Name: skeletal phenotype analysis of a conditional stat3 deletion mouse model
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00
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Ringraziamo il Prof. Weiguo Zou e S. Kato per reagenti e topi e i membri del laboratorio Zou per utili discussioni. Ringraziamo anche il Laboratorio per la Stomatologia Digitalizzata e il Centro di Ricerca per le Anomalie Craniofacciali del Nono Ospedale Popolare di Shanghai per l'assistenza. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, il fondo SHIPM-mu dello Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], il Progetto incentive del team di innovazione di alto livello per la Shanghai Jiao Tong University School of Medicine , il Fondo di ricerca interdisciplinare del nono ospedale popolare di Shanghai, Shanghai JiaoTong University School of Medicine [JYJC201902]. E L.J. è uno studioso dell'Outstanding Youth Medical Talents, del programma di sviluppo giovanile "Rising Stars of Medical Talent" di Shanghai e del progetto "Chen Xing" della Shanghai Jiaotong University.

Tutti i metodi relativi agli animali qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
1. Allevamento di topi di cancellazione Stat3 specifici dell'osteoclasta
NOTA: I topi Stat3fl/fl sono stati ottenuti commercialmente. I topi Ctsk-Cre sono stati forniti da S. Kato (Università di Tokyo, Tokyo, Giappone12</s...

<ol>
	<li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+remodeling+in+health+and+disease.">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures.">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li><li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Practice.+Postmenopausal+Osteoporosis.">Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis.</a> New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).</li><li>Kos, C. 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K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cre-LoxP+system:+general+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes.">Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).</li><li>Minkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+acid+phosphatase:+tartrate-resistant+acid+phosphatase+as+a+marker+of+osteoclast+function.">Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function.</a> Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).</li><li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts.">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li><li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts.">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li><li>Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naphthol-ASBI+phosphate+as+a+preferred+substrate+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b.">Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).</li><li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations.">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li><li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin.">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li><li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity.">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li><li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats.">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li><li>Tambutt&#233;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein+labelling+and+electrophysiology:+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification.">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation.">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR/Raptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression.">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts.">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14 (2018).</li></ol>

I modelli di topi geneticamente modificati sono comunemente utilizzati per studiare il meccanismo e il trattamento farmaceutico della malattiaumana 13. I topi Ctsk-Cre sono stati ampiamente utilizzati per studi funzionali di osteoclasti6. Il presente studio ha descritto i protocolli dei metodi per analizzare il fenotipo scheletrico e studiare i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo.
L'analisi istologica è il migli...

L'osso scheletrico è il principale organo portante del corpo umano ed è sotto pressione sia dall'ambiente interno che da quello esterno durante la camminata e l'eserciziofisico 1. Per tutta la vita, le ossa passano continuamente attraverso l'autori rinnovamento, che è bilanciato da osteoblasti e osteoclasti. Il processo di sgombero di osteoclasti che cancellano vecchie ossa e osteoblasti formando nuovo osso mantiene l'omeostasi e la funzione meccanica del sistemascheletrico 2. Il disturbo dell'equilibrio può indurre malattie metaboliche ossee, come l'osteoporosi. L'osteoporosi, causata dall'eccesso di attività osteoclastica, è prevalente a livello globale e causa notevoli perdite economichealla società 2,3,4. In base al numero limitato di farmaci disponibili per il trattamento dell'osteoporosi e al loro rischio di effettiavversi 4, è importante svelare i dettagli della formazione e dell'attività dell'osteoclasta.
Gli osteoclasti derivati dal lignaggio ematopoietico monocito/macrofago hanno nuclei multipli (possono avere da 2 a 50 nuclei) e sono grandi (di solito superiori a 100 μm di diametro)2. Sebbene l'esplorazione dei meccanismi e lo screening dei farmaci per i disturbi osteoclastici siano stati ampiamente migliorati attraverso la coltura osteoclasta in vitro, le complicate reazioni organiche rendono le prove in vivo indispensabili per la terapia mirata. A causa delle somiglianze genetiche e fisiopatofiche tra topi e esseri umani, i modelli di topi geneticamente modificati sono comunemente utilizzati per studiare i meccanismi e i trattamenti farmaceutici delle malattie umane in vivo6. Il sistema Cre-loxP è una tecnologia ampiamente utilizzata per l'editing genico del topo e ha permesso ai ricercatori di indagare le funzioni geniche in modo specifico per tessuti /cellule 5. La catepsina K (CSTK) è una proteasi cisteina secreta dagli osteoclasti che può degradare il collagene osseo8. È ben accettato che il CTSK sia espresso selettivamente negli osteoclasti maturi; pertanto, i topi Ctsk-Cre sono considerati uno strumento utile per studi funzionali sugli osteoclasti ed è stato utilizzato6.
Il trasduttore di segnale e attivatore della famiglia di trascrizione (STAT) è classico e altamente significativo nella progressione e nello sviluppo dell'immunità edel cancro 7,8. Tra sette STATISTICHE, STAT3 è segnalato per essere il più rilevante per l'omeostasi ossea9,10. Diversi studi in vivo hanno riportato che l'inattivazione specifica di STAT3 negli osteoblasti diminuisce la formazioneossea 9,10. Tuttavia, le prove solide riguardanti la partecipazione di STAT3 alla formazione di osteoclasti e al metabolismo osseo in vivo sono ancora limitate. Recentemente, abbiamo fornito prove in vivo con un modello di topo di cancellazione Stat3 specifico per osteoclasta(Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, di seguito chiamato Stat3Ctsk) che STAT3 partecipa alla differenziazione osteoclasta e al metabolismoosseo 11. Nel presente studio, descriviamo i metodi e i protocolli che abbiamo usato per analizzare i cambiamenti nella massa ossea, istomorfologia ossea e anabolismo osseo e catabolismo dei topi Stat3Ctsk al fine di studiare l'influenza della cancellazione STAT3 specifica dell'osteoclasta sull'omeostasi ossea.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>E672002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>80000360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-Cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeCa RapidlyDecalcifier</td>
			<td>Pro-Cure</td>
			<td>DX1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBED 812 RESIN</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Beyotime Biotechanology</td>
			<td>C0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-CT</td>
			<td>Scanco Medical AG</td>
			<td>&#956;CT 80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>10018918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>E675007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>A601889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stat3fl/fl mice</td>
			<td>GemPharmatech Co., Ltd</td>
			<td>D000527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAP staining kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

skeletal phenotype analysis of a conditional stat3 deletion mouse model

I modelli di topo transgenico sono potenti per comprendere i geni critici che controllano la differenziazione e l'attività dell'osteoclasta e per studiare i meccanismi e i trattamenti farmaceutici dell'osteoporosi. I topi Cathepsin K (Ctsk)-Cre sono stati ampiamente utilizzati per studi funzionali sugli osteoclasti. Il trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) è rilevante nell'omeostasi ossea, ma il suo ruolo negli osteoclasti in vivo rimane scarsamente definito. Per fornire la prova in vivo che STAT3 partecipa alla differenziazione dell'osteoclasta e al metabolismo osseo, abbiamo generato un modello di topo di cancellazione Stat3 specifico dell'osteoclasta(Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) e analizzato il suo fenotipo scheletrico. La scansione micro-CT e la ricostruzione 3D implicavano un aumento della massa ossea nei topi knockout condizionali. Colorazione H&E, colorazione doppia rossa di calceina e alizarina e colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) sono state eseguite per rilevare il metabolismo osseo. In breve, questo protocollo descrive alcuni metodi e tecniche canoniche per analizzare il fenotipo scheletrico e studiare i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo.

Utilizzando il presente protocollo, sono stati generati topi di cancellazione Stat3 specifici osteoclasti per studiare l'influenza della cancellazione di STAT3 sulla differenziazione dell'osteoclasta. I topi Stat3Ctsk e i loro compagni di cucciolata di tipo selvatico (WT) sono stati allevati e tenuti dopo il genotipizzazione. I macrofagi del midollo osseo sono stati isolati e coltivati in osteoclasti e la cancellazione di STAT3 nei topi Stat3Ctsk è stata...

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Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Questo protocollo descrive un metodo canonico per comprendere i geni critici che controllano l'attività osteoclasta in vivo. Questo metodo utilizza un modello di topo transgenico e alcune tecniche canoniche per analizzare il fenotipo scheletrico.

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