Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

Авторы признают финансовую поддержку фонда пара Циенсия электронной Tecnologia через проекты UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 и стипендий SFRH/BD/135936/2018 в JP, по "Programa Operacional do Centro, Centro 2020" через проект CENTRO-01-0145-FEDER-000013 и финансирование PPBI-Португальской платформы биоимейминг через проект POCI-01-0145-FEDER-022122.

Все животные, используемые были выведены в Научно-исследовательский центр здоровья CICS-UBI в соответствии с национальными этическими требованиями к исследованиям на животных и Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целя...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

Описанный здесь метод состоит из изоляции астроцитов и нейронов от эмбриональной корковой ткани крысы, что позволяет создать обогащенные нейронами или астроцитами культуры или культуры нейронной глии. Он был адаптирован из предыдущего исследования нашейгруппы 5, где кор?...

По данным Всемирной организации здравоохранения, около 5,5 миллионов человек умирают каждый год от ишемического инсульта1. Это условие характеризуется прерыванием притока крови к определенной области мозга, что приводит к обратимой или необратимой потере в поставках кислорода и питательных веществ в ткани, что изменяет функцию тканей и приводит к митохондриальной дисфункции, дисрегуляции кальция, глутаматной акутотоксичности, воспалениюи потере клеток 2,3.
Помимо сосудистых клеток, в патофизиологии ишемического инсульта 4 участвуют нейрональные и глиальныеклетки. В частности, астроциты имеют важное значение для поддержания нейронов и в последнее время было показано, играют важную роль в ответ на ишемическоепоражение 5. Этот тип глиальных клеток выполняет функции структурной поддержки, защиты от окислительного стресса, синтеза нейротрансмиттеров, стабилизации клеточной связи, средипрочих 6. Наряду с нейронами, астроциты играют непосредственную роль в синаптической передаче, регулируя высвобождение молекул, таких как аденозинтрифосфат, гамма-аминомасляная кислота иглутамат 7. Часть травмы, вызванной ишемией, вызвана чрезмерным высвобождением глутамата и его накоплением в синаптической расщелине, что приводит к чрезмерной активации N-метил-D-аспаратных рецепторов, активируя вниз по течению сигнальные каскады, что в конечном итоге приводит к возбуждению8. Так как астроциты способны удалить глутамат из синаптической расщелины и преобразовать его в глутамин, они имеют решающее значение в защите от возбудимости, тем самым оказывая нейропротекторное воздействие на ишемию. Эти клетки также играют роль в ишемии индуцированной нейровоспламенения. После ишемического оскорбления активированные астроциты претерпевает морфологические изменения (гипертрофия), размножаются и показывают увеличение экспрессии глиального фибриллярного кислотного белка (GFAP). Они могут стать реактивными (астроглиоз), выпуская провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α, интерлейкин-1 и интерлейкин-1 ", и производство свободных радикалов, в том числе оксида азота и супероксида, который, в свою очередь, можетвызвать нейронной смерти 9,10. В отличие от этого, реактивные астроциты могут также играть нейропротекторный эффект, так как они выпускают противовоспалительные цитокины, такие как преобразование фактора роста-β, который регулируется послеинсульта 11. Кроме того, они могут генерировать глиальный шрам, который может ограничить регенерацию тканей путем ингибирования прорастания аксонала; однако, этот глиальный шрам может изолировать место травмы от жизнеспособной ткани, тем самым предотвращая каскадную волну неконтролируемогоповреждения тканей 12,13.
Таким образом, необходимо создать модели, которые позволяют изучать взаимодействия нейронов и глии под ишемической травмой, чтобы найти терапевтические стратегии, которые ограничивают или обратить вспять последствия ишемической травмы. По сравнению с другими моделями, используемыми для изучения ишемической травмы, а именно in vivo модели 14,,15,,16,органотипическиекультуры 17,,18,,19 иострые ломтики мозга 20,,21,22 ,первичные клеточныекультуры менее сложны, что делает возможным изучение индивидуального вклада каждого типа клеток в патофизиологии ишемического инсульта и как каждый тип клеток реагирует на возможные цели. Как правило, для изучения взаимодействий между обогащенными нейронами культурами и обогащенными астроцитами культурами используются нейроны иглиальные клетки послеродового происхождения 23, 24,24, или послеродовые глиальные клетки и эмбриональныенейроны 25,26. В этом предлагается простой подход к созданию нейронов или астроцитов обогащенных культур и нейронов-глии культур из той же ткани. Эти первичные клетки получены из эмбриональной коры крысы, области, часто пострадавших отинсульта 27,28. Более того, диссоциация ткани осуществляется только механической процедурой. Таким образом, этот протокол позволяет изолировать клетки на той же стадии развития, быстрым и недорогим способом, и с высокой производительностью и воспроизводимостью.
Перекрестный разговор между астроцитами и нейронами может быть исследован с помощью системы совместной культуры, в которой нейроны, культурные в coverslips поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, посеянных в многоувелицевых пластин. Малые парафиновые сферы могут быть использованы для обеспечения разделения двух клеточных культур. Такой подход позволяет самостоятельно манипулировать каждым типом ячейки, прежде чем они ввяжут. Например, можно заставить замолчать определенный ген в астроцитах и посмотреть, как он может повлиять на уязвимость нейронов или защиту от ишемического повреждения. Установленным методом индуцирования ишемических условий in vitro является лишение кислорода и глюкозы (OGD)3, который состоит в замене обычной атмосферы (95% воздуха и 5% CO2)аноксической атмосферой (95% N2 и 5% CO2),связанной с упущением глюкозы.
Описанный метод подходит для изучения взаимодействий между нейронами и астроцитами в контексте ишемического инсульта простым, быстрым, воспроизводимым и недорогим способом.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

Ишемический инсульт является клиническим состоянием, характеризующимся гипоперфузией тканей мозга, что приводит к лишению кислорода и глюкозы, а также последующей потере нейронов. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие между глиальными и нейрональными клетками оказывает благотворное воздействие после ишемического события. Поэтому для изучения потенциальных защитных механизмов важно разработать модели, позволяющие изучать взаимодействия нейронов и глий в ишемической среде. В этом мы представляем простой подход к изоляции астроцитов и нейронов из эмбриональной коры крысы, и что с помощью конкретных средств культуры, позволяет создание нейронов или астроцитов обогащенных культур или нейронов-глии культур с высокой урожайностью и воспроизводимостью.
Для изучения перекрестного контакта между астроцитами и нейронами, мы предлагаем подход, основанный на системе совместной культуры, в которой нейроны, культурные в coverslips поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, покрываемых в многовелл пластин. Две культуры поддерживаются отдельно небольшими парафиновых сферами. Такой подход позволяет независимые манипуляции и применение конкретных методов лечения для каждого типа клеток, что представляет собой преимущество во многих исследованиях.
Чтобы имитировать то, что происходит во время ишемического инсульта, культуры подвергаются кислорода и глюкозы протокола лишения. Этот протокол представляет собой полезный инструмент для изучения роли нейронно-глийских взаимодействий в ишемическом инсульте.

Чтобы охарактеризовать культуры, иммуноцитохимия для оценки количества клеток, которые выразили GFAP или MAP2, широко используемые маркеры астроцитов инейронов (рисунок 2), была выполнена в каждом типе корковой культуры. Этот анализ показал, что обогащенные астроцитами кул...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Здесь мы представляем простой подход с использованием конкретных средств культуры, что позволяет создание нейронов и астроцитов обогащенных культур, или нейрон-глии культур из эмбриональной коры, с высокой урожайностью и воспроизводимостью.

Модель клеточной культуры для изучения роли взаимодействия нейронов и глий в ишемии

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Ишемический инсульт является клиническим состоянием, характеризующимся гипоперфузией тканей мозга и приводит к потере нейронов. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие между глией и писсуарными клетками оказывает давление после ишемического события. Для изучения потенциальных защитных механизмов важно разработать модели, позволяющие изучать взаимодействия нейронов и глии в ишемической среде.Здесь мы представляем простой подход к изоляции астроцитов и нейронов от эмбриональной коры крыс, и что с помощью конкретных культурных сред позволяет создание нейронов или астроцитов обогащенных культур или нео-глии культур с высокой урожайностью и воспроизводимостью. Для изучения перекрестного стебля между астроцитами и нейронами, мы предлагаем подход, основанный на системе совместной культуры, в которой нейроны, культурные в крышках скользит поддерживаются в контакте с монослой астроцитов, покрыных в многофункциональных пластин. Эти две культуры поддерживаются частью небольших парафиновых сфер.Такой подход позволяет независимые манипуляции и применение конкретного лечения для каждого типа клеток, что представляет собой преимущество во многих исследованиях. Чтобы имитировать то, что происходит во время ишемического инсульта, культуры подвергаются кислорода и глюкозы протокола лишения. Этот протокол представляет собой полезный инструмент для изучения роли нейронно-глийских взаимодействий в ишемическом инсульте.Начните с изоляции эмбриональной коры крысы. Эмбрионы были получены из семьи крыс в 15 дней беременности и помещаются в стерильную трубку Falcon, содержащую PBS. Все еще внутри эмбрионов пакетика желтка помещены внутри чашки Петри, содержащей холодный PBS.С помощью ножниц и пинцета желточный мешок нарушается, и эмбрион удаляется и помещается в другую чашку Петри, содержащую холодный PBS над пакетом со льдом. Необходимо быть очень осторожным при нарушении желточный мешок, чтобы не повредить эмбрион. Распоить эмбрион под рассечением микроскопа, аккуратно зафиксировать эмбрион с помощью twizzer.Первоначальный разрез должен быть параллельным коре головного мозга. Будьте осторожны, чтобы не обезглавить животное. Кожу головы и тщательно удаляют, чтобы не повредить ткани коркового мозга.Следующий разрез отделяет кору. Удалите кровеносные сосуды, присутствующие в ткани. Наконец, используя пипетку, перенесите корковую ткань в трубку Falcon с помощью PBS.Одноклеточная суспензия получена путем механического пищеварения ткани головного мозга с помощью кончиков с уменьшением диаметра. Убедитесь, что ткань хорошо гомогенизирована После пищеварения, центрифуга материала на 400 Gs в течение трех минут. Откажитесь от супернатанта и ассизентьте осадок в среде культуры, предварительно разогретой до 37 градусов.Рассчитайте общее количество ячеек, присутствующих в подвеске с помощью камеры Neubauer и препарировать разбавление для адекватной плотности клеток. Наконец, семена клеток в мульти-хорошо и инкубировать при 37 градусов. Для того, чтобы подготовить материал для системы совместной культуры, нагреть парафин в нагревательном блоке, пока он не станет жидким.Затем с помощью стереостекла Пастер пипетка подготовить небольшие сферы над крышкой скользит, которые ранее были помещены в несколько хорошо, и покрыты Поли-D-Лизин. За 24 часа до того, как две культуры совесят, измените культурную среду нейронов и астроцитов, чтобы дополнить ее NBM тепловой инактивированной FBS или без нее. Когда две культуры будут готовы к использованию, перенесите нейрон, сидящий в крышке, скользит парафиновые сферы в скважины, содержащие астроциты с помощью пинцета, ранее погруженного в 70% этанола.После размещения обоих типов клеток в контакте, ждать от восьми до 12 часов, а затем начать различные стимулы и процедуры. Лишение кислорода и глюкозы осуществляется в культуре с семи дней роста. Удалить культуру среды, и мыть клетки два раза с HBSS среды без добавок глюкозы.Убедитесь, что вся среда, содержащая глюкозу, промывается. Печать Гипоксия камеры и добавить газовую смесь, содержащую 95% азота и 5%углекислого газа в течение четырех минут с потоком 20 литров в течение нескольких минут, с тем чтобы заменить кислород присутствует внутри камеры. Затем остановите поток и поместите камеру Гипоксии в инкубатор при 37 градусах.После периода лишения кислорода и глюкозы, заменить средний, HBSS без добавок глюкозы с соответствующей среде культуры для остальных процедур и инкубировать клетки на 37 градусов. Для того, чтобы охарактеризовать тип корковой культуры, мы выполнили иммуногистохимию в трех типах корковых культур для оценки количества клеток, которые выразили GFPA или MAP2, которые являются маркерами широко используются для астроцитных и нейрональных клеток соответственно. Этот анализ показал, что, когда этот протокол, мы смогли получить чистую обогащенную культуру астроцитов с около 97% клеток, выражаюющих GFAP.Что касается обогащенной нейронами культуры, мы проверили около 78% клеток, выражаюющих MAP2. Однако мы выявляем около 18% отрицательных ячеек GFAP и MAP2. Для нейронно-глиальной корковой культуры, Было отмечено, что около 49% клеток MAP2 положительные.31% являются GFAP положительными. И 20% они не несут ответственности за GFAP или MAP2. Через семь дней после создания корковой культуры культура нейронов и обогащенная нейронами культура подвергались процедуре OGD в течение 4 и 6 часов.После этой процедуры клетки были помечены MAP2, а затем количество положительных клеток MAP2 было количественно с помощью микроскопии флуоресценции. В нейронно-глиальной культуре наблюдалось снижение примерно на 30% числа нейронов, когда культура была представлена в период OGD 4 часа. После периода OGD 6 часов, расширение поражения увеличивается, достигнув около 60% от потери нейронов.Что касается обогащенной культуры нейронов, подвергшихся воздействию OGD, было отмечено около 41% и 64% снижение числа клеток MAP2. Кроме того, было отмечено, что в обогащенной нейронами культуре, было небольшое увеличение увеличения травмы по сравнению с нейронно-глиальной культуры также подвергаются ОГД в течение 4 часов. В заключение, здесь представляют собой модель in vitro для изучения ишемического инсульта, установленного простым, быстрым, дорогим и воспроизводимым способом.Кроме того, описанный метод также позволяет реализовать нейроны и обогащенные астроцитами первичные культуры, а также культуру нейронов-глий. Таким образом, обеспечивая большую модель in-vitro для моделирования нескольких заболеваний мозга с более высоким уровнем сложности, чем увековеченные клеточные линии и чистые нейронные или глиальные культуры.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

Методика исследования Footshock-индуцированные Восстановление Кокаин ищу в лабораторных крыс

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Методы изучения механизмов действия антипсихотических препаратов в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Склонение пластичности астроцитов рецепторов манипуляциями нейронных уровней расхода топлива

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

<em&gt; In Vitro</em&gt; Взрослый мышь Muscle-нерв Подготовка к Изучая стрельбы Свойства Muscle афференты

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Живая съемка никотина индуцированной сигнализации кальция и высвобождение нейромедиаторов Наряду вентральной гиппокампа Аксоны

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Использование Комбинированные методики для определения роли плазмалеммы доставкой в ​​Axon ветвление и морфогенеза нейронов

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Непрямой Нейрон-астроцитов Анализ Совместное культивирование:<em&gt; In Vitro</em&gt; Настройка для детального исследования Нейрон-глии взаимодействий

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Методика оптического фракционирования для оценки номеров клеток в модели крыс с электросудорожной терапией

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...