Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

Os autores reconhecem o apoio de financiamento da Fundação para a Ciência e da Tecnologia por meio dos Projetos UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 e a bolsa SFRH/BD/135936/2018 à JP, por ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' através do projeto CENTRO-01-0145-FEDER-000013 e financiamento para a Plataforma PPBI-Português de Bioimagem através do Projeto POCI-01-0145-FEDER-022122.

Todos os animais utilizados foram criados no Centro de Pesquisa em Ciência da Saúde CICS-UBI, de acordo com os requisitos éticos nacionais para a pesquisa animal e com a Convenção Europeia para a Proteção de Animais vertebrados Usados para Fins Experimentais e Outros Científicos (Diretiva 2010/63/UE).
1. Cultura celular primária do córtex do embrião do rato
<ol><li>Preparação média da cultura<ol>
<li>Prepare o Neurobasal Medium (NBM) adicionando os seguintes suplementos: 2% B27...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

O método aqui descrito consiste no isolamento de astrócito e neurônio do tecido cortical embrionário de ratos, permitindo o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neurônio-glia. Foi adaptado de um estudo anterior do nosso grupo5,onde foram descritas as culturas embrionárias do neurônio cortical-glia e do neurônio enriquecidos com neurônios e as duas culturas caracterizadas. Usando essas culturas, Roque et al. descobriram que os astrócitos desem...

Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, cerca de 5,5 milhões de pessoas morrem todos os anos por acidente vascular cerebral isquêmico1. Essa condição é caracterizada pela interrupção do fluxo sanguíneo para uma determinada região cerebral, resultando em uma perda reversível ou irreversível no fornecimento de oxigênio e nutrientes para o tecido, o que altera a função tecidual e leva à disfunção mitocondrial, desregulação de cálcio, excitoxicidade do glutamato, inflamação e perda celular2,,3.
Além das células vasculares, as células neuronais e gliais estão envolvidas na fisiopatologia do derrame isquêmico4. Em particular, os astrócitos são essenciais para a manutenção dos neurônios e recentemente mostraram-se um papel crítico na resposta à lesão isquêmica5. Este tipo de célula gliaial exerce funções de suporte estrutural, defesa contra estresse oxidativo, síntese de neurotransmissores, estabilização da comunicação célula-célula, entre outras6. Junto com os neurônios, os astrócitos desempenham um papel direto na transmissão sináptica, regulando a liberação de moléculas como triphosfato de adenosina, ácido gama-aminobutírico e glutamato7. Parte da lesão induzida pela isquemia é causada pela liberação excessiva de glutamato e seu acúmulo na fissura sináptica, levando à superativação de receptores N-metil-D-aspartato, ativando cascatas de sinalização a jusante, resultando em excitotoxicidade8. Uma vez que os astrócitos são capazes de remover o glutamato da fissura sináptica e convertê-lo em glutamina, eles são cruciais na defesa contra a excitotoxicidade, exercendo assim um efeito neuroprotetor sobre a isquemia. Essas células também desempenham um papel na neuroinflamação induzida pela isquemia. Após o insulto isquêmico, os astrócitos ativados sofrem alterações morfológicas (hipertrofia), proliferam e mostram um aumento na expressão de proteína ácida fibrilar gliana (GFAP). Eles podem se tornar reativos (astrogliose), liberando citocinas pró-inflamatórias como o fator necrose tumoral-α, interleucina-1α e interleucina-1β, e produzindo radicais livres, incluindo óxido nítrico e superóxido, que por sua vez pode induzir a morte neuronal9,,10. Em contraste, os astrócitos reativas também podem ter um efeito neuroprotetor, uma vez que liberam citocinas anti-inflamatórias, como transformar fator de crescimento-β, que é regulado após o derrame11. Além disso, podem gerar uma cicatriz glianal, que pode limitar a regeneração tecidual inibindo o broto axonal; no entanto, essa cicatriz gliaria pode isolar o local da lesão do tecido viável, evitando assim uma onda cascata de danos teciduais descontrolados12,13.
Assim, é imprescindível estabelecer modelos que permitam estudar interações neurônio-glia sob uma lesão isquêmica, a fim de encontrar estratégias terapêuticas que limitem ou revertam os efeitos da lesão isquêmica. Comparado com outros modelos usados para estudar lesões isquêmicas, ou seja, os modelos in vivo 14,,15,16, culturas organotípicas17,,18,,19 e fatias cerebrais agudas20,,21,,22, culturas celulares primárias são menos complexas, o que possibilita o estudo de contribuições individuais de cada tipo celular na fisiopatologia do derrame isquêmico e como cada tipo de célula responde a possíveis alvos terapêuticos. Tipicamente, para estudar as interações entre culturas enriquecidas por neurônios e culturas enriquecidas por astrócitos, são utilizados neurônios e células gliais de origem pós-natal23,,24ou células gliais pós-natais e neurônios embrionários25,,26. Aqui é proposto uma abordagem simples para estabelecer culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos e culturas neurônio-glia a partir do mesmo tecido. Essas células primárias são obtidas a partir do córtex embrionário de rato, uma região frequentemente afetada pelo acidente vascular cerebral27,28. Além disso, a dissociação do tecido é realizada apenas por um procedimento mecânico. Portanto, este protocolo permite isolar células no mesmo estágio de desenvolvimento, de forma rápida e barata, e com alto desempenho e reprodutibilidade.
O crosstalk entre astrócitos e neurônios pode ser explorado usando um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos semeados em placas multiwell. Pequenas esferas de parafina podem ser usadas para garantir a separação das duas culturas celulares. Esta abordagem permite manipulação independente de cada tipo de célula antes de serem colocados em contato. Por exemplo, é possível silenciar um gene específico em astrócitos e ver como ele pode influenciar a vulnerabilidade neuronal ou proteção contra danos induzidos por isquêmicos. Um método estabelecido para induzir condições isquêmicas in vitro é a privação de oxigênio e glicose (OGD)3, que consiste em substituir a atmosfera regular (95% de ar e 5% DE CO2) por uma atmosfera anoxica (95% N2 e 5% CO2),associada à omissão de glicose.
O método descrito é adequado para estudar as interações entre neurônios e astrócitos no contexto do AVC isquêmico, de forma simples, rápida, reprodutível e barata.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

O AVC isquêmico é uma condição clínica caracterizada pela hipoperfusão do tecido cerebral, levando à privação de oxigênio e glicose, e à consequente perda neuronal. Inúmeras evidências sugerem que a interação entre células gliais e neuronais exerce efeitos benéficos após um evento isquêmico. Portanto, para explorar potenciais mecanismos de proteção, é importante desenvolver modelos que permitam estudar interações neurônio-glia em um ambiente isquêmico. Aqui apresentamos uma abordagem simples para isolar astrócitos e neurônios do córtex embrionário de ratos, e que, usando meios de cultura específicos, permite o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neuron-glia com alto rendimento e reprodutibilidade.
Para estudar a conversa cruzada entre astrócitos e neurônios, propomos uma abordagem baseada em um sistema de co-cultura no qual neurônios cultivados em deslizamentos são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos banhados em placas multiwell. As duas culturas são mantidas separadas por pequenas esferas de parafina. Essa abordagem permite a manipulação independente e a aplicação de tratamentos específicos a cada tipo celular, o que representa uma vantagem em muitos estudos.
Para simular o que ocorre durante um acidente vascular cerebral isquêmico, as culturas são submetidas a um protocolo de privação de oxigênio e glicose. Este protocolo representa uma ferramenta útil para estudar o papel das interações neurônio-glia no derrame isquêmico.

Para caracterizar as culturas, a imunocitoquímica para avaliar o número de células que expressavam GFAP ou MAP2, marcadores amplamente utilizados de astrócitos e neurônios (Figura 2),foi realizada em cada tipo de cultura cortical. Esta análise revelou que as culturas enriquecidas com astrócito apresentaram 97% das células expressas GFAP (Figura 2A). Em relação à cultura enriquecida com neurônios, 78% das células expressas MAP2, 4% das células expre...

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A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Aqui, apresentamos uma abordagem simples usando meios de cultura específicos que permitem o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios e astrócitos, ou culturas neuron-glia do córtex embrionário, com alto rendimento e reprodutibilidade.

Um modelo de cultura celular para estudar o papel das interações neurônio-glia na isquemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

O AVC isquêmico é uma condição clínica caracterizada pela hipoperfusão do tecido cerebral e resulta em perda neuronal. Numerosas evidências sugerem que a interação entre glia e células urinárias exercem os efeitos de pressão após um evento isquêmico. Para explorar potenciais mecanismos de proteção, é importante desenvolver modelos que permitam estudar interações neurônio-glia em um ambiente isquêmico.Aqui apresentamos uma abordagem simples para isolar astrócitos e neurônios do córtex embrionário de ratos, e que usando meio cultural específico permite o estabelecimento de culturas enriquecidas com neurônios ou astrócitos ou culturas neo-glia com alto rendimento e reprodutibilidade. Para estudar a conversa cruzada entre astrócitos e neurônios, propomos uma abordagem, baseada em um sistema de cocultura, no qual neurônios cultivados em deslizamentos de cobertura são mantidos em contato com uma monocamada de astrócitos banhados em placas multi-poços. As duas culturas são mantidas como parte por pequenas esferas de parafina.Essa abordagem permite a manipulação independente e a aplicação de tratamento específico a cada tipo celular, o que representa uma vantagem em muitos estudos. Para simular o que ocorre durante um acidente vascular cerebral isquêmico, as culturas são submetidas a um protocolo de privação de oxigênio e glicose. Este protocolo representa uma ferramenta útil para estudar o papel das interações neurônio-glia no derrame isquêmico.Comece com o isolamento do córtex embrionário de rato. Os embriões foram obtidos de uma família de ratos com 15 dias de gestação e são colocados em um tubo Falcão estéril contendo PBS. Ainda dentro da gema os embriões de sachê são colocados dentro de uma placa de petri contendo PBS frio.Com a ajuda de tesouras e pinças, o saco de gema é quebrado, e o embrião é removido e colocado em outra placa de petri contendo PBS frio sobre uma bolsa de gelo. É necessário ter muito cuidado ao quebrar o saco de gema para não danificar o embrião. Posicione o embrião sob um microscópio dissecando, conserte suavemente o embrião usando um twizzer.A incisão inicial deve ser paralela ao córtex. Cuidado para não decapitar o animal. O couro cabeludo e são cuidadosamente removidos para não danificar o tecido cerebral cortical.Esta próxima incisão separa o córtex. Remova os vasos sanguíneos presentes no tecido. Finalmente, usando uma pipeta, transfira o tecido cortical para um tubo Falcon com PBS.A suspensão de célula única é obtida através da digestão mecânica do tecido cerebral cortical usando pontas com diâmetro decrescente. Certifique-se de que o tecido está bem homogeneizado Após a digestão, centrifufique o material a 400 Gs por três minutos. Descarte o supernasce, e resuspenque o sedimento em meio de cultura, previamente aquecido a 37 graus.Calcule o número total de células presentes na suspensão usando uma câmara de Neubauer e prepare a diluição para a densidade celular adequada. Finalmente, semear as células no multi-poço e incubar a 37 graus. Para preparar o material para o sistema de cocultura, aqueça a parafina em um bloco de aquecimento até que se torne líquida.Em seguida, com a ajuda de um vidro estéreo, a pipeta Pasteur prepara pequenas esferas sobre os deslizamentos de cobertura que foram previamente colocados em um multi-poço, e revestidos com Poli-D-Lysine. 24 horas antes das duas culturas serem trazidas em contato, mude o meio cultural dos neurônios e astrócitos para suplementá-lo NBM com ou sem FBS inativados por calor. Quando as duas culturas estiverem prontas para uso, transfira o neurônio, sentado na tampa desliza com esferas de parafina para poços contendo astrócitos usando uma pinça anteriormente imersa em 70% de etanol.Depois de colocar ambos os tipos de células em contato, espere de oito a 12 horas e, em seguida, inicie os diferentes estímulos e procedimentos. A privação de oxigênio e glicose é realizada em uma cultura com sete dias de crescimento. Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com o meio HBSS sem suplementação de glicose.Certifique-se de que todo o meio que contém glicose está lavado. Sele a Câmara de Hipóxia e adicione a mistura de gás contendo 95% de nitrogênio e 5% de dióxido de carbono por quatro minutos com um fluxo de 20 litros por minutos, a fim de substituir o oxigênio presente dentro da câmara. Em seguida, pare o fluxo e coloque a Câmara de Hipóxia em uma incubadora a 37 graus.Após o período de privação de oxigênio e glicose, substitua o médio, HBSS sem suplementação de glicose pelo meio de cultura adequado para os procedimentos restantes e incubar as células a 37 graus. Para caracterizar o tipo de cultura cortical, realizamos a imunohistoquímica nos três tipos de culturas corticais para avaliar o número de células que expressavam GFPA ou MAP2, que são marcadores amplamente utilizados para células astrocíticas e neuronais, respectivamente. Essas análises revelaram que, quando este protocolo, conseguimos obter uma cultura pura e enriquecida de astrócitos com cerca de 97% das células expressando GFAP.Em relação à cultura enriquecida com neurônios, verificamos cerca de 78% das células expressas MAP2. No entanto, identificamos cerca de 18% das células negativas GFAP e MAP2. Para a cultura cortical neurônio-glia, observou-se que cerca de 49% das células são MAP2 positivas.31% são GFAP positivos. E 20% não são responsáveis por GFAP nem MAP2. Sete dias após o estabelecimento da cultura cortical, a cultura neurônio-glia e a cultura enriquecida com neurônios foram submetidas a um procedimento OGD por 4 e 6 horas.Após esse procedimento, as células foram rotuladas com MAP2 e, em seguida, o número de células positivas MAP2 foram quantificadas por meio de microscopia de fluorescência. Na cultura neuron-glia, observou-se uma diminuição de cerca de 30% no número de neurônios, quando a cultura foi submetida a um período de OGD de 4 horas. Após um período de OGD de 6 horas, a extensão da lesão aumenta, atingindo cerca de 60% da perda neuronal.Quanto à cultura enriquecida dos neurônios expostos ao OGD, observou-se uma redução de cerca de 41% e 64% no número de células MAP2. Além disso, observou-se que na cultura enriquecida com neurônios, houve um ligeiro aumento na extensão da lesão quando comparada à cultura neurônio-glia também exposta ao OGD durante 4 horas. Em conclusão, aqui representam um modelo in vitro para estudar o avc isquêmico estabelecido de forma simples, rápida e cara e reprodutível.Além disso, o método descrito também permite implementar neurônios e culturas primárias enriquecidas por astrócitos, mas também uma cultura neurônio-glia. Assim, fornecendo um ótimo modelo in vitro para modelar várias doenças cerebrais com um nível mais elevado de complexidade, do que linhas celulares imortalizadas e culturas neuronais ou gliais puras.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

Um Procedimento para o Estudo do Reintegração Footshock Induzida de cocaína Buscando em ratos de laboratório

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Neurociência

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Métodos para o estudo dos mecanismos de ação dos antipsicóticos Drogas em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Um<em&gt; In Vitro</emPreparação Muscle-nervo&gt; Adulto mouse para estudar as propriedades de queima de músculos aferentes

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utilizando metodologias combinadas para definir o papel do Plasma Membrane entrega durante Axon Ramificação e Neuronal morfogênese

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

A técnica de fracionador óptico para estimar números de células em um modelo de rato de terapia eletroconvulsiva

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...