Name: a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia
Uploaded: 2020-11-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

Författarna erkänner finansieringsstödet genom Fundação para a Ciência e a Tecnologia through Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 och stipendium SFRH/BD/135936/2018 till JP, genom ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020" genom projektet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 och finansiering till PPBI-Portugisiska plattformen för bioimaging genom projektet POCI-01-0145-FEDER-022122.

Alla djur som användes föddes upp vid CICS-UBI Health Science Research Centre i enlighet med de nationella etiska kraven för djurforskning och med Europeiska konventionen om skydd av ryggradsdjur som används för experimentella och andra vetenskapliga ändamål (direktiv 2010/63/EU).
1. Råtta embryo cortex primära cell kultur
<ol><li>Förberedelse för kulturmedium<ol>
<li>Förbered Neurobasal Medium (NBM) genom att tillsätta följande kosttillskott: 2% B27, 0,5 mM glutamin, 25 μM gl...

<ol>
	<li>Donkor, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroke+in+the+21(st)+Century:+A+Snapshot+of+the+Burden,+Epidemiology,+and+Quality+of+Life.">Stroke in the 21(st) Century: A Snapshot of the Burden, Epidemiology, and Quality of Life.</a> Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165 (2018).</li><li>Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+ischaemic+stroke:+an+integrated+view.">Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view.</a> Trends in Neurosciences. 22 (9), 391-397 (1999).</li><li>Woodruff, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology,+treatment,+and+animal+and+cellular+models+of+human+ischemic+stroke.">Pathophysiology, treatment, and animal and cellular models of human ischemic stroke.</a> Molecular Neurodegeneration. 6 (1), 11 (2011).</li><li>Berezowski, V., Fukuda, A. M., Cecchelli, R., Badaut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+and+astrocytes:+a+concerto+en+duo+in+ischemic+pathophysiology.">Endothelial cells and astrocytes: a concerto en duo in ischemic pathophysiology.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 176287 (2012).</li><li>Roque, C., Baltazar, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Astrocytes+on+the+Injury+Induced+by+In+vitro+Ischemia.">Impact of Astrocytes on the Injury Induced by In vitro Ischemia.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (8), 1521-1528 (2017).</li><li>Ransom, B. R., Ransom, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+multitalented+stars+of+the+central+nervous+system.">Astrocytes: multitalented stars of the central nervous system.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 3-7 (2012).</li><li>Halassa, M. M., Fellin, T., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripartite+synapse:+roles+for+gliotransmission+in+health+and+disease.">The tripartite synapse: roles for gliotransmission in health and disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (2), 54-63 (2007).</li><li>Forder, J. P., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+mechanisms+of+excitotoxicity:+Involvement+of+postsynaptic+density+proteins,+radicals,+and+oxidant+molecules.">Postsynaptic mechanisms of excitotoxicity: Involvement of postsynaptic density proteins, radicals, and oxidant molecules.</a> Neuroscience. 158 (1), 293-300 (2009).</li><li>Basic Kes, V., Simundic, A. M., Nikolac, N., Topic, E., Demarin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-inflammatory+and+anti-inflammatory+cytokines+in+acute+ischemic+stroke+and+their+relation+to+early+neurological+deficit+and+stroke+outcome.">Pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in acute ischemic stroke and their relation to early neurological deficit and stroke outcome.</a> Clinical Biochemistry. 41 (16-17), 1330-1334 (2008).</li><li>Gursoy-Ozdemir, Y., Can, A., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reperfusion-induced+oxidative/nitrative+injury+to+neurovascular+unit+after+focal+cerebral+ischemia.">Reperfusion-induced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 35 (6), 1449-1453 (2004).</li><li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice.">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+scar+formation+occurs+in+the+human+brain+after+ischemic+stroke.">Glial scar formation occurs in the human brain after ischemic stroke.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (4), 344-348 (2014).</li><li>Rodriguez-Grande, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute-phase+protein+PTX3+is+an+essential+mediator+of+glial+scar+formation+and+resolution+of+brain+edema+after+ischemic+injury.">The acute-phase protein PTX3 is an essential mediator of glial scar formation and resolution of brain edema after ischemic injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 34 (3), 480-488 (2014).</li><li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Alterations+of+Brain+Injury,+Functional+Recovery,+and+Metabolites+Profile+after+Cerebral+Ischemia/Reperfusion+in+Rats+Contributes+to+Potential+Biomarkers.">Dynamic Alterations of Brain Injury, Functional Recovery, and Metabolites Profile after Cerebral Ischemia/Reperfusion in Rats Contributes to Potential Biomarkers.</a> Journal of Molecular Neuroscience. 70 (5), 667-676 (2020).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+of+intrauterine+immune+challenge+on+neonatal+and+adult+brain+vulnerability+to+hypoxia-ischemia.">Dual role of intrauterine immune challenge on neonatal and adult brain vulnerability to hypoxia-ischemia.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 66 (6), 552-561 (2007).</li><li>Panahpour, H., Farhoudi, M., Omidi, Y., Mahmoudi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+In+vivo+Assessment+of+Blood-Brain+Barrier+Disruption+in+a+Rat+Model+of+Ischemic+Stroke.">An In vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57156 (2018).</li><li>Laake, J. H., Haug, F. M., Wieloch, T., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+in+vitro+model+of+ischemia+based+on+hippocampal+slice+cultures+and+propidium+iodide+fluorescence.">A simple in vitro model of ischemia based on hippocampal slice cultures and propidium iodide fluorescence.</a> Brain Research Protocols. 4 (2), 173-184 (1999).</li><li>Cimarosti, H., Kantamneni, S., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ischaemia+differentially+regulates+GABA(B)+receptor+subunits+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Ischaemia differentially regulates GABA(B) receptor subunits in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neuropharmacology. 56 (8), 1088-1096 (2009).</li><li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+evidence+of+apoptosis-mediated+ischemic+injury+in+organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures.</a> Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).</li><li>Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rat+Hippocampal+Slice+Preparation+as+an+Invitro+Model+of+Ischemia.">The Rat Hippocampal Slice Preparation as an Invitro Model of Ischemia.</a> Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).</li><li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+adenosine+deaminase+in+the+striatum.">Neuroprotective effects of adenosine deaminase in the striatum.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (4), 709-720 (2016).</li><li>Dennis, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen/Glucose+Deprivation+Induces+a+Reduction+in+Synaptic+AMPA+Receptors+on+Hippocampal+CA3+Neurons+Mediated+by+mGluR1+and+Adenosine+A(3)+Receptors.">Oxygen/Glucose Deprivation Induces a Reduction in Synaptic AMPA Receptors on Hippocampal CA3 Neurons Mediated by mGluR1 and Adenosine A(3) Receptors.</a> Journal of Neuroscience. 31 (33), 11941-11952 (2011).</li><li>Bar El, Y., Kanner, S., Barzilai, A., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+changes+in+neuron-astrocyte+networks+in+culture+under+the+effect+of+norepinephrine.">Activity changes in neuron-astrocyte networks in culture under the effect of norepinephrine.</a> PLoS One. 13 (10), (2018).</li><li>Kuszczyk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+the+Interaction+between+Apolipoprotein+E+and+A+beta+Reduces+Intraneuronal+Accumulation+of+A+beta+and+Inhibits+Synaptic+Degeneration.">Blocking the Interaction between Apolipoprotein E and A beta Reduces Intraneuronal Accumulation of A beta and Inhibits Synaptic Degeneration.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1750-1768 (2013).</li><li>Skaper, S. D., Facci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+Nervous+System+Neuron-Glia+co-Culture+Models+and+Application+to+Neuroprotective+Agents.">Central Nervous System Neuron-Glia co-Culture Models and Application to Neuroprotective Agents.</a> Methods in Molecular Biology. 1727, 63-80 (2018).</li><li>Fang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+astrocyte+on+neuronal+outgrowth+in+a+layered+3D+structure.">Effects of astrocyte on neuronal outgrowth in a layered 3D structure.</a> BioMedical Engineering OnLine. 18 (1), 74 (2019).</li><li>Fernando, G., Yamila, R., Cesar, G. J., Ramon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+Effects+of+neuroEPO+Using+an+In+vitro+Model+of+Stroke.">Neuroprotective Effects of neuroEPO Using an In vitro Model of Stroke.</a> Behavioral Sciences. 8 (2), (2018).</li><li>Zhao, L. R., Willing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+endogenous+capacity+to+repair+a+stroke-damaged+brain:+An+evolving+field+for+stroke+research.">Enhancing endogenous capacity to repair a stroke-damaged brain: An evolving field for stroke research.</a> Progress in Neurobiology. 163, 5-26 (2018).</li><li>Crandall, J. E., Jacobson, M., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogenesis+of+microtubule-associated+protein+2+(MAP2)+in+embryonic+mouse+cortex.">Ontogenesis of microtubule-associated protein 2 (MAP2) in embryonic mouse cortex.</a> Brain Research. 393 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chamak, B., Fellous, A., Glowinski, J., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAP2+expression+and+neuritic+outgrowth+and+branching+are+coregulated+through+region-specific+neuro-astroglial+interactions.">MAP2 expression and neuritic outgrowth and branching are coregulated through region-specific neuro-astroglial interactions.</a> Journal of Neuroscience. 7 (10), 3163-3170 (1987).</li><li>Almeida, A., Medina, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+the+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+neurons+and+astrocytes+in+primary+culture.">A rapid method for the isolation of metabolically active mitochondria from rat neurons and astrocytes in primary culture.</a> Brain Research Protocols. 2 (3), 209-214 (1998).</li><li>Bessa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPER:+A+new+tool+to+protect+dopaminergic+neurons.">GPER: A new tool to protect dopaminergic neurons.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (10), 2035-2041 (2015).</li><li>De Simone, U., Caloni, F., Gribaldo, L., Coccini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Co-culture+Model+of+Neurons+and+Astrocytes+to+Test+Acute+Cytotoxicity+of+Neurotoxic+Compounds.">Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds.</a> International Journal of Toxicology. 36 (6), 463-477 (2017).</li><li>Yang, L., Shah, K. K., Abbruscato, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+ischemic+stroke.">An in vitro model of ischemic stroke.</a> Methods in Molecular Biology. 814, 451-466 (2012).</li><li>Holloway, P. M., Gavins, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Ischemic+Stroke+In+Vitro:+Status+Quo+and+Future+Perspectives.">Modeling Ischemic Stroke In Vitro: Status Quo and Future Perspectives.</a> Stroke. 47 (2), 561-569 (2016).</li><li>Rossi, D. J., Brady, J. D., Mohr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+metabolism+and+signaling+during+brain+ischemia.">Astrocyte metabolism and signaling during brain ischemia.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1377-1386 (2007).</li></ol>

Metoden här beskrivs består av astrocyten och neuron isolering från råtta embryonal kortikal vävnad, vilket möjliggör inrättandet av neuron- eller astrocyte-berikade kulturer eller neuron-glia kulturer. Den var anpassad från en tidigare studie av vår grupp5, där kortikala neuronen–glia och neuron-berikade embryonala kulturer isolering beskrevs och de två kulturerna kännetecknas. Använda dessa kulturer, Roque et al. fann att astrocyter spelar en nyckelroll i att svara på en ischemi...

Enligt uppgifter från Världshälsoorganisationen, cirka 5,5 miljoner människor dör varje år från ischemisk stroke1. Detta tillstånd kännetecknas av avbrott i blodflödet till en viss hjärnregion, vilket resulterar i en reversibel eller irreversibel förlust i tillförseln av syre och näringsämnen till vävnaden, vilket förändrar vävnadsfunktionen och leder till mitokondriell dysfunktion, kalciumdysreglering, glutamat excitotoxicitet, inflammation och cellförlust2,3.
Bortsett från vaskulära celler, neuronala och gliaceller är inblandade i patofysiologi av den ischemiska stroke4. I synnerhet är astrocyter väsentliga för underhåll av nervceller och nyligen visades spela en avgörande roll i svaret på den ischemiska lesion5. Denna typ av gliacell utför funktioner av strukturellt stöd, försvar mot oxidativ stress, syntes av signalsubstanser, stabilisering av cell-cell kommunikation, bland annat6. Tillsammans med nervceller, astrocyter spelar en direkt roll i synaptisk överföring, reglera frisättningen av molekyler såsom adenosintrifosfat, gamma-aminosmörsyra och glutamat7. En del av den skada som induceras av ischemi orsakas av den överdrivna frisättningen av glutamat och dess ackumulering vid den synaptiska spalten, vilket leder till överaktivering av N-metyl-D-aspartatreceptorer, aktiverande nedströms signalerande kaskader, vilket slutligen resulterar i excitotoxicitet8. Eftersom astrocyter har möjlighet att ta bort glutamat från den synaptiska spalten och omvandla den till glutamin, de är avgörande för att försvara sig mot excitotoxicitet, och därigenom utövar en nervskyddande effekt på ischemi. Dessa celler spelar också en roll i ischemi-inducerad neuroinflammation. Efter den ischemiska förolämpning, aktiverade astrocyterna genomgå morphologic förändringar (hypertrofi), proliferera, och visa en ökning av stödjeceller fibrillary sura protein (GFAP) uttryck. De kan bli reaktiva (astrogliosis), släppa proinflammatoriska cytokiner såsom tumörnekros faktor-α, interleukin-1α och interleukin-1β, och producerar fria radikaler, inklusive kväveoxid och superoxid, som i sin tur kan framkalla neuronal död9,10. Däremot kan reaktiva astrocyter också spela en nervskyddande effekt, eftersom de släpper antiinflammatoriska cytokiner, såsom omvandla tillväxtfaktor-β, som är uppreglerad efter stroke11. Dessutom kan de generera ett gliavärde ärr, som kan begränsa vävnadsregenerering genom att hämma axonal groning; emellertid kan detta glia ärr isolera skadestället från livskraftig vävnad, vilket förhindrar en kaskadvåg av okontrollerad vävnadsskada12,13.
Således är det absolut nödvändigt att fastställa modeller som tillåter att studera neuron-glia interaktioner under en ischemisk skada i syfte att hitta terapeutiska strategier som begränsar eller vända effekterna av ischemisk skada. Jämfört med andra modeller som används för att studera ischemisk skada, nämligen in vivo modeller 14,15,16, organotypiska kulturer17,18,19 och akut hjärnskivor20,21,22, primära cellkulturer är mindre komplexa, vilket gör det möjligt att studera individuella bidrag av varje celltyp i patofysiologin i ischemisk stroke och hur varje celltyp svarar på möjliga terapeutiska mål. Typiskt, för att studera interaktioner mellan neuron-berikade kulturer och astrocyter-berikade kulturer, nervceller och gliaceller av postnatalt ursprung används23,24, eller postnatala gliaceller och embryonala nervceller25,26. Häri föreslås en enkel metod för att etablera neuron- eller astrocyte-berikade kulturer och neuron-glia kulturer från samma vävnad. Dessa primära celler erhålls från råtta embryonala cortex, en region som ofta påverkas av stroke27,28. Dessutom utförs dissociationen av vävnaden endast genom ett mekaniskt förfarande. Därför tillåter detta protokoll isolera celler i samma utvecklingsstadium, på ett snabbt och billigt sätt, och med hög prestanda och reproducerbarhet.
Överhörningen mellan astrocyter och nervceller kan utforskas med hjälp av en co-kultur system där nervceller odlade i täckplattor upprätthålls i kontakt med ett monolager av astrocyter seedade i multiwell plattor. Små paraffinsfärer kan användas för att säkerställa separationen av de två cellkulturerna. Detta tillvägagångssätt tillåter oberoende manipulation av varje celltyp innan de bringas i kontakt. Det är till exempel möjligt att tysta en specifik gen i astrocyter och se hur den kan påverka den neuronala sårbarheten eller skyddet mot ischemisk-inducerad skada. En etablerad metod för att inducera ischemisk-liknande förhållanden in vitro är syre och glukos deprivation (OGD)3, som består i att ersätta den regelbundna atmosfären (95% luft och 5% CO2) med en anoxic atmosfär (95% N2 och 5% CO2), samband med utelämnandet av glukos.
Den beskrivna metoden är lämplig för att studera interaktionerna mellan nervceller och astrocyter i samband med ischemisk stroke, på ett enkelt, snabbt, reproducerbart och billigt sätt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24 -well culture plates</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% N2/5% CO2 gas cylinder</td>
			<td>ArL&#237;quido</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td>1/1000 dilution; incubation period - 1 h at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G/0450/60</td>
			<td>3.4 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioObserver Z1x</td>
			<td>63x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0615</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1272</td>
			<td>120 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>25&#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td>0.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>2 &#181;M; incubation period - 10 min at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia incubation chamber</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>27310</td>
			<td>Chamber used for OGD induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5500</td>
			<td>5 mg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K-002</td>
			<td>87.5 mg/Kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium Eagle medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0268</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MAP2</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-74421</td>
			<td>1/500 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>warm up to 37 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin pastilles for histology</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1.07164</td>
			<td>Solidification point 56-58&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A 2213</td>
			<td>penicillin (12U/mL) /streptomycin (12&#181;g/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-GFAP</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td>1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S/4240/60</td>
			<td>2.2g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X1126</td>
			<td>12 mg/Kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a cell culture model for studying the role of neuron-glia interactions in ischemia

Ischemisk stroke är ett kliniskt tillstånd som kännetecknas av hypoperfusion av hjärnvävnad, vilket leder till syre och glukos deprivation, och den därav följande neuronal förlust. Många bevis tyder på att samspelet mellan stödjeceller och neuronala celler utöva positiva effekter efter en ischemisk händelse. Därför, att utforska potentiella skyddsmekanismer, Det är viktigt att utveckla modeller som gör det möjligt att studera neuron-glia interaktioner i en ischemisk miljö. Häri presenterar vi en enkel strategi för att isolera astrocyter och nervceller från råtta embryonala cortex, och att genom att använda specifika kultur media, möjliggör inrättandet av neuron- eller astrocyte-berikade kulturer eller neuron-glia kulturer med hög avkastning och reproducerbarhet.
För att studera överhörning mellan astrocyter och nervceller föreslår vi ett tillvägagångssätt baserat på ett samkultursystem där nervceller odlade i täckliner upprätthålls i kontakt med ett monolayer av astrocyter pläterade i multiwell plattor. De två kulturerna underhålls ifrån varandra av små paraffinsfärer. Detta tillvägagångssätt möjliggör oberoende manipulation och tillämpning av specifika behandlingar på varje celltyp, vilket utgör en fördel i många studier.
För att simulera vad som sker under en ischemisk stroke utsätts kulturerna för ett protokoll för syre- och glukosbrist. Detta protokoll representerar ett användbart verktyg för att studera rollen av neuron-glia interaktioner i ischemisk stroke.

För att karakterisera de kulturer, immuncytokemi för att bedöma antalet celler som uttryckt GFAP eller MAP2, allmänt använda markörer av astrocyter och nervceller (Figur 2), utfördes i varje typ av när kultur. Denna analys visade att astrocyteberikade kulturer presenterade 97% av de celler som uttrycker GFAP (Figur 2A). Angående den neuron-berikade kulturen 78% av cellerna uttryckta MAP2, 4% av cellerna uttryckt GFAP, och 18% av cellerna var både GFAP ...

Watch this Scientific Journal Video about A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia at JoVE.com

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Här presenterar vi ett enkelt tillvägagångssätt med hjälp av specifika kulturmedier som möjliggör inrättandet av neuron- och astrocyter-berikade kulturer, eller neuron-glia kulturer från den embryonala cortex, med hög avkastning och reproducerbarhet.

En cellkultur modell för att studera roll Neuron-Glia interaktioner i Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

Ischemisk stroke är ett kliniskt tillstånd som kännetecknas av hypoperfusion av hjärnvävnad och resulterar i neuronal förlust. Ett flertal belägg tyder på att samspelet mellan glia och urinalceller utövar tryckeffekterna efter en ischemisk händelse. För att utforska potentiella skyddsmekanismer, Det är viktigt att utveckla modeller som gör det möjligt att studera neuron-glia interaktioner i en ischemisk miljö.Här presenterar vi ett enkelt tillvägagångssätt för att isolera astrocyter och nervceller från råtta embryonala cortex, och att genom att använda specifika kulturella medium tillåter inrättandet av neuron eller astrocyte-berikade kulturer eller neo-glia kulturer med hög avkastning och reproducerbarhet. För att studera överhörning mellan astrocyter och nervceller föreslår vi ett tillvägagångssätt, baserat på ett samkultursystem, där nervceller odlade i täckslirningar upprätthålls i kontakt med en monolayer av astrocyter pläterade i fler-brunnsplattor. De två kulturerna underhålls en del av små paraffinsfärer.Detta tillvägagångssätt möjliggör oberoende manipulation och tillämpningen av specifik behandling på varje celltyp, vilket utgör en fördel i många studier. För att simulera vad som sker under en ischemisk stroke utsätts kulturerna för ett protokoll för syre- och glukosbrist. Detta protokoll representerar ett användbart verktyg för att studera rollen av neuron-glia interaktioner i ischemisk stroke.Börja med råtta embryonala cortex isolering. Embryona erhölls från en familj av råttor vid 15 dagars dräktighet och placeras i ett sterilt Falcon-rör som innehåller PBS. Fortfarande inuti äggulan påse embryon placeras inuti en petriskål som innehåller kalla PBS.Med hjälp av sax och pincett bryts gulesäcken, och embryot avlägsnas och placeras i en annan petriskål som innehåller kall PBS över en isförpackning. Det är nödvändigt att vara mycket försiktig när man bryter gulesäcken att inte skada embryot. Placera embryot under ett dissekerande mikroskop, försiktigt fixa embryot med hjälp av en twizzer.Det initiala snittet bör vara parallellt med cortex. Var försiktig så att djuret inte halshuggs. Hårbotten och avlägsnas försiktigt inte för att skada den kortikala hjärnvävnaden.Nästa snitt skiljer cortex. Ta bort de blodkärl som finns i vävnaden. Slutligen, med hjälp av en pipett, överföra kortikala vävnaden till en Falcon rör med PBS.Den enda cell suspension erhålls genom mekanisk rötning av den kortikala hjärnvävnaden med hjälp av tips med minskande diameter. Se till att vävnaden är väl homogeniserad Efter rötningen centrifugera materialet vid 400 Gs i tre minuter. Kassera supernatanten och återanvänd sedimentet i odlingsmedium, värms tidigare till 37 grader.Beräkna det totala antalet celler som förekommer i suspensionen med hjälp av en Neubauerkammare och bereder utspädningen för den adekvata celltätheten. Slutligen, utsäde cellerna i multi-well och inkubera i 37 grader. För att förbereda materialet för samkultursystemet, värm paraffin i ett värmeblock tills det blir flytande.Sedan, med hjälp av ett stereoglas Pasteur pipetten förbereda små sfärer över locket glider som tidigare placerades i en multi-well, och belagda med Poly-D-Lysine. 24 timmar, för de två kulturerna kommas med i kontakt, ändring kulturmedel av nervceller och astrocytes att komplettera det NBM med eller utan värme inaktiverade FBS. När de två kulturerna är redo att använda, överföra neuron, sittande i locket glider med paraffin sfärer till brunnar som innehåller astrocyter med hjälp av en pincett tidigare nedsänkt i 70%etanol.Efter att ha placerat båda celltyperna i kontakt, vänta åtta till 12 timmar och sedan starta de olika stimuli och förfaranden. Syret och glukosbristen utförs i en kultur med sju dagars tillväxt. Ta bort odlingsmediet, och tvätta cellerna två gånger med HBSS-medium utan glukostillskott.Var säker på att allt medium som innehåller glukos tvättas. Försegla Hypoxikammaren och tillsätt gasmixen som innehåller 95%kväve och 5%koldioxid i fyra minuter med ett flöde på 20 liter i minuter för att ersätta syret som finns inne i kammaren. Sedan, stoppa flödet och placera Hypoxikammaren i en inkubator på 37 grader.Efter perioden av syre och glukos deprivation, ersätta mediet, HBSS utan glukos tillskott med lämplig odlingsmedium för de återstående förfarandena och inkubera cellerna på 37 grader. För att karakterisera typ av när kultur, utförde vi immunohistokemi i de tre typerna av när kulturer för att bedöma antalet celler som uttryckt GFPA eller MAP2, som är markörer som används allmänt för astrocytic och neuronal celler respektive. Dessa analyser visade att när detta protokoll, kunde vi få en ren berikad kultur av astrocyter med cirka 97%av cellerna uttrycker GFAP.Angående den neuron-berikade kulturen verifierade vi cirka 78%av cellerna som uttrycker MAP2. Men vi identifierar cirka 18%av GFAP och MAP2 negativa celler. För den neuron-glia kortikala kulturen, Det observerades att cirka 49%av cellerna är MAP2 positiva.31%är GFAP positiva. Och 20% de är inte ansvariga för GFAP eller MAP2. Sju dagar efter den kortikala kulturen etablering, neuron-glia kultur och neuron-berikade kulturen utsattes för en OGD förfarande för 4 och 6 timmar.Efter detta förfarande var celler märkt med MAP2 och sedan antalet MAP2 positiva celler kvantifierades med hjälp av fluorescens mikroskopi. I neuron-glia kultur, Det observerades en minskning av cirka 30%i antalet av de nervceller, när kulturen lämnades till en OGD period av 4 timmar. Efter en OGD period av 6 timmar, förlängningen av lesion ökar, nå omkring 60%av neuronal förlust.Angående den berikade kulturen av nervceller som exponerats för OGD, observerades det om 41%och 64%minskning av antalet MAP2 celler. Dessutom observerades att i den neuron-berikade kulturen, det fanns en liten ökning av skadan förlängningen när jämfört med neuron-glia kultur också utsätts för OGD under 4 timmar. Sammanfattningsvis, här representerar en in vitro-modell för att studera ischemisk stroke etablerade i en enkel, snabb och dyr och reproducerbart sätt.Dessutom, den beskrivna metoden gör det också möjligt att genomföra nervceller och astrocyter-berikade primära kulturer, men också en neuron-glia kultur. Således, ger en stor in-vitro-modell för modellering flera hjärnsjukdomar med en högre nivå av komplexitet, än förevigade cellinjer och ren neuronala eller gliakulturer kulturer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Procedure for Studying the Footshock-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking in Laboratory Rats

Ett förfarande för att studera de Footshock-Induced Återinför av kokain söker i laboratorieråttor

The most insidious aspect of drug addiction is the high propensity for relapse.  Animal models of relapse, known as reinstatement procedures, have been ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

Isolering och odling av neurallistceller från embryonala Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metoder för att studera verkningsmekanismerna för antipsykotiska läkemedel i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Induktion Plasticitet hos astrocytiska Receptorer genom manipulering av neuron priser

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Adult Mouse Muskel-nerv Förberedelse för Studera Förbränningsegenskaper för Muscle afferenter

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live avbildning av nikotin inducerad kalciumsignalering och frisättning av signalsubstans Längs Ventral Hippocampus Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Med hjälp av kombinerade Metoder för att definiera rollen av plasmamembranet leverans under Axon förgrening och Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

De indirekta Neuron-astrocyternas Coculture analys: En<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up för detaljerad undersökning av Neuron-Glia interaktioner

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Den optiska fraktioneringstekniken för att beräkna cellnummer i en råttmodell för elektrokonvulsiv terapi

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...