Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

Die Autoren würdigen die finanzielle Unterstützung durch Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia durch die Projekte UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 und das Stipendium SFRH/BD/135936/2018 an JP, von ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' durch das Projekt CENTRO-01-0145-FEDER-000013 und Finanzierung der PPBI-portugiesischen Plattform von BioImaging durch das Projekt POCI-01-0145-FEDER-022122.

Alle verwendeten Tiere wurden im CICS-UBI Health Science Research Centre gemäß den nationalen ethischen Anforderungen für die Tierforschung und mit der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke (Richtlinie 2010/63/EU) gezüchtet.
1. Ratte Embryo Cortex primäre Zellkultur
<ol><li>Kulturmedium Vorbereitung<ol>
<li>Bereiten Sie das Neurobasal Medium (NBM) vor, indem Sie die folgenden Ergänzungen hinzufügen: 2% B27, 0,5 mM ...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

Die hier beschriebene Methode besteht aus der Astrozyten- und Neuronenisolation aus dem embryonalen kortikalen Gewebe der Ratte, die die Etablierung neuron- oder astrozytierter Kulturen oder neuronglia-Kulturen ermöglicht. Es wurde aus einer früheren Studie unserer Gruppe5adaptiert, in der die kortikale Neuron-Glia und neuron-angereicherte embryonale Kulturen Isoliertheit beschrieben und die beiden Kulturen charakterisiert wurden. Mit diesen Kulturen, Roque et al. fand heraus, dass Astrozyten sp...

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation sterben jedes Jahr etwa 5,5 Millionen Menschen an ischämischen Schlaganfällen1. Dieser Zustand ist durch die Unterbrechung des Blutflusses in eine bestimmte Hirnregion gekennzeichnet, was zu einem reversiblen oder irreversiblen Verlust in der Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff und Nährstoffen führt, was die Gewebefunktion verändert und zu mitochondrialer Dysfunktion, Kalziumdysregulation, Glutamatexzitotoxizität, Entzündung und Zellverlustführt 2,3.
Neben Gefäßzellen sind neuronale und gliale Zellen an der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfallsbeteiligt 4. Insbesondere Sind Astrozyten für die Aufrechterhaltung von Neuronen von wesentlicher Bedeutung und haben in jüngster Zeit gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf die ischämische Läsion5spielen. Diese Art von Gliazelle erfüllt Funktionen der strukturellen Unterstützung, Abwehr gegen oxidativen Stress, Synthese von Neurotransmittern, Stabilisierung der Zell-Zell-Kommunikation, unter anderem6. Zusammen mit Neuronen spielen Astrozyten eine direkte Rolle bei der synaptischen Übertragung und regulieren die Freisetzung von Molekülen wie Adenosintriphosphat, Gamma-Aminobuttersäure und Glutamat7. Ein Teil der durch Ischämie induzierten Verletzung wird durch die übermäßige Freisetzung von Glutamat und seine Akkumulation am synaptischen Spalt verursacht, was zur Überaktivierung von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren führt, die nachgeschaltete Signalkaskaden aktivieren, was letztlich zu Exzitotoxizität8führt. Da Astrozyten in der Lage sind, Glutamat aus dem synaptischen Spalten zu entfernen und in Glutamin umzuwandeln, sind sie entscheidend für die Abwehr von Exzitotoxizität und üben damit eine neuroprotektive Wirkung auf Ischämie aus. Diese Zellen spielen auch eine Rolle bei Derischämie-induzierten Neuroinflammation. Nach der ischämischen Beleidigung ereignen sich aktivierte Astrozyten morphologischen Veränderungen (Hypertrophie), vermehren sich und zeigen eine Zunahme der glialen fibrillären sauren Proteinexpression (GFAP). Sie können reaktiv werden (Astrogliose), pro-inflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1 und Interleukin-1" freisetzen und freie Radikale, einschließlich Stickstoffmonoxid und Superoxid, produzieren, die wiederum den neuronalenTod9,10induzieren können. Im Gegensatz dazu können reaktive Astrozyten auch eine neuroprotektive Wirkung spielen, da sie entzündungshemmende Zytokine freisetzen, wie z. B. die Transformation von Wachstumsfaktor-β, das nach Schlaganfall11hochreguliert ist. Darüber hinaus können sie eine gliaale Narbe erzeugen, die die Geweberegeneration durch Hemmung des axonalen Keimens einschränken kann; diese Glianarbe kann jedoch die Verletzungsstelle von lebensfähigem Gewebe isolieren und so eine kaskadierende Welle unkontrollierter Gewebeschäden verhindern12,13.
Daher ist es unerlässlich, Modelle zu etablieren, die die Untersuchung von neuron-glia Wechselwirkungen unter einer ischämischen Verletzung ermöglichen, um therapeutische Strategien zu finden, die die Auswirkungen ischämischer Verletzungen begrenzen oder umkehren. Im Vergleich zu anderen Modellen zur Erforschung ischämischer Verletzungen, nämlich in vivo-Modellen 14,15,16, organotypische Kulturen17,18,19 und akute Hirnscheiben20,21,22, sind primäre Zellkulturen weniger komplex, was die Untersuchung einzelner Beiträge jedes Zelltyps in der Pathophysiologie des ischämischen Schlaganfalls ermöglicht und wie jeder Zelltyp auf mögliche therapeutische Ziele reagiert. Typischerweise werden zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen neuronangereicherten Kulturen und astrozytenangereicherten Kulturen, Neuronen und Gliazellen postnatalen Ursprungs23,,24oder postnatale Gliazellen und embryonale Neuronen25,26verwendet. Hierin wird ein einfacher Ansatz vorgeschlagen, um neuron- oder astrozytenangereicherte Kulturen und Neuron-Glia-Kulturen aus demselben Gewebe zu etablieren. Diese Primärzellen werden aus dem embryonalen Kortex der Ratte gewonnen, einer Region, die häufig von Schlaganfall27,28betroffen ist. Darüber hinaus wird die Dissoziation des Gewebes nur durch ein mechanisches Verfahren durchgeführt. Daher ermöglicht dieses Protokoll die Isolierung von Zellen im gleichen Entwicklungsstadium, auf eine schnelle und kostengünstige Weise und mit hoher Leistung und Reproduzierbarkeit.
Das Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen kann mit einem Kokultursystem erforscht werden, in dem neuronenkultivierte In-Coverlips kultivierte Neuronen in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Multiwell-Platten gesät sind. Kleine Paraffinkugeln können verwendet werden, um die Trennung der beiden Zellkulturen zu gewährleisten. Dieser Ansatz ermöglicht eine unabhängige Manipulation jedes Zelltyps, bevor sie in Kontakt gebracht werden. Zum Beispiel ist es möglich, ein bestimmtes Gen in Astrozyten zum Schweigen zu bringen und zu sehen, wie es die neuronale Verletzlichkeit oder den Schutz vor ischämisch induzierten Schäden beeinflussen kann. Eine etablierte Methode zur Induzieren ischämisch-ähnlicher Bedingungen in vitro ist Sauerstoff- und Glukoseentzug (OGD)3, die darin besteht, die normale Atmosphäre (95% Luft und 5%CO2) durch eine anoxische Atmosphäre (95% N2 und 5%CO2) zu ersetzen, die mit dem Auslassung von Glukose verbunden ist.
Die beschriebene Methode eignet sich zur einfachen, schnellen, reproduzierbaren und kostengünstigen Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Astrozyten im Kontext eines ischämischen Schlaganfalls.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

Der ischämische Schlaganfall ist ein klinischer Zustand, der durch eine Hypoperfusion des Hirngewebes gekennzeichnet ist, was zu Sauerstoff- und Glukoseentzug und dem daraus resultierenden neuronalen Verlust führt. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen gliaalen und neuronalen Zellen nach einem ischämischen Ereignis positive Effekte ausübt. Daher ist es wichtig, Modelle zu entwickeln, die es ermöglichen, neuron-glia Wechselwirkungen in einer ischämischen Umgebung zu untersuchen, um mögliche Schutzmechanismen zu erforschen. Hierin stellen wir einen einfachen Ansatz vor, um Astrozyten und Neuronen aus dem embryonalen Kortex der Ratte zu isolieren, und das ermöglicht durch die Verwendung spezifischer Kulturmedien die Etablierung neuron- oder astrozytierter Kulturen oder neuronglia-Kulturen mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit.
Um den Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen zu untersuchen, schlagen wir einen Ansatz vor, der auf einem Kokultursystem basiert, in dem Neuronen, die in Coverlips kultiviert sind, in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Mehrwellplatten platt sind. Die beiden Kulturen werden durch kleine Paraffinkugeln getrennt gehalten. Dieser Ansatz ermöglicht die unabhängige Manipulation und Anwendung spezifischer Behandlungen auf jeden Zelltyp, was in vielen Studien einen Vorteil darstellt.
Um zu simulieren, was während eines ischämischen Schlaganfalls geschieht, werden die Kulturen einem Sauerstoff- und Glukoseentzugsprotokoll unterzogen. Dieses Protokoll stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die Rolle von neuron-glia Wechselwirkungen bei ischämischen Schlaganfällen zu untersuchen.

Um die Kulturen zu charakterisieren, wurde die Immunzytochemie zur Beurteilung der Anzahl der Zellen, die GFAP oder MAP2, weit verbreitete Marker von Astrozyten und Neuronen (Abbildung 2), in jeder Art von kortikaler Kultur exprimiert. Diese Analyse ergab, dass astrozytenangereicherte Kulturen 97% der Zellen zeigten, die GFAP exdrückten (Abbildung 2A). In Bezug auf die neuronangereicherte Kultur 78% der Zellen exprimiert MAP2, 4% der Zellen ausgedrückt GFAP, u...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Der ischämische Schlaganfall ist ein klinischer Zustand, der durch eine Hypoperfusion von Hirngewebe gekennzeichnet ist und zu neuronaischem Verlust führt. Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass die Wechselwirkung zwischen Glia- und Urinalzellen die Druckeffekte nach einem ischämischen Ereignis ausübt. Um mögliche Schutzmechanismen zu erforschen, ist es wichtig, Modelle zu entwickeln, die das Studium neuron-glia Wechselwirkungen in einer ischämischen Umgebung ermöglichen.Hier stellen wir einen einfachen Ansatz vor, um Astrozyten und Neuronen aus dem embryonalen Kortex der Ratte zu isolieren, und dass durch die Verwendung eines spezifischen kulturellen Mediums die Etablierung von neuronen- oder astrozytenangereicherten Kulturen oder Neogliakulturen mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglicht. Um das Crosstalk zwischen Astrozyten und Neuronen zu untersuchen, schlagen wir einen Ansatz vor, der auf einem Kokultursystem basiert, bei dem Neuronen, die in Deckschscheinen kultiviert sind, in Kontakt mit einer Monoschicht von Astrozyten gehalten werden, die in Multi-Well-Platten plattiert sind. Die beiden Kulturen werden durch kleine Paraffinkugeln ein Teil erhalten.Dieser Ansatz ermöglicht eine unabhängige Manipulation und die Anwendung einer spezifischen Behandlung auf jeden Zelltyp, was in vielen Studien einen Vorteil darstellt. Um zu simulieren, was während eines ischämischen Schlaganfalls geschieht, werden die Kulturen einem Sauerstoff- und Glukoseentzugsprotokoll unterzogen. Dieses Protokoll stellt ein nützliches Werkzeug dar, um die Rolle von neuron-glia Wechselwirkungen bei ischämischen Schlaganfällen zu untersuchen.Beginnen Sie mit der embryonalen Kortex-Isolierung der Ratte. Die Embryonen wurden bei 15 Tagen Trächtigkeit aus einer Rattenfamilie gewonnen und in eine sterile Falcon-Röhre mit PBS-Haltigem gebracht. Noch im Inneren des Dotterbeutels werden Embryonen in eine Petrischale mit kaltem PBS gelegt.Mit Hilfe von Schere und Pinzette wird der Eigelbsack gebrochen, und der Embryo wird entfernt und in eine andere Petrischale mit kaltem PBS über einer Eispackung gelegt. Es ist notwendig, sehr vorsichtig zu sein, wenn Sie den Dottersack brechen, um den Embryo nicht zu beschädigen. Positionieren Sie den Embryo unter einem Sezierendes Mikroskop, fixieren Sie den Embryo vorsichtig mit einem Twizzer.Der anfängliche Schnitt sollte parallel zum Kortex erfolgen. Achten Sie darauf, das Tier nicht zu enthaupten. Die Kopfhaut und werden sorgfältig entfernt, um das kortikale Hirngewebe nicht zu beschädigen.Dieser nächste Schnitt trennt den Kortex. Entfernen Sie die im Gewebe vorhandenen Blutgefäße. Schließlich, mit einer Pipette, übertragen Sie das kortikale Gewebe auf ein Falcon-Rohr mit PBS.Die einzellige Suspension wird durch mechanische Verdauung des kortikalen Hirngewebes mit Spitzen mit abnehmendem Durchmesser erhalten. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe gut homogenisiert ist Nach der Verdauung zentrieren Sie das Material bei 400 Gs für drei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Sediment im Kulturmedium wieder auf, das zuvor auf 37 Grad erwärmt wurde.Berechnen Sie die Gesamtzahl der in der Suspension vorhandenen Zellen mit einer Neubauer-Kammer und präganieren Sie die Verdünnung für die angemessene Zelldichte. Schließlich säen Sie die Zellen im Multi-Well und brüten bei 37 Grad. Um das Material für das Co-Kultursystem vorzubereiten, erhitzen Sie das Paraffin in einem Heizblock, bis es flüssig wird.Dann bereiten Sie mit Hilfe einer Stereoglas Pasteur Pipette kleine Kugeln über die Abdeckung Supscheine, die zuvor in einem Multi-Well platziert und mit Poly-D-Lysin beschichtet wurden. 24 Stunden bevor die beiden Kulturen in Kontakt gebracht werden, ändern Sie das Kulturmedium von Neuronen und Astrozyten, um es NBM mit oder ohne Hitze inaktiviert FBS zu ergänzen. Wenn die beiden Kulturen einsatzbereit sind, übertragen Sie das Neuron, das in der Abdeckung sitzt, mit Paraffinkugeln auf Brunnen, die Astrozyten enthalten, mit einer Pinzette, die zuvor in 70% Ethanol eingetaucht war.Nachdem Sie beide Zelltypen in Kontakt gebracht haben, warten Sie acht bis zwölf Stunden, und starten Sie dann die verschiedenen Reize und Verfahren. Der Sauerstoff- und Glukosemangel wird in einer Kultur mit sieben Tagen Wachstum durchgeführt. Entfernen Sie das Kulturmedium, und waschen Sie die Zellen zweimal mit HBSS Medium ohne Glukose-Supplementierung.Achten Sie darauf, dass das gesamte Mittel, das Glukose enthält, gewaschen wird. Versiegeln Sie die Hypoxie-Kammer und fügen Sie die Gasmischung mit 95% Stickstoff und 5% Kohlendioxid für vier Minuten mit einem Durchfluss von 20 Litern für Minuten hinzu, um den sauerstoffhaltigen Sauerstoff in der Kammer zu ersetzen. Dann stoppen Sie den Fluss und legen Sie die Hypoxie-Kammer in einem Inkubator bei 37 Grad.Nach der Zeit der Sauerstoff- und Glukoseentzug, ersetzen Sie das Medium, HBSS ohne Glukose-Supplementierung mit dem entsprechenden Kulturmedium für die verbleibenden Verfahren und inkubieren die Zellen bei 37 Grad. Um die Art der kortikalen Kultur zu charakterisieren, führten wir Eine Immunhistochemie in den drei Arten von kortikalen Kulturen durch, um die Anzahl der Zellen zu bewerten, die GFPA oder MAP2 exprimierten, die Marker sind, die für astrozytische bzw. neuronale Zellen weit verbreitet sind. Diese Analyse ergab, dass wir, als dieses Protokoll, in der Lage waren, eine reine angereicherte Kultur von Astrozyten zu erhalten, mit etwa 97% der Zellen, die GFAP exdrücken.In Bezug auf die neuron-angereicherte Kultur haben wir etwa 78% der Zellen überprüft, die MAP2 exdrücken. Wir identifizieren jedoch etwa 18% der GFAP- und MAP2-Negativzellen. Für die neuron-glia kortikale Kultur, Es wurde beobachtet, dass etwa 49% der Zellen MAP2 positiv sind.31% sind GFAP-positiv. Und 20% sie sind nicht haftbar für GFAP oder MAP2. Sieben Tage nach dem kortikalen Kultur-Establishment wurden die Neuron-Glia-Kultur und die neuron-angereicherte Kultur 4 und 6 Stunden lang einem OGD-Verfahren unterzogen.Nach diesem Verfahren wurden die Zellen mit MAP2 beschriftet und dann die Anzahl der MAP2-positiven Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert. In der Neuron-Glia-Kultur wurde ein Rückgang der Anzahl der Neuronen um etwa 30% beobachtet, als die Kultur einer OGD-Periode von 4 Stunden unterzogen wurde. Nach einer OGD-Periode von 6 Stunden nimmt die Verlängerung der Läsion zu und erreicht etwa 60% des neuronalen Verlustes.In Bezug auf die angereicherte Kultur der Neuronen, die OGD ausgesetzt sind, wurde eine Abnahme der Anzahl der MAP2-Zellen um 41 % und 64 % beobachtet. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in der neuron-angereicherten Kultur, gab es eine leichte Zunahme der Verletzungsverlängerung im Vergleich zu den Neuron-Glia-Kultur auch OGD während 4 Stunden ausgesetzt. Zusammenfassend stellt hier ein In-vitro-Modell zur Untersuchung des ischämischen Schlaganfalls dar, das auf einfache, schnelle und teure und reproduzierbare Weise etabliert wurde.Darüber hinaus ermöglicht die beschriebene Methode auch die Implementierung von Neuronen und astrozytenangereicherten Primärkulturen, aber auch eine neuron-glia Kultur. So bietet ein großartiges In-vitro-Modell für die Modellierung mehrerer Gehirnerkrankungen mit einem höheren Maß an Komplexität, als verewigte Zelllinien und reine neuronale oder gliaale Kulturen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

Ein Verfahren zur Untersuchung der Fußschock-Induced Wiedereinsetzung von Kokain suche in Laborratten

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Forschung

Neurowissenschaften

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methoden zur Untersuchung der Wirkmechanismen von Psychopharmaka in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Adult Maus Muskel-Nerven Vorbereitung für das Studium der Brenneigenschaften des Muskel-Afferenzen

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging von Nikotin induzierte Calcium Signaling und Neurotransmitterausschüttung Zusammen Ventral Hippocampus Axone

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Die indirekte Neuron-Astrozyten Cokultur Assay: Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Für die detaillierte Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen Set-up

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Die optische Fraktionator-Technik zur Schätzung der Zellzahlen in einem Rattenmodell der elektrokonvulsiven Therapie

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...