalen, waaronder stikstofmonoxide en superoxide, die op hun beurt kan leiden tot neuronale dood9,10. In tegenstelling, reactieve astrocyten kunnen ook een neuroprotectief effect spelen, omdat ze ontstekingsremmende cytokinen afgeven, zoals het transformeren van groeifactor-β, die na beroerte11upgereguleerd is. Bovendien kunnen ze een glialitteken genereren, dat weefselregeneratie kan beperken door het remmen van axonale kiemen; dit glialitteken kan echter de letselplaats isoleren van levensvatbaar weefsel, waardoor een trapsgewijze golf van ongecontroleerde weefselschade12,13wordt voorkomen .
Zo is het noodzakelijk om modellen vast te stellen die het mogelijk maken het bestuderen van neuron-glia interacties onder een ischemische schade om therapeutische strategieën die beperken of omkeren van de effecten van ischemische letsel te vinden. In vergelijking met andere modellen die worden gebruikt om ischemische letsel te bestuderen, namelijk in vivo modellen14,15,16, organotypic culturen17,18,19 en acute hersenschijfjes20,21,22, primaire celculturen zijn minder complex, waardoor de studie van individuele bijdragen van elk celtype in de pathofysiologie van ischemische beroerte en hoe elk celtype reageert op mogelijke therapeutische doelen mogelijk maakt. Typisch, om de interacties tussen neuron-verrijkte culturen en astrocyten verrijkte culturen te bestuderen, neuronen en gliacellen van postnatale oorsprong worden gebruikt23,,24, of postnatale gliacellen en embryonale neuronen25,26. Hierin wordt voorgesteld een eenvoudige aanpak om neuron- of astrocyten verrijkte culturen en neuron-glia culturen vast te stellen uit hetzelfde weefsel. Deze primaire cellen worden verkregen uit rat embryonale cortex, een gebied vaak beïnvloed door beroerte27,28. Bovendien wordt de dissociatie van het weefsel alleen uitgevoerd door een mechanische procedure. Daarom maakt dit protocol het isoleren van cellen in dezelfde ontwikkelingsfase mogelijk, op een snelle en goedkope manier, en met hoge prestaties en reproduceerbaarheid.
De crosstalk tussen astrocyten en neuronen kan worden onderzocht met behulp van een co-cultuur systeem waarin neuronen gekweekt in coverslips worden onderhouden in contact met een monolaag van astrocyten gezaaid in multiwell platen. Kleine paraffinebollen kunnen worden gebruikt om de scheiding van de twee celculturen te garanderen. Deze aanpak maakt onafhankelijke manipulatie van elk celtype mogelijk voordat ze in contact worden gebracht. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een specifiek gen in astrocyten het zwijgen op te leggen en te zien hoe het de neuronale kwetsbaarheid of bescherming tegen ischemische schade kan beïnvloeden. Een gevestigde methode om ischemische omstandigheden in vitro te induceren is zuurstof- en glucosedeprivatie (OGD)3, die bestaat in het vervangen van de reguliere atmosfeer (95% lucht en 5% CO2)door een anoxische atmosfeer (95% N2 en 5% CO2), geassocieerd met het weglaten van glucose.
De beschreven methode is geschikt voor het bestuderen van de interacties tussen neuronen en astrocyten in de context van ischemische beroerte, op een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en goedkope manier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

Ischemische beroerte is een klinische aandoening gekenmerkt door hypoperfusie van hersenweefsel, wat leidt tot zuurstof- en glucosedeprivatie, en het daaruit voortvloeiende neuronale verlies. Tal van aanwijzingen dat de interactie tussen glia- en neuronale cellen gunstige effecten uitoefent na een ischemische gebeurtenis. Daarom, om potentiële beschermende mechanismen te verkennen, is het belangrijk om modellen te ontwikkelen die het mogelijk maken neuron-glia interacties in een ischemische omgeving te bestuderen. Hierin presenteren we een eenvoudige aanpak om astrocyten en neuronen te isoleren van de rat embryonale cortex, en dat met behulp van specifieke cultuur media, maakt de oprichting van neuron- of astrocyten verrijkt culturen of neuron-glia culturen met een hoge opbrengst en reproduceerbaarheid.
Om de crosstalk tussen astrocyten en neuronen te bestuderen, stellen we een aanpak voor op basis van een co-cultuursysteem waarbij neuronen gekweekt in coverslips in contact worden gehouden met een monolaag van astrocyten in multiwellplaten. De twee culturen worden gescheiden gehouden door kleine paraffinebollen. Deze aanpak maakt het mogelijk de onafhankelijke manipulatie en de toepassing van specifieke behandelingen op elk celtype, die een voordeel in veel studies vertegenwoordigt.
Om te simuleren wat er gebeurt tijdens een ischemische beroerte, worden de culturen onderworpen aan een zuurstof- en glucosedeprivatieprotocol. Dit protocol is een nuttig hulpmiddel om de rol van neuron-glia interacties in ischemische beroerte te bestuderen.

Om de culturen te karakteriseren, immunocytochemie om het aantal cellen dat GFAP of MAP2 uitgedrukt, op grote schaal gebruikte markers van astrocyten en neuronen (figuur 2) te beoordelen werd uitgevoerd in elk type van corticale cultuur. Deze analyse toonde aan dat met astrocyten verrijkte culturen 97% van de cellen presenteerden die GFAP uitdrukken (figuur 2A). Met betrekking tot de neuron-verrijkte cultuur 78% van de cellen uitgedrukt MAP2, 4% van de cellen ui...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Hier presenteren we een eenvoudige aanpak met behulp van specifieke cultuurmedia die de oprichting van neuron- en astrocytenverrijkte culturen, of neuron-glia culturen uit de embryonale cortex, met hoge opbrengst en reproduceerbaarheid mogelijk maakt.

Een cel cultuur model voor het bestuderen van de rol van Neuron-Glia Interacties in Ischemie

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Ischemische beroerte is een klinische aandoening gekenmerkt door hypoperfusie van hersenweefsel en resulteert in neuronale verlies. Talrijke aanwijzingen suggereren dat de interactie tussen glia en urinoir cellen de druk effecten uitoefenen na een ischemische gebeurtenis. Om potentiële beschermende mechanismen te verkennen, is het belangrijk om modellen te ontwikkelen die het mogelijk maken neuron-glia interacties in een ischemische omgeving te bestuderen.Hier presenteren we een eenvoudige aanpak om astrocyten en neuronen te isoleren van rat embryonale cortex, en dat met behulp van specifieke culturele medium maakt de oprichting van neuron of astrocyten verrijkt culturen of neo-glia culturen met een hoge opbrengst en reproduceerbaarheid. Om de crosstalk tussen astrocyten en neuronen te bestuderen, stellen we een aanpak voor, gebaseerd op een co-cultuursysteem, waarbij neuronen gekweekt in coverslips in contact worden gehouden met een monolaag van astrocyten in multi-well platen. De twee culturen worden gehandhaafd een deel door kleine paraffinebollen.Deze aanpak maakt onafhankelijke manipulatie en de toepassing van specifieke behandeling op elk celtype mogelijk, wat een voordeel is in veel studies. Om te simuleren wat er gebeurt tijdens een ischemische beroerte, worden de culturen onderworpen aan een zuurstof- en glucosedeprivatieprotocol. Dit protocol is een nuttig hulpmiddel om de rol van neuron-glia interacties in ischemische beroerte te bestuderen.Begin met rattenembryonal cortex isolatie. De embryo's werden verkregen uit een familie van ratten op 15 dagen van de dracht en worden geplaatst in een steriele Falcon buis met PBS. Nog steeds in de dooier zakje embryo's worden geplaatst in een petrischaal met koude PBS.Met behulp van een schaar en pincet wordt de dooierzak gebroken en wordt het embryo verwijderd en in een andere petrischaal met koude PBS over een ijslaag geplaatst. Het is noodzakelijk om heel voorzichtig te zijn bij het breken van de dooierzak om het embryo niet te beschadigen. Plaats het embryo onder een ontledenmicroscoop, bevestig het embryo voorzichtig met behulp van een twizzer.De initiële incisie moet parallel zijn aan de cortex. Pas op dat u het dier niet onthoofdt. De hoofdhuid en worden zorgvuldig verwijderd om het corticale hersenweefsel niet te beschadigen.Deze volgende incisie scheidt de cortex. Verwijder de bloedvaten aanwezig in het weefsel. Ten slotte, met behulp van een pipet, breng het corticale weefsel naar een Falcon buis met PBS.De eencellige suspensie wordt verkregen door mechanische vertering van het corticale hersenweefsel met behulp van tips met afnemende diameter. Zorg ervoor dat het weefsel goed gehomogeniseerd is Na de spijsvertering, centrifuge het materiaal op 400 Gs gedurende drie minuten. Gooi het supernatant weg en verhoog het sediment in kweekmedium, dat eerder werd opgewarmd tot 37 graden.Bereken het totale aantal cellen dat in de suspensie aanwezig is met behulp van een Neubauer-kamer en bereid de verdunning voor op de voldoende celdichtheid. Ten slotte, zaad de cellen in de multi-well en incubeer op 37 graden. Om het materiaal voor te bereiden op het co-cultuursysteem, verwarmt u de paraffine in een verwarmingsblok totdat het vloeibaar wordt.Dan, met behulp van een stereo-glas Pasteur pipet bereiden kleine bollen over de cover slips die eerder werden geplaatst in een multi-well, en bekleed met Poly-D-Lysine. 24 uur voordat de twee culturen in contact worden gebracht, verander het kweekmedium van neuronen en astrocyten om het aan te vullen MET OF zonder warmte geïnactiveerde FBS. Wanneer de twee culturen klaar zijn voor gebruik, breng het neuron, zittend in de cover slips met paraffine bollen naar putten met behulp van astrocyten met behulp van een pincet eerder ondergedompeld in 70%ethanol.Na het plaatsen van beide celtypen in contact, wacht acht tot 12 uur en start vervolgens de verschillende stimuli en procedures. De zuurstof- en glucosedeprivatie wordt uitgevoerd in een cultuur met zeven dagen groei. Verwijder het kweekmedium en was de cellen twee keer met HBSS-medium zonder glucosesuppletie.Zorg ervoor dat al het medium met glucose wordt gewassen. Verzegel de Hypoxia kamer en voeg het gasmengsel met 95% stikstof en 5% kooldioxide gedurende vier minuten met een stroom van 20 liter gedurende minuten om de aanwezige zuurstof in de kamer te vervangen. Stop vervolgens de stroom en plaats de Hypoxia-kamer in een couveuse op 37 graden.Na de periode van zuurstof- en glucosedeprivatie, vervang het medium, HBSS zonder glucosesuppletie met het juiste kweekmedium voor de resterende procedures en broed de cellen uit op 37 graden. Om het type corticale cultuur te karakteriseren, voerden we immunohistochemie uit in de drie soorten corticale culturen om het aantal cellen te beoordelen dat GFPA of MAP2 uitdrukte, die markers zijn die op grote schaal worden gebruikt voor respectievelijk astrocytische en neuronale cellen. Deze analyse toonde aan dat toen dit protocol, we in staat waren om een zuiver verrijkte cultuur van astrocyten te verkrijgen met ongeveer 97% van de cellen die GFAP uitdrukken.Met betrekking tot de neuron-verrijkte cultuur, hebben we geverifieerd ongeveer 78% van de cellen uitdrukken MAP2. We identificeren echter ongeveer 18% van de negatieve GFAP- en MAP2-cellen. Voor de neuron-glia corticale cultuur, Het werd waargenomen dat ongeveer 49% van de cellen zijn MAP2 positief.31% is GFAP positief. En 20% ze zijn niet aansprakelijk voor GFAP noch MAP2. Zeven dagen na de corticale cultuur inrichting, de neuron-glia cultuur en de neuron-verrijkte cultuur werden onderworpen aan een OGD procedure voor 4 en 6 uur.Na deze procedure werden cellen gelabeld met MAP2 en vervolgens werd het aantal MAP2 positieve cellen gekwantificeerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. In neuron-glia cultuur, het werd waargenomen een daling van ongeveer 30% in het aantal neuronen, toen de cultuur werd voorgelegd aan een OGD periode van 4 uur. Na een OGD-periode van 6 uur neemt de uitbreiding van de laesie toe, tot ongeveer 60% van het neuronale verlies.Met betrekking tot de verrijkte cultuur van neuronen blootgesteld aan OGD, het werd waargenomen ongeveer 41%en 64% daling van het aantal MAP2 cellen. Bovendien werd opgemerkt dat in de neuron-verrijkte cultuur, was er een lichte toename van de schade uitbreiding in vergelijking met de neuron-glia cultuur ook blootgesteld aan OGD gedurende 4 uur. Tot slot, hier vertegenwoordigen een in vitro model om ischemische beroerte gevestigd in een eenvoudige, snelle en dure en reproduceerbare manier te bestuderen.Bovendien, de beschreven methode maakt het ook mogelijk om neuronen en astrocyten verrijkte primaire culturen te implementeren, maar ook een neuron-glia cultuur. Dus, het verstrekken van een grote in-vitro model voor het modelleren van verschillende hersenziekten met een hoger niveau van complexiteit, dan vereeuwigde cellijnen en pure neuronale of gliaculturen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

A Procedure voor het bestuderen van de Footshock-Induced Herstel van cocaïne Seeking in laboratoriumratten

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbele Elektrofysiologische Opnames van synaptisch-opgeroepen astrogliale en Neuronale responsen bij acute hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methoden voor het bestuderen van de werkingsmechanismen van Antipsychotica in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducerende Plasticiteit van astrocyten receptoren door Manipulatie van neuronale tarieven

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse spier-zenuw Voorbereiding voor het bestuderen van de Firing Eigenschappen van Muscle afferenten

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging van Nicotine Induced Calcium Signaling en neurotransmitterafgifte Samen ventrale hippocampus Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

De indirecte Neuron-astrocyten Coculture Assay: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up voor het gedetailleerd onderzoek van het neuron-glia interacties

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

De optische fractioneringstechniek om cijfers te berekenen in een ratmodel van elektroconvulsieve therapie

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...