Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

著者らは、プロジェクトUIDB/00709/2020、POCI-01-0145-FEDER-029311およびフェローシップSFRH/BD/135936/2018を通じて、ファンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジアによる資金援助を認めている。 「プログラム・オペラシオナル・ド・セントロ、セントロ2020」によるプロジェクトCENTRO-01-0145-FEDER-000013、およびプロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-022122を通じてバイオイメージングのPPBI-ポルトガルプラットフォームへの資金提供。

使用されるすべての動物は、動物研究のための国家倫理要件に従って、および実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約(指令2010/63/EU)に従って、CICS-UBI健康科学研究センターで飼育されました。
1. ラット胚皮質一次細胞培養
<ol><li>培地製剤<ol>
<li>次のサプリメントを追加して神経基底培地 (NBM) を準備します: 2% B27, 0.5 mM グルタ?...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

ここで説明する方法は、ラット胚性皮質組織からのアストロサイトおよびニューロン分離からなり、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物またはニューロングリア培養物の確立を可能にする。これは、皮質ニューロングリアとニューロンエンリッチ胚培養が単離され、2つの培養が特徴付けられるグループ5の以前の研究から適応されました。これらの培養を?...

世界保健機関(WHO)のデータによると、毎年約550万人が虚血性脳卒中で死亡しています。この状態は、ある脳領域への血流の中断によって特徴付けられるが、組織への酸素および栄養素の供給において可逆的または不可逆的な損失をもたらし、組織機能を変化させ、ミトコンドリア機能不全、カルシウム調節障害、グルタミン酸興奮性、炎症および細胞損失22、33を引き起こす。
血管細胞とは別に、神経細胞およびグリア細胞は虚血性脳卒中4の病態生理学に関与している。特に、アストロサイトはニューロンの維持に必須であり、最近では虚血病変5に対する応答において重要な役割を果たすることが示された。このタイプのグリア細胞は、構造的支持の機能を果たす、酸化ストレスに対する防御、神経伝達物質の合成、細胞間通信の安定化、とりわけ6。ニューロンと並んで、アストロサイトはシナプス伝達において直接的な役割を果たし、アデノシン三リン酸、γ-アミノ酪酸およびグルタミン酸7などの分子の放出を調節する。虚血によって引き起こされる傷害の一部は、シナプス裂切れにおけるグルタミン酸の過剰放出およびその蓄積によって引き起こされ、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体の過剰活性化につながり、下流シグナル伝達カスケードを活性化し、最終的に興奮性障害をもたらす8を生じる。アストロサイトはシナプス裂膜からグルタミン酸を除去し、グルタミンに変換することができるので、興奮毒性に対する防御に重要であり、それによって虚血に対する神経保護効果を発揮する。これらの細胞はまた、虚血誘発性神経炎症の役割を果たす。虚血性侮辱の後、活性化されたアストロサイトは形態学的変化(肥大)を受け、増殖し、そしてグリア性フィブリリン酸性タンパク質(GFAP)発現の増加を示す。それらは反応性(アストログリオーシス)になり、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-1αおよびインターロイキン-1βなどの炎症性サイトカインを放出し、一酸化窒素およびスーパーオキシドを含むフリーラジカルを産生し、神経死9,1010を誘導することができる。対照的に、反応性アストロサイトはまた、神経保護作用を果たして、脳卒中11後にアップレギュレートされる成長因子βの転換などの抗炎症性サイトカインを放出するのでである。さらに、彼らは、軸索発芽を阻害することによって組織の再生を制限することができるグリア瘢痕を生成することができます。しかし、このグリア瘢痕は、損傷部位を生存可能な組織から隔離することができ、従って制御されていない組織損傷12、13,13のカスケード波を防ぐ。
したがって、虚血性損傷の影響を制限または逆転させる治療戦略を見つけるために、虚血性傷害下でのニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを確立することが不可欠です。虚血性損傷を研究するために使用される他のモデル、すなわち生体内モデル,14、15、16、,15,16オルガノスティック培養17、18、1918および17急性脳スライス20、21、22,21と比較して、一次細胞培養は複雑性が低く、これは虚血性脳卒中の病態生理学における各細胞型の個々の寄与の研究を可能にする。,2219典型的には、ニューロンエンリッチ培養とアストロサイトエンリッチ培養との相互作用を研究するために、出生後起源のニューロンおよびグリア細胞は、23、24、,24または出生後グリア細胞および胚性ニューロン25、26,26を使用する。本明細書では、同じ組織からニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物およびニューロングリア培養を確立するための簡単なアプローチが提案される。これらの初細胞はラット胚性皮質から得られ、脳卒中27、28,28によって頻繁に影響を受ける領域である。また、組織の解離は機械的な手順によってのみ行われる。したがって、このプロトコルは、開発の同じ段階で、高速かつ安価な方法で、高い性能と再現性で細胞を単離することができます。
アストロサイトとニューロンのクロストークは、カバーリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートに播種されたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムを使用して探索することができる。小さなパラフィン球体は、2つの細胞培養物の分離を確実にするために使用することができる。この方法では、各セル型が接触する前に、独立した操作が可能になります。例えば、アストロサイトの特定の遺伝子を沈黙させ、それが虚血性損傷に対する神経の脆弱性または保護にどのような影響を与えるかを見ることができます。インビトロで虚血性様条件を誘導する確立された方法は、酸素およびグルコース欠乏(OGD)3であり、これはグルコースの省略に関連するアノキシック雰囲気(95%N2および5%CO2)によって通常の雰囲気(95%空気および5%CO2)を置き換えることから成る。322 2
記載された方法は、虚血性脳卒中の文脈におけるニューロンとアストロサイト間の相互作用を、簡単で、速く、再現可能で安価な方法で研究するのに適している。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

虚血性脳卒中は、脳組織の低灌流、酸素およびグルコース欠乏、および結果的な神経喪失を特徴とする臨床状態である。多くの証拠は、グリアと神経細胞の相互作用が虚血性事象の後に有益な効果を発揮することを示唆しています。そのため、潜在的な保護機構を探索するためには、虚血環境におけるニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを開発することが重要です。ここでは、ラット胚性皮質からアストロサイトおよびニューロンを単離する簡単なアプローチを提示し、特定の培養培地を用いて、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物またはニューロングリア培養を高収率および再現性で確立することを可能にする。
アストロサイトとニューロンのクロストークを研究するために、カバーリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートにメッキされたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムに基づくアプローチを提案する。2つの培養物は、小さなパラフィン球によって離れて維持される。このアプローチは、独立した操作と各細胞タイプへの特定の治療法の適用を可能にし、多くの研究において利点を表している。
虚血性脳卒中中に何が起こるかをシミュレートするために、培養物は酸素およびグルコース剥奪プロトコルに供される。このプロトコルは虚血性脳卒中におけるニューロンとグリア相互作用の役割を研究するのに有用なツールを表す。

培養物を特徴付けるために、GFAPまたはMAP2を発現した細胞の数を評価する免疫細胞化学、アストロサイトおよびニューロンのマーカー(図2)を広く使用し、各タイプの皮質培養で行った。この分析により、アストロサイトを豊富に含む培養物がGFAPを発現する細胞の97%を示す(図2A)。MAP2を発現した細胞の78%のニューロンエンリッチ培養について、GFAPを?...

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A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

ここでは、高収率と再現性を持つ、胚性皮質由来のニューロンおよびアストロサイトエンリッチ培養、またはニューロングリア培養を確立できる特定の培養培地を用いた簡単なアプローチを提示する。

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

虚血性脳卒中は、脳組織の低灌流を特徴とする臨床状態であり、神経細胞の喪失をもたらす。多くの証拠は、グリアと小便器細胞の相互作用が虚血性イベント後に圧力効果を発揮することを示唆している。潜在的な保護メカニズムを探求するためには、虚血環境におけるニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを開発することが重要です。ここでは、ラット胚性皮質からアストロサイトとニューロンを分離するための簡単なアプローチを提示し、特定の文化的媒体を使用することで、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物または高収率および再現性を持つネオグリア培養物の確立を可能にする。アストロサイトとニューロンのクロストークを研究するために、カバースリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートにメッキされたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムに基づくアプローチを提案する。2つの培養物は、小さなパラフィン球体によって一部維持される。このアプローチは、独立した操作と各細胞タイプに特定の治療の適用を可能にし、多くの研究において利点を表す。虚血性脳卒中中に何が起こるかをシミュレートするために、培養物は酸素およびグルコース剥奪プロトコルに供される。このプロトコルは虚血性脳卒中におけるニューロンとグリア相互作用の役割を研究するのに有用なツールを表す。ラット胚性皮質絶縁体から始めます。胚は、妊娠15日でラットの家族から得られ、PBSを含む無菌ファルコンチューブに入れられた。まだ卵黄袋の胚の中には、冷たいPBSを含むシャーレの中に置かれています。はさみとピンセットの助けを借りて、黄身嚢が壊れ、胚が取り除かれ、氷パックの上に冷たいPBSを含む別のシャーレに入れられます。卵黄嚢を壊すときに胚を損傷しないように注意する必要があります。胚を解剖顕微鏡の下に置き、ツイザーを使用して胚を穏やかに固定する。最初の切開は皮質と平行であるべきである。動物の首を切り落とさないように注意してください。頭皮と皮質脳組織を損傷しないように慎重に除去されます。この次の切開は皮質を分離する。組織に存在する血管を取り除く。最後に、ピペットを使用して、皮質組織をPBSでファルコンチューブに移す。単一細胞懸濁液は、直径を減少させる先端を用いて皮質脳組織の機械的消化を通じて得られる。消化後、400 Gsで材料を3分間遠心分離して、組織が均質化されていることを確認してください。上清を捨て、培地中の堆積物を再懸濁し、以前に37度まで温めた。Neubauerチャンバーを使用して懸濁液中に存在する細胞の総数を計算し、適切な細胞密度のために希釈を準備する。最後に、マルチウェルに細胞を播種し、37度でインキュベートします。共培養システム用の材料を調製するために、パラフィンを加熱ブロック内で液体になるまで加熱する。その後、ステレオガラスパスツールピペットの助けを借りて、以前にマルチウェルに配置され、ポリD-リジンでコーティングされたカバースリップの上に小さな球を準備します。2つの培養物が接触する24時間前に、ニューロンおよびアストロサイトの培養培地を変更して、熱不活性化FBSの有無にかかわらずNBMを補う。2つの培養物を使用する準備ができたら、ニューロンを転写し、パラフィン球でカバースリップに座って、以前に70%エタノールに浸漬したピンセットを使用してアストロサイトを含むウェルに着席する。両方の細胞タイプを接触させた後、8〜12時間待ってから、異なる刺激と手順を開始します。酸素とグルコース欠乏は、成長の7日間の培養で行われる。培養培地を取り出し、グルコース補給をせずにHBSS培地で細胞を2回洗浄する。必ず、グルコースを含むすべての培地を洗浄してください。低酸素室を密封し、チャンバー内に存在する酸素を交換するために、20リットルの流れで95%の窒素と5%の二酸化炭素を含むガスミックスを4分間追加します。その後、流れを止め、低酸素室を37度のインキュベーターに入れます。酸素及びグルコース欠乏の期間後、培地を交換し、グルコース補充を行わずにHBSSを残りの手順に適した培地でグルコースを補充し、細胞を37度でインキュベートする。皮質培養の種類を特徴付けるために、3種類の皮質培養で免疫体化学を行い、それぞれ乳頭細胞や神経細胞に広く用いられているGFPAまたはMAP2を発現する細胞の数を評価しました。これらの分析は、このプロトコルを使用すると、GFAPを発現する細胞の約97%を有するアストロサイトの純粋な濃縮培養物を得ることができたことを明らかにした。ニューロンを富化培養した上で、MAP2を発現する細胞の約78%を検証した。しかし、我々は、GFAPおよびMAP2陰性細胞の約18%を同定する。ニューロングリア皮質培養に関しては、約49%の細胞がMAP2陽性であるのが観察された。31%はGFAP陽性です。そして20%彼らはGFAPまたはMAP2に対して責任を負いません。皮質培養の確立から7日後、ニューロングリア培養およびニューロンエンリッチ培養を4時間および6時間のOGD処置を行った。この手順の後、細胞をMAP2で標識し、次いでMAP2陽性細胞の数を蛍光顕微鏡を用いて定量した。ニューロングリア培養では、ニューロン数の約30%の減少が観察され、培養が4時間のOGD期間に提出された。OGD期間6時間後、病変の延長は増加し、ニューロン喪失の約60%に達する。OGDに曝露したニューロンの濃縮培養について、MAP2細胞の数の約41%および64%減少が観察された。また、ニューロンエンリッチ培養では、4時間の間にOGDに曝露したニューロングリア培養と比較すると傷害延長が若干増加することが観察された。結論として、ここでは、シンプルで高速で高価で再現可能な方法で確立された虚血性脳卒中を研究するためのin vitroモデルを表します。さらに、記載された方法はまた、ニューロンおよびアストロサイトを豊富に含む一次培養物だけでなく、ニューロングリア培養を実施することを可能にする。したがって、不死化細胞株および純粋な神経細胞またはグリア培養よりも、より高いレベルの複雑さでいくつかの脳疾患をモデル化するための素晴らしいインビトロモデルを提供する。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

実験用ラットに求めてコカインのフットショック誘発性回復を勉強するための手順

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

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Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

抗精神病薬の作用のメカニズムを研究するための方法<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

アン<em&gt;体外</em筋求心性神経の焼成特性を研究するための&gt;成体マウス筋肉神経の準備

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

軸索分岐と神経形態形成中に形質膜配信の役割を定義するために組み合わせる方法論を活用

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

電気ショック療法のラットモデルにおける細胞数の推定のための光学分画器技術

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...