Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner finansieringsstøtten fra Fundação para a Ciência e a Tecnologia gjennom Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 og fellesskapet SFRH/BD/135936/2018 til JP, av ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" gjennom prosjektet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 og finansiering til PPBI-portugisisk plattform for bioimaging gjennom Prosjektet POCI-01-0145-FEDER-022122.

Alle dyr som ble brukt ble avlet ved CICS-UBI Health Science Research Centre i samsvar med de nasjonale etiske kravene til dyreforskning og med Den europeiske konvensjonen om beskyttelse av virveldyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål (direktiv 2010/63/EU).
1. Rotte embryo cortex primære cellekultur
<ol><li>Kultur medium forberedelse<ol>
<li>Forbered neurobasalmediet (NBM) ved å legge til følgende kosttilskudd: 2 % B27, 0,5 m M glutamin, 25 μM glutamat og 120 ...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

Metoden her beskrevet består av astrocytt og nevron isolasjon fra rotte embryonale kortikale vev, slik at etableringen av neuron- eller astrocytt-beriket kulturer eller neuron-glia kulturer. Den ble tilpasset fra en tidligere studie av vår gruppe5, hvor den kortikale nevron-glia og nevron-beriket embryonale kulturer isolasjon ble beskrevet og de to kulturene preget. Ved hjelp av disse kulturene fant Roque et al. at astrocytter spiller en nøkkelrolle i å reagere på en iskemisk skade og antyder...

Ifølge data fra Verdens helseorganisasjon dør om lag 5,5 millioner mennesker hvert år av iskemisk slag1. Denne tilstanden er preget av avbrudd av blodstrømmen til en bestemt hjerneregion, noe som resulterer i et reversibelt eller irreversibelt tap i tilførselen av oksygen og næringsstoffer til vevet, noe som endrer vevsfunksjonen og fører til mitokondriedysfunksjon, kalsiumdysregulering, glutamatspenning, betennelse og celletap2,3.
Bortsett fra vaskulære celler er nevronale og glialceller involvert i iskemisk slags patofysiologi4. Spesielt astrocytter er avgjørende for vedlikehold av nevroner og nylig ble vist å spille en kritisk rolle i responsen på den iskemiskelesjonen 5. Denne typen glialcelle utfører funksjoner av strukturell støtte, forsvar mot oksidativt stress, syntese av nevrotransmittere, stabilisering av cellecellekommunikasjon, blant andre6. Sammen med nevroner spiller astrocytter en direkte rolle i synaptisk overføring, regulerer frigjøring av molekyler som adenosin trifosfat, gamma-aminosmørsyre og glutamat7. En del av skaden forårsaket av iskemi er forårsaket av overdreven frigjøring av glutamat og akkumulering på synaptisk kløft, noe som fører til overaktivering av N-metyl-D-aspartatreseptorer, aktiverer nedstrøms signalkaskader, noe som til slutt resulterer i eksitotoksiitet8. Siden astrocytter er i stand til å fjerne glutamat fra synaptisk kløft og konvertere den til glutamin, er de avgjørende for å forsvare seg mot eksitotoksisitet, og dermed utøve en nevrobeskyttende effekt på iskemi. Disse cellene spiller også en rolle i iskemi-indusert nevroinflammasjon. Etter iskemisk fornærmelse gjennomgår aktiverte astrocytter morfologiske endringer (hypertrofi), sprer seg, og viser en økning i glialflimmersyreprotein (GFAP) uttrykk. De kan bli reaktive (astrogliosis), slippe proinflammatoriske cytokiner som tumornekrose faktor-α, interleukin-1α og interleukin-1β, og produsere frie radikaler, inkludert nitrogenoksid og superoksid, som igjen kan indusere nevronal død9,10. I motsetning kan reaktive astrocytter også spille en nevrobeskyttende effekt, siden de frigjør antiinflammatoriske cytokiner, for eksempel transformere vekstfaktor-β, som er oppregulert etterslag 11. Videre kan de generere et glial arr, som kan begrense vevregenerering ved å hemme aksonær spire; Imidlertid kan dette glial arret isolere skadestedet fra levedyktig vev, og dermed forhindre en gjennomgripende bølge av ukontrollert vevsskade12,13.
Dermed er det viktig å etablere modeller som tillater studier av nevron-glia interaksjoner under en iskemisk skade for å finne terapeutiske strategier som begrenser eller reverserer effekten av iskemisk skade. Sammenlignet med andre modeller som brukes til å studere iskemisk skade, nemlig in vivo modeller14,15,16, organotypiskekulturer 17,18,,19 og akutte hjerneskiver20,21,22, primære cellekulturer er mindre komplekse, noe som gjør det mulig studiet av individuelle bidrag av hver celletype i patofysiologien av iskemisk slag og hvordan hver celletype reagerer på mulige terapeutiske mål. Vanligvis, for å studere samspillet mellom nevron-berikede kulturer og astrocytt-berikede kulturer, nevroner og glial celler av postnatal opprinnelse brukes23,,24,eller postnatal glial celler og embryonale nevroner25,26. Her foreslås en enkel tilnærming for å etablere nevron- eller astrocyttberikede kulturer og nevron-gliakulturer fra samme vev. Disse primære cellene er hentet fra rotte embryonal cortex, en region som ofte påvirkes av slag27,28. Videre utføres dissosiasjonen av vevet bare ved en mekanisk prosedyre. Derfor tillater denne protokollen å isolere celler i samme utviklingsstadium, på en rask og rimelig måte, og med høy ytelse og reproduserbarhet.
Crosstalk mellom astrocytter og nevroner kan utforskes ved hjelp av et co-kultur system der nevroner dyrket i coverslips opprettholdes i kontakt med en monolayer av astrocytter seeded i multiwell plater. Små parafinkuler kan brukes til å sikre separasjon av de to cellekulturene. Denne tilnærmingen tillater uavhengig manipulering av hver celletype før de bringes i kontakt. For eksempel er det mulig å dempe et bestemt gen i astrocytter og se hvordan det kan påvirke den nevronale sårbarheten eller beskyttelsen mot iskemisk-indusert skade. En etablert metode for å indusere iskemisk-lignende forhold in vitro er oksygen og glukosemangel (OGD)3, som består i å erstatte den vanlige atmosfæren (95% luft og 5% CO2) av en anoksisk atmosfære (95% N2 og 5% CO2), forbundet med utelatelse av glukose.
Metoden som er beskrevet er egnet for å studere samspillet mellom nevroner og astrocytter i sammenheng med iskemisk slag, på en enkel, rask, reproduserbar og billig måte.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

Iskemisk slag er en klinisk tilstand preget av hypoperfusjon av hjernevev, noe som fører til oksygen og glukosemangel, og det påfølgende nevronale tapet. Tallrike bevis tyder på at samspillet mellom glial og nevronale celler utøver gunstige effekter etter en iskemisk hendelse. Derfor, for å utforske potensielle beskyttende mekanismer, er det viktig å utvikle modeller som tillater å studere neuron-glia interaksjoner i et iskemisk miljø. Her presenterer vi en enkel tilnærming for å isolere astrocytter og nevroner fra rotte embryonal cortex, og at ved hjelp av spesifikke kulturmedier, tillater etablering av nevron- eller astrocyttberikede kulturer eller nevron-gliakulturer med høyt utbytte og reproduserbarhet.
For å studere kryssforfølgelse mellom astrocytter og nevroner, foreslår vi en tilnærming basert på et co-kultursystem der nevroner dyrket i dekkslips opprettholdes i kontakt med en monolayer av astrocytter belagt i multiwell plater. De to kulturene opprettholdes fra hverandre av små parafinsfærer. Denne tilnærmingen tillater uavhengig manipulering og anvendelse av spesifikke behandlinger til hver celletype, noe som representerer en fordel i mange studier.
For å simulere hva som skjer under et iskemisk slag, blir kulturene utsatt for en oksygen- og glukosemangelprotokoll. Denne protokollen representerer et nyttig verktøy for å studere rollen som neuron-glia interaksjoner i iskemisk slag.

For å karakterisere kulturer, immunocytochemistry å vurdere antall celler som uttrykte GFAP eller MAP2, mye brukt markører av astrocytter og nevroner (Figur 2), ble utført i hver type kortikal kultur. Denne analysen viste at astrocyttberikede kulturer presenterte 97% av cellene som uttrykker GFAP (figur 2A). Når det gjelder nevron-beriket kultur 78% av cellene uttrykt MAP2, 4% av cellene uttryktGFAP, og 18% av cellene var både GFAP og MAP2-negative (<stron...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Her presenterer vi en enkel tilnærming ved hjelp av spesifikke kulturmedier som gjør det mulig å etablering av nevron- og astrocyttberikede kulturer, eller nevron-gliakulturer fra embryonal cortex, med høyt utbytte og reproduserbarhet.

En cellekulturmodell for å studere rollen som neuron-glia interaksjoner i Iskemi

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Iskemisk slag er en klinisk tilstand preget av hypoperfusjon av hjernevev og resulterer i nevronalt tap. Tallrike bevis tyder på at samspillet mellom glia og urinalceller utøver trykkeffektene etter en iskemisk hendelse. For å utforske potensielle beskyttende mekanismer, er det viktig å utvikle modeller som tillater studier av nevron-glia interaksjoner i et iskemisk miljø.Her presenterer vi en enkel tilnærming for å isolere astrocytter og nevroner fra rotte embryonal cortex, og at ved hjelp av bestemt kulturelt medium tillater etablering av nevron eller astrocytt-berikede kulturer eller neo-glia kulturer med høyt utbytte og reproduserbarhet. For å studere kryssforfølgelse mellom astrocytter og nevroner, foreslår vi en tilnærming, basert på et co-kultursystem, der nevroner dyrket i dekselslips opprettholdes i kontakt med en monolayer av astrocytter belagt i multi-brønnplater. De to kulturene opprettholdes en del av små parafinkuler.Denne tilnærmingen tillater uavhengig manipulering og anvendelse av spesifikk behandling til hver celletype, noe som representerer en fordel i mange studier. For å simulere hva som skjer under et iskemisk slag, blir kulturene utsatt for en oksygen- og glukosemangelprotokoll. Denne protokollen representerer et nyttig verktøy for å studere rollen som neuron-glia interaksjoner i iskemisk slag.Start med rotte embryonal cortex isolasjon. Embryoene ble hentet fra en familie av rotter ved 15 dager etter svangerskapet og er plassert i et sterilt Falcon-rør som inneholder PBS. Fortsatt inne i eggeplommepose embryoer er plassert inne i en petriskål som inneholder kald PBS.Ved hjelp av saks og pinsett er eggeplommeseken ødelagt, og embryoet fjernes og plasseres i en annen petriskål som inneholder kald PBS over en ispakke. Det er nødvendig å være veldig forsiktig når du bryter eggeplommeseken for ikke å skade embryoet. Plasser embryoet under et dissekerende mikroskop, fest forsiktig embryoet ved hjelp av en twizzer.Det første snittet bør være parallelt med cortex. Vær forsiktig så du ikke halshugger dyret. Hodebunnen og fjernes forsiktig for ikke å skade det kortikale hjernevevet.Dette neste snittet skiller cortex. Fjern blodkarene som er tilstede i vevet. Til slutt, ved hjelp av en pipette, overføre kortikal vev til en Falcon tube med PBS.Enkeltcellesuspensjon oppnås gjennom mekanisk fordøyelse av det kortikale hjernevevet ved hjelp av tips med synkende diameter. Pass på at vevet er godt homogenisert Etter fordøyelsen sentrifuger materialet ved 400 Gs i tre minutter. Kast det overnaturlige, og gjenbruk sedimentet i kulturmedium, tidligere varmet opp til 37 grader.Beregn det totale antall celler som er tilstede i suspensjonen ved hjelp av et Neubauer-kammer og klargjør fortynningen for tilstrekkelig celletetthet. Til slutt frø cellene i multi-brønnen og inkubere ved 37 grader. For å forberede materialet til co-kultursystemet, varme parafin i en varmeblokk til det blir flytende.Deretter, ved hjelp av et stereoglass Pasteur pipette forberede små kuler over dekselet slips som tidligere ble plassert i en multi-brønn, og belagt med Poly-D-Lysine. 24 timer før de to kulturene bringes i kontakt, endre kulturmediet av nevroner og astrocytter for å supplere det NBM med eller uten varme inaktivert FBS. Når de to kulturene er klare til bruk, overføre neuron, sitter i dekselet glir med parafin kuler til brønner som inneholder astrocytter ved hjelp av en pinsett tidligere nedsenket i 70% etanol.Etter å ha plassert begge celletypene i kontakt, vent åtte til 12 timer, og start deretter de forskjellige stimuli og prosedyrer. Oksygen- og glukosemangelen utføres i en kultur med syv dager med vekst. Fjern kulturmediet, og vask cellene to ganger med HBSS-medium uten glukosetilskudd.Pass på at alt mediet som inneholder glukose vaskes. Forsegle hypoksikammeret og tilsett gassblandingen som inneholder 95% nitrogen og 5% karbondioksid i fire minutter med en strøm på 20 liter i minutter for å erstatte oksygenet som er tilstede inne i kammeret. Deretter stopper strømmen og plasserer Hypoksikammeret i en inkubator ved 37 grader.Etter perioden med oksygen- og glukosemangel, erstatt mediet, HBSS uten glukosetilskudd med riktig kulturmedium for de gjenværende prosedyrene og inkubere cellene ved 37 grader. For å karakterisere typen kortikal kultur utførte vi immunohistokjemi i de tre typene kortikale kulturer for å vurdere antall celler som uttrykte GFPA eller MAP2, som er markører mye brukt for henholdsvis astrocytiske og nevronale celler. Disse analysene viste at når denne protokollen, vi var i stand til å få en ren beriket kultur av astrocytter med ca 97% av cellene uttrykker GFAP.Når det gjelder nevronberiket kultur, bekreftet vi om lag 78% av cellene som uttrykte MAP2. Men vi identifiserer om 18% av GFAP og MAP2 negative celler. For neuron-glia kortikal kultur, Det ble observert at ca 49% av cellene er MAP2 positive.31% er GFAP positive. Og 20% de er ikke ansvarlig for GFAP eller MAP2. Syv dager etter det kortikale kulturetablissementet ble nevron-gliakulturen og den nevronberikede kulturen utsatt for en OGD-prosedyre i 4 og 6 timer.Etter denne prosedyren ble celler merket med MAP2, og deretter ble antall MAP2-positive celler kvantifisert ved hjelp av fluorescensmikroskopi. I nevron-glia kultur ble det observert en reduksjon på ca 30% i antall nevroner, da kulturen ble sendt til en OGD-periode på 4 timer. Etter en OGD-periode på 6 timer øker utvidelsen av lesjonen, og når ca 60% av neuronal tap.Når det gjelder den berikede kulturen av nevroner utsatt for OGD, ble det observert ca 41% og 64% reduksjon i antall MAP2-celler. Videre ble det observert at i den nevronberikede kulturen var det en liten økning i skadeforlengelsen sammenlignet med neuron-glia-kulturen som også ble utsatt for OGD i løpet av 4 timer. Til slutt representerer her en in vitro-modell for å studere iskemisk slag etablert på en enkel, rask og dyr og reproduserbar måte.I tillegg gjør metoden som er beskrevet, også å implementere nevroner og astrocyttberikede primærkulturer, men også en nevron-gliakultur. Dermed gir en stor in-vitro modell for modellering av flere hjernesykdommer med et høyere nivå av kompleksitet, enn udødelighet cellelinjer og rene nevronale eller glial kulturer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering og kultur neural crest Celler fra Embryonic murin Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dual Elektrofysiologiske Opptak av Synaptically-fremkalt Astroglial og Neuronal Responses i akutt hippocampus Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder for å studere virkningsmekanismer av antipsykotiske legemidler i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Inducing Plasticity av astrocytic Reseptorer av Manipulering av nevronal utløsning priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse Muskel-nerve Forberedelse til Studerer avfyring egenskaper Muscle afferenter

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging av nikotin Induced Kalsium alarm og neurotransmitterfrigivning Sammen ventral Hippokampale Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utnytte Kombinert Metoder for å definere rollen til plasmamembranen Levering Under Axon Forgrening og neuronal morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Den Indirekte Neuron-astrocyte coculture analyse: En<em&gt; In Vitro</em&gt; Oppsett for detaljert undersøkelse av Neuron-gliaceller interaksjoner

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Den optiske fraksjonatorteknikken til å beregne celletal i en rottemodel for elektrokonvulsiv terapi

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...