Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכה במימון של Fundação para a Ciência e Tecnologia באמצעות פרויקטים UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 והמחווה SFRH/BD/135936/2018 ל-JP, על ידי 'Programa Operacional do Centro, Centro 2020" באמצעות הפרויקט CENTRO-01-0145-FEDER-000013 ומימון לפלטפורמה PPBI-פורטוגזית של BioImaging באמצעות פרויקט POCI-01-0145-FEDER-022122.

כל בעלי החיים בהם נעשה שימוש גודלו במרכז לחקר מדעי הבריאות CICS-UBI בהתאם לדרישות האתיות הלאומיות לחקר בעלי חיים ועם האמנה האירופית להגנה על בעלי חיים בעלי חוליות המשמשים למטרות ניסיוניות ומדעיות אחרות (הנחיה 2010/63/EU).
1. תרבות תא ראשי קליפת המוח העובר חולדה
<ol><li>הכנה בינונית לתר...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

השיטה המתוארת כאן מורכבת בידוד אסטרוציט ונוירון מרקמות קליפתיות עובריות חולדה, המאפשר הקמת תרבויות נוירון או אסטרוציט מועשר או תרבויות נוירון-גליה. הוא הותאם ממחקרקודם של הקבוצה 5שלנו , שבו תוארו הבידוד של התרביות העובריות הקליפתיות והנוירון ושתי התרבויות התאפיינו. באמצעות ...

על פי נתוני ארגון הבריאות העולמי, כ-5.5 מיליון בני אדם מתים מדי שנה משבץ איסכמי1. מצב זה מאופיין על ידי ההפרעה של זרימת הדם לאזור מוח מסוים, וכתוצאה מכך אובדן הפיך או בלתי הפיך באספקת חמצן וחומרים מזינים לרקמות, אשר משנה את תפקוד הרקמות ומוביל תפקוד מיטוכונדריאלי, dysregulation סידן, excitotoxicity גלוטמט, דלקת ואובדןתאים 2,,3.
מלבד תאי כלי דם, תאי עצביים וגליה מעורבים פתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי4. בפרט, אסטרוציטים חיוניים לתחזוקה של נוירונים ולאחרונה הוצגו לשחק תפקיד קריטי בתגובה נגע איסכמי5. סוג זה של תא גליה מבצע פונקציות של תמיכה מבנית, הגנה מפני סטרס חמצוני, סינתזה של נוירוטרנסמיטורים, ייצוב של תקשורת תא תא, ביןהיתר 6. יחד עם נוירונים, אסטרוציטים לשחק תפקיד ישיר שידור סינפטי, ויסות השחרור של מולקולות כגון אדנוסין טריפוספט, חומצה גמא אמינו בוטירית גלוטמט7. חלק מהפציעה המושרה על ידי איסכמיה נגרמת על ידי שחרור מוגזם של גלוטמט והצטברותו על שסוע סינפטי, המוביל להפעלת יתר של קולטני N-מתיל-D-אספרטט, הפעלת מפלים איתות במורד הזרם, בסופו של דבר וכתוצאה מכך excitotoxicity8. מאז אסטרוציטים מסוגלים להסיר גלוטמט מן הסוע הסינפטי ולהמיר אותו גלוטמין, הם חיוניים בהגנה מפני excitotoxicity, ובכך להפעיל השפעה neuroprotective על איסכמיה. תאים אלה גם לשחק תפקיד בדלקת עצבית איסכמיה המושרה. לאחר העלבון האיסכמי, אסטרוציטים מופעלים עוברים שינויים מורפולוגיים (היפרטרופיה), להתרבות, ולהראות עלייה בביטוי חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP). הם יכולים להיות תגובתיים (אסטרוגליוזיס), שחרור ציטוקינות פרו דלקתיות כגון גורם נמק גידול-α, interleukin-1α ו interleukin-1β, והפקת רדיקלים חופשיים, כולל תחמוצת החנקן וסופרתחמוצת, אשר בתורו יכול לגרוםלמוות עצבי 9,,10. לעומת זאת, אסטרוציטים תגובתיים עשויים גם לשחק אפקט neuroprotective, מאז הם משחררים ציטוקינות אנטי דלקתיות, כגון שינוי גורם גדילה-β, כי הוא upregulated לאחרשבץ 11. יתר על כן, הם יכולים ליצור צלקת גליה, אשר יכול להגביל את התחדשות רקמות על ידי עיכוב נבטים סקסוניים; עם זאת, צלקת גליה זו יכולה לבודד את אתר הפציעה מרקמות קיימא, ובכך למנוע גל מדורג של נזק לרקמות בלתימבוקרות 12,13.
לכן, זה הכרחי כדי לבסס מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות נוירון-גליה תחת פציעה איסכמית על מנת למצוא אסטרטגיות טיפוליות להגביל או להפוך את ההשפעות של פגיעה איסכמית. בהשוואה למודלים אחרים המשמשים לחקר פגיעה איסכמית, כל שם במודלים vivo 14,15,16, תרבויות organotypic17,18,19 ופרוסות מוחחריפה 20,21,22, תרביות תאים ראשיות הן פחות מורכבות, מה שהופך את המחקר של תרומות בודדות של כל סוג תא בפתופיזיולוגיה של שבץ איסכמי ואיך כל סוג תא מגיב למטרות טיפוליות אפשריות. בדרך כלל, על מנת ללמוד את האינטראקציות בין תרבויות מועשר נוירון ותרבויות מועשר אסטרוציט, נוירונים ותאי גליה ממוצא לאחר הלידהמשמשים 23,24, או תאי גליה שלאחר הלידה ונוירוניםעובריים 25,26. בזאת מוצעת גישה פשוטה כדי לבסס נוירון- או אסטרוציט מועשר תרבויות ותרביות נוירון-גליה מאותה רקמה. תאים ראשיים אלה מתקבלים קליפת המוח העוברית חולדה, אזור המושפע לעתים קרובותמשבץ 27,28. יתר על כן, ניתקה של הרקמה מבוצעת רק על ידי הליך מכני. לכן, פרוטוקול זה מאפשר בידוד תאים באותו שלב של התפתחות, באופן מהיר ולא יקר, ועם ביצועים גבוהים ושחזור.
את ההצלבה בין אסטרוציטים ונוירונים ניתן לחקור באמצעות מערכת תרבות שותף שבו נוירונים תרבותיים בכיסויים נשמרים במגע עם מונו-שכבתית של אסטרוציטים נזרעים צלחות multiwell. ניתן להשתמש בספירות פרפין קטנות כדי להבטיח את ההפרדה של שתי תרביות התא. גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית של כל סוג תא לפני שהם מובאים במגע. לדוגמה, ניתן להשתיק גן מסוים באסטרוציטים ולראות כיצד הוא יכול להשפיע על הפגיעות העצבית או הגנה מפני נזק איסכמי המושרה. שיטה מבוססת כדי לגרום לתנאים כמו איסכמי במבחנה היא חמצן ומניעת גלוקוז (OGD)3, אשר מורכב החלפת האטמוספירה הרגילה (95% אוויר ו 5% CO2)על ידי אטמוספרה אנוקסית (95% N2 ו 5% CO2),הקשורים השמטה של גלוקוז.
השיטה המתוארת מתאימה ללימוד האינטראקציות בין תאי עצב ואסטרוציטים בהקשר של שבץ איסכמי, בצורה פשוטה, מהירה, ניתנת לשחזור ולא יקר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

שבץ איסכמי הוא מצב קליני המאופיין בתת-פרה-דם של רקמת המוח, המובילה למחסור בחמצן וגלוקוז, ולאובדן עצבי כתוצאה מכך. ראיות רבות מצביעות על כך שהאינטראקציה בין תאי גליה ונוירונאליים מפעילה השפעות מועילות לאחר אירוע איסכמי. לכן, כדי לחקור מנגנוני הגנה פוטנציאליים, חשוב לפתח מודלים המאפשרים לימוד אינטראקציות נוירון-גליה בסביבה איסכמית. בזאת אנו מציגים גישה פשוטה לבודד אסטרוקיטים ונוירונים מקליפת המוח העוברית חולדה, כי באמצעות מדיה תרבותית ספציפית, מאפשר הקמת תרבויות נוירון- או אסטרוקיטים מועשר או תרבויות neuron-glia עם תשואה גבוהה ושחזור.
כדי ללמוד את ההצלבה בין אסטרוציטים ונוירונים, אנו מציעים גישה המבוססת על מערכת תרבות שותף שבו נוירונים תרבותיים בכיסויים נשמרים במגע עם מונו-שכבת של אסטרוציטים מצופה צלחות multiwell. שתי התרבויות נשמרות זו מזו על ידי ספירות פרפין קטנות. גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית ויישום של טיפולים ספציפיים לכל סוג תא, המייצג יתרון במחקרים רבים.
כדי לדמות את מה שקורה במהלך שבץ איסכמי, התרבויות נתונות לפרוטוקול מניעת חמצן וגלוקוז. פרוטוקול זה מייצג כלי שימושי כדי ללמוד את התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה בשבץ איסכמי.

כדי לאפיין את התרבויות, אימונוציטוכימיה כדי להעריך את מספר התאים שהביעו GFAP או MAP2, סמנים בשימוש נרחב של אסטרוציטיםונוירונים (איור 2), בוצעבכל סוג של תרבות קליפתית. ניתוח זה גילה כי תרבויות מועשר אסטרוציט הציגו 97% של התאים המביעים GFAP (איור 2A). לגבי התרבות המועשר...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

שבץ איסכמי הוא מצב קליני המאופיין hypoperfusion של רקמת המוח ותוצאות אובדן עצבי. עדויות רבות מצביעות על כך שהאינטראקציה בין גליה לתאי המשתנה מפעילה את השפעות הלחץ לאחר אירוע איסכמי. על מנת לחקור מנגנוני הגנה פוטנציאליים, חשוב לפתח מודלים המאפשרים ללמוד אינטראקציות נוירון-גליה בסביבה איסכמית.כאן אנו מציגים גישה פשוטה לבודד אסטרוציטים ותאי עצב מקליפת המוח העוברית של חולדה, ועל ידי שימוש במדיום תרבותי ספציפי מאפשר הקמת תרבויות נוירון או אסטרוציטים מועשרים או תרבויות ניאו גליה עם תשואה גבוהה ושחזור. כדי לחקור את ההצלבה בין אסטרוציטים לנוירונים, אנו מציעים גישה, המבוססת על מערכת תרבת שותף, שבה נוירונים המתרבים בתגיות כיסוי נשמרים במגע עם מונוליאר של אסטרוציטים מצופים בצלחות מרובות בארות. שתי התרבויות נשמרות בחלקן על ידי ספירות פרפין קטנות.גישה זו מאפשרת מניפולציה עצמאית ויישום של טיפול ספציפי לכל סוג תא, המהווה יתרון במחקרים רבים. כדי לדמות את מה שקורה במהלך שבץ איסכמי, התרבויות כפופות לפרוטוקול מניעת חמצן וגלוקוז. פרוטוקול זה מייצג כלי שימושי לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון גליה בשבץ איסכמי.התחל עם בידוד קליפת המוח העוברית של חולדה. העוברים הושגו ממשפחה של חולדות ב 15 ימים של הריון והם ממוקמים בצינור פלקון סטרילי המכיל PBS. עדיין בתוך עוברי שקית החלמון ממוקמים בתוך צלחת פטרי המכילה PBS קר.בעזרת מספריים ופינצטה, שאק החלמון שבור, העובר מוסר ומונח בצלחת פטרי אחרת המכילה PBS קר מעל חבילת קרח. יש צורך להיות זהיר מאוד בעת שבירת שם החלמון לא לפגוע בעובר. מקם את העובר תחת מיקרוסקופ ניתוח, בעדינות לתקן את העובר באמצעות טוויזר.החתך הראשוני צריך להיות מקביל לקליפת המוח. תיזהר לא לערוף את ראשו של החיה. הקרקפת מוסרים בזהירות לא לפגוע ברקמת המוח קליפת המוח.החתך הבא מפריד בין קליפת המוח. הסר את כלי הדם הקיימים ברקמה. לבסוף, באמצעות פיפטה, להעביר את הרקמה קליפת המוח לצינור פלקון עם PBS.ההשעיה של תא יחיד מתקבלת באמצעות עיכול מכני של רקמת המוח קליפת המוח באמצעות טיפים עם קוטר יורד. ודא כי הרקמה היא הומוגנית היטב לאחר העיכול, צנטריפוגה החומר ב 400 Gs במשך שלוש דקות. השליכו את העל-טבעי, והתינו מחדש את המעים במדיום התרבותי, שהתחמם בעבר ל-37 מעלות.לחשב את המספר הכולל של תאים נוכח ההשעיה באמצעות תא Neubauer ולה מכין את הדילול עבור צפיפות התא נאותה. לבסוף, לזרוע את התאים רב היטב דגירה ב 37 מעלות. על מנת להכין את החומר למערכת התרבות המשותף, מחממים את הפרפין בבלוק חימום עד שהוא הופך לנוזל.לאחר מכן, בעזרת פיפטה פסטור זכוכית סטריאו להכין כדורים קטנים מעל תלושי הכיסוי שהוצבו בעבר רב באר, מצופה פולי D-לינזין. 24 שעות לפני שתי התרבויות מובאים במגע, לשנות את מדיום התרבות של נוירונים ואסטרוציטים כדי להשלים אותו NBM עם או בלי חום מושבת FBS. כאשר שתי התרבויות מוכנות לשימוש, להעביר את הנוירון, יושב בכיסוי מחליק עם כדורי פרפין ל בארות המכילות אסטרוציטים באמצעות פינצטה בעבר שקוע 70% אתנול.לאחר הצבת שני סוגי התאים במגע, המתן 8 עד 12 שעות ולאחר מכן התחל את הגירויים וההליכים השונים. מחסור בחמצן וגלוקוז מבוצע בתרבות עם שבעה ימים של צמיחה. הסר את מדיום התרבות, ולשטוף את התאים פעמיים עם מדיום HBSS ללא תוספת גלוקוז.ודא כי כל המדיום המכיל גלוקוז נשטף. לאטום את תא היפוקסיה ולהוסיף את תערובת הגז המכיל 95% חנקן ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע דקות עם זרימה של 20 ליטר במשך דקות כדי להחליף את החמצן הנוכחי בתוך התא. לאחר מכן, לעצור את הזרימה ולמקום את תא היפוקסיה באינקובטור ב 37 מעלות.לאחר תקופת מחסור בחמצן וגלוקוז, החלף את המדיום, HBSS ללא תוספת גלוקוז עם מדיום התרבות המתאים להליכים הנותרים ותמהר את התאים ב -37 מעלות. על מנת לאפיין את סוג התרבות הקורטית, ביצענו אימונוהיסטוכימיה בשלושת הסוגים של תרבות קליפת המוח כדי להעריך את מספר התאים שהביעו GFPA או MAP2, שהם סמנים בשימוש נרחב עבור תאים אסטרוציטים ונוירונים בהתאמה. ניתוחים אלה גילו כי כאשר פרוטוקול זה, הצלחנו להשיג תרבות מועשרת טהורה של אסטרוציטים עם כ 97% מהתאים המבטאים GFAP.לגבי התרבות המועשרת בנוירונים, אימתנו כ-78% מהתאים המבטאים MAP2. עם זאת אנו מזהים כ -18% של תאים שליליים GFAP ו- MAP2. עבור תרבות קליפת המוח נוירון גליה, זה נצפתה כי כ 49% מהתאים הם MAP2 חיובי.31%הם חיוביים GFAP. ו-20%הם לא אחראים ל-GFAP ולא ל-MAP2. שבעה ימים לאחר הקמת התרבות הקורטית, תרבות הנוירונים-גליה והתרבות המועשרת בנוירונים היו נתונים להליך OGD במשך 4 ו -6 שעות.לאחר הליך זה, התאים תויגו עם MAP2 ולאחר מכן מספר התאים החיוביים MAP2 כומתו באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. בתרבות נוירון-גליה, זה נצפתה ירידה של כ 30% במספר הנוירונים, כאשר התרבות הוגשה לתקופה OGD של 4 שעות. לאחר תקופת OGD של 6 שעות, הארכת ההנעה עולה, להגיע על 60% של אובדן עצבי.לגבי התרבות המועשרת של נוירונים שנחשפו OGD, זה נצפתה על 41%ו 64% ירידה במספר תאי MAP2. יתר על כן, נצפתה כי בתרבות המועשרת בנוירונים, חלה עלייה קלה בהרחבת הפציעה בהשוואה לתרבות הנוירונים-גליה שנחשפה גם ל- OGD במהלך 4 שעות. לסיכום, כאן מייצגים מודל במבחנה ללמוד שבץ איסכמי שהוקם בצורה פשוטה, מהירה ויקרה וניתנית לשחזור.בנוסף, השיטה המתוארת מאפשרת גם ליישם נוירונים ותרבויות ראשוניות מועשרות אסטרוציטים, אך גם תרבות נוירונים-גליה. לכן, מתן מודל in-vitro גדול עבור מודל מספר מחלות מוח עם רמה גבוהה יותר של מורכבות, מאשר קווי תאים מונצחים תרבויות עצביות או גליה טהור.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

נוהל לימוד החזרה Footshock-induced של קוקאין מחפשים אצל חולדות מעבדה

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

קלטות אלקטרו כפולות של תגובות Astroglial ועצביות עוררו-synaptically בפרוסות ביפוקמפוס חריפות

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

שיטות לחקר מנגנוני פעולה של אנטי פסיכוטיות סמים ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

גרימת פלסטיות של astrocytic רצפטורים על ידי מניפולציה של מחירים ירי עצביים

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; במבחנה</emהכנת שרירים עצבים&gt; עכבר למבוגרים ללימוד מאפייני ירי afferents השריר

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

טכניקת Fractator אופטי להעריך מספרים תאים במודל עכברוש של תרפיה אלקטרו-פולית

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...