Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture at JoVE.com

Wij danken Virginie Ory, PhD voor nuttige discussies en advies over de aanpak van de 3D co-cultuur model. We danken Elizabeth Jones ook voor uitstekende technische bijstand bij de IHC-sectie. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) aan YL (LI 2547/4-1) en de National Institutes of Health to AW (R01 CA231291), naar ATR (R01 CA205632), naar GWP (R01 CA218670) en de Core Grant van het Cancer Center (P30 CA51008).

Een lijst en uitleg van enkele veelgebruikte woorden in het hele protocol is te vinden in aanvullend dossier 1.
1. Generatie van sferoïden
<ol><li>Bereid en autoclave 2% agarose in 1x PBS (bijvoorbeeld, 1 g agarose in 50 mL van 1x PBS) en autoclave 35- en 81-microwell rubbermallen. LET OP: Vermijd het gebruik van laag smeltende agarose voor het genereren van de agarose-afgietsjes voor IHC-verwerking.</li>
	<li>Bereid agarose afgietsert OPMERKING: 35 microwell gieters ...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+of+metastasis:+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities.">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models.">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).</li><li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture.">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li><li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

De hier gepresenteerde methode beschrijft 3D tumor sferoïde generatie, die co-cultuur met T-cellen, cel-gebaseerde functionele en moleculaire testen, evenals een verscheidenheid aan monitoring en analyse mogelijkheden met behulp van een enkel apparaat. Het grote voordeel van onze aanpak is dat het niet vereist overdracht van de 3D-cultuur naar een aparte test en handhaaft de integriteit van de 3D-cultuur in de hele test.
De hier gepresenteerde workflow kan naar behoefte worden gewijzigd. De i...

Ondanks aanzienlijke verbeteringen in kanker immunotherapie in het afgelopen decennium, onze mechanistische begrip van gevoeligheid en weerstand tegen behandelingen zijn nog steeds vrij slecht1. Het is algemeen vastgesteld dat tumoren een aanzienlijke heterogeniteit vertonen, en dat de dynamische interacties van de tumorcellen met hun micro-omgeving en met de immuuncellen, impact tumorceldood, invasief gedrag en reactie op behandelingen die immunotherapieomvatten 1,2,3. Als een arm van het adaptieve immuunsysteem, T-cellen uit te voeren cel-specifieke cytotoxiciteit. De analyse van T-celherkenning en respons op kankercellen biedt mechanistische inzichten in resistentie en gevoeligheid voor immuunmodulatorische behandelingen.
In vitro modellering en monitoring interacties tussen kanker en T-cellen in een geschikte omgeving is uitdagend en tot nu toe resulteerde in beperkte mechanistische inzichten. De meeste celgebaseerde tests zijn gebaseerd op een tweedimensionale (2D) omgeving, dat ontbreekt aan belangrijke kenmerken die van cruciaal belang zijn voor het samenvatten van de driedimensionale (3D) in vivo fysiologie4,5,6, namelijk ruimtelijke celcelinteracties, contact met de extracellulaire matrix (ECM)7, dynamische metabole vraag, verhoogde hypoxie als gevolg van massagroei8, en effecten van de tumormicro-omgeving (TME)9. Aan de andere kant zijn er nog een aantal tekortkomingen met de momenteel gebruikte driedimensionale (3D) co-cultuur en invasie testsystemen: (1) de tijdrovende aard van sferoïde generatie en oogst5,10, (2) het gebrek aan controle over de sferoïde grootte, vorm en celdichtheid11,12, (3) de test van het lage doorvoertype, (4) de eis voor speciale apparatuur13,14, (5) de noodzaak om de cocultuur voor verschillende testen 15 ,16,16,17in verschillende omgevingen over te brengen . Met name de overdracht van een co-cultuurtest leidt vaak tot verstoring van sferoïden en verlies van de integriteit van de co-cultuur. Dit geldt vooral voor "losse" sferoïden met verminderde cel-celhechting. De meeste 3D-invasietesten vereisen bijvoorbeeld dat sferoïden na hun eerste formatie worden geoogst en vervolgens opnieuw worden opgetrokken in ECM14,15,16. Deze resuspensiestap resulteert in een verlies van controle over de afstand tussen sferoïden. Aangezien de afstand tussen tumorsferoïden hun invasief gedrag beïnvloedt, introduceert dit verlies van controle hoge inter-assay variantie en vermindert de reproduceerbaarheid. Bovendien is de toepassing van celfrasectiontesten door opeenvolgende centrifugatiestappen voor de beoordeling van de perifere en tumorsferoïde infiltrerende immuuncellen beperkt tot tumorcelpopulaties die stabielere sferoïden genereren17.
Concept en aanpak
Onze aanpak richt zich op de bovengenoemde tekortkomingen met behulp van een "All-in-One"-3D sferoïde co-cultuur model, die niet vereist dat de overdracht van sferoïden voor latere tests. We hebben een sferoïde vormingsapparaat (zie Tabel van Materialen)aangepast om een test te genereren voor gelijktijdig monitorend invasief gedrag van kankercellen en cytotoxiciteit van co-gekweekte T-cellen. Deze methode is gebruiksvriendelijk, goedkoop en zorgt voor een snelle en eenvoudige bediening in een relatief hoge doorvoer 3D-instelling. Afhankelijk van het gebruikte type apparaat kunnen tot 81 grote sferoïden van uniforme grootte worden gegenereerd in één pipettingstap met controle over de individuele sferoïde grootte door het aantal ingezaaide cellen te wijzigen. Sferoïde vorming wordt gedwongen door verbeterde celcelinteracties in steigervrije agarose multi-well afgietsten met U-vormige bodems. We hebben dit 3D-systeem aangepast voor dynamische celgebaseerde functionele studies en endpoint moleculaire en biochemische tests die fluorescentie geactiveerde celsorden (FACS), immunofluorescentie (IF) of immunohistochemie (IHC) kleuring omvatten, evenals genexpressieanalyse van de intacte 3D co-cultuur.
Voor functionele studies, inbedden sferoïden in type I collageen binnen de agarose werpt resulteert in invasie van kankercellen van equidistant sferoïden en maakt het mogelijk monitoring van essentiële cellijn-specifieke kenmerken, zoals eencellige vs collectieve cel migratie18,19. Bovendien is de collageenmatrix gemakkelijk gescheiden van de agarose-cast, wat resulteert in een 1\u20122 mm dikke patch met meerdere sferoïden, die verder kan worden verwerkt voor IF-vlekken en beeldvorming door confocale microscopie. Dit kan onthullen verschillende celinvasie en cel-matrix interacties in een high-throughput screening. Ook kunnen cellen in de collageenmatrix worden geïsoleerd na de vertering van collageen en eencellige dissociatie voor latere celkweek of -analyse.
Voor IHC-analyse van sferoïdenzijn na fixatie en sectie van de agarose gegoten eiwitten of andere moleculen van belang detecteerbaar met behoud van de geografische posities van de sferoïden. In de hier beschreven aanpak, sferoïden zijn direct ingebed in Hydroxyethyl agarose processing gel binnen de agarose gegoten en de gel dient als een "deksel" om de sferoïden te behouden aan de onderkant van de microwells. Na paraffine inbedding van de agarose gegoten20, seriële horizontale sectie wordt uitgevoerd met de onderkant van de cast die als uitgangspunt.
Deze aanpak contrasteert met conventionele IHC-sectie van sferoïden die het oogsten van cellen vereist voordat ze inhydroenen worden genomen in Hydroxyethyl agarose processing gel21 en riskeert verstoring van sferoïden waardoor de ruimtelijke ordening van cellen verloren gaat. Ook celfractionering door centrifugatie voor het beoordelen of immuuncellen geïnfiltreerd of perifeer bleven tot tumorsferoïden17 wordt vermeden door directe inbedding.
Bovendien, 3D co-cultuur kan worden uitgevoerd door het mengen van tumor, stromale of immuuncellen, en dus het bestuderen van tumorcel crosstalk of het opnieuw vatten van verschillende tumor micro-omgevingen voor het analyseren van cel-cel interacties met inbegrip van co-culturen met endotheelcellen16.
Deze 3D sferoïde co-cultuur instelling kan worden gebruikt om co-cultuur van verschillende celtypes aanwezig in de tumor micro-omgeving uit te voeren en om de effecten van veranderde ECM-elementen te beoordelen. Naast type I collageen kunnen andere ECM-componenten (bijvoorbeeld matrigel, matrigel/collageenmengsels, fibronectine) worden gebruikt omdat tumorcelinvasie wordt beïnvloed door de overvloed aan verschillende substraten22. Ook zijn de microwells van de agarose gegoten geschikt voor sferoïde vorming van primaire cellijnen en voor cellen met een lage celcelhechting.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij de behandeling van kanker met immunotherapie, hoewel een groot aantal kankers resistent blijft tegen behandeling. Een beperkt aantal tests zorgen voor directe monitoring en mechanistische inzichten in de interacties tussen tumor- en immuuncellen, waaronder T-cellen een belangrijke rol spelen bij het uitvoeren van de cytotoxische reactie van het adaptieve immuunsysteem op kankercellen. De meeste tests zijn gebaseerd op tweedimensionale (2D) co-cultuur van cellen als gevolg van het relatieve gebruiksgemak, maar met beperkte vertegenwoordiging van de invasieve groei fenotype, een van de kenmerken van kankercellen. Huidige driedimensionale (3D) co-cultuur systemen vereisen ofwel speciale apparatuur of aparte monitoring voor invasie van co-gekweekte kankercellen en interactie T-cellen.
Hier beschrijven we een aanpak om tegelijkertijd het invasieve gedrag in 3D van kankercelsferoïden en T-celcytotoxiciteit in co-cultuur te monitoren. Sferoïde vorming wordt aangedreven door verbeterde celcelinteracties in steigervrije agarose microwell-afgietselt met U-vormige bodems. Zowel T-cel co-cultuur en kanker cel invasie in type I collageen matrix worden uitgevoerd binnen de microwells van de agarose werpt zonder de noodzaak om de cellen over te dragen, waardoor een intacte 3D co-cultuur systeem in de hele test. De collageenmatrix kan worden gescheiden van de agarose gegoten, waardoor immunofluorescentie (IF) kleuring en voor confocale beeldvorming van cellen. Ook kunnen cellen worden geïsoleerd voor verdere groei of worden onderworpen aan analyses zoals voor genexpressie of fluorescentie geactiveerde celsordening (FACS). Ten slotte kan de 3D co-cultuur worden geanalyseerd door immunohistochemie (IHC) na inbedding en sectie. Mogelijke wijzigingen van de test omvatten veranderde samenstellingen van de extracellulaire matrix (ECM) en de opname van verschillende stromale of immuuncellen met de kankercellen.

Het 3D co-cultuurmodel maakt verschillende tests mogelijk die in figuur 1Aworden weergegeven, die naar behoefte kunnen worden gecombineerd of gewijzigd. In onze gevestigde experimentele setup worden tumor- en T-cellen gedurende 2 dagen co-gekweekt, gevolgd door het initiëren van de invasietest voor selectie van invasieve en/of resistente tumorcellen(figuur 1B). Op dag 4 wordt de kwantificering van invasie uitgevoerd en worden "overlevende" cellen geïsoleerd va...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture at JoVE.com

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Deze methoden kunnen mechanistische inzichten bieden in immuuncelgemedieerde tumorcelcytotoxiciteit en invasief gedrag in een 3D-instelling. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat dit 3D sferoïde co-cultuur model niet de overdracht van sferoïden vereist voor meerdere latere essays. Het aantonen van deze procedure zal Apsra Nasir, een promovendus van onze afdeling.Voor het genereren van de sferoïden met behulp van aseptische techniek in een cel cultuur kap voeg 500 microliters van gesmolten agarose in een 81 microwell rubberen mal die zorg om bubbels te vermijden. Wanneer de agarose heeft gestold zorgvuldig flex de rubberen mal te pop uit de agarose werpt in individuele putten van een 12 put plaat. Om de afgietselen te equilibrate voeg 2,5 milliliter celkweekmedium toe, aangevuld met 10% foetaal runderserum in elke put en plaats de plaat gedurende een uur in een celkweek incubator.Aan het einde van de incubatie kantel de plaat om de cel cultuur medium te verwijderen in de omgeving eerst, dan in de zaaikamer en zorgvuldig zaad 190 microliters van de bereid om tumorcel suspensie dropwise in elke cel zaaien kamer. Na een incubatie van 15 minuten in de celkweek incubator toe te voegen op 2,5 milliliter medium aan de buitenkant van de cast en de plaat terug te keren naar de couveuse voor 48 uur. Het opzetten van een T-cel co-cultuur resuspend het juiste aantal T-cellen in 190 microliter van ongepaste T-celcultuur, medium per goed tot de 12 goed-plaat om verwijdering van de celcultuur medium rond de agarose cast eerste mogelijk te maken.Dan in de zaaikamer, zonder het verwijderen van de sferoïden gebruik maken van een lichtmicroscoop om te controleren of er sferoïden zijn aangezogen en het houden van de P200 geladen pipet ongeveer een halve centimeter boven elke cast zorgvuldig zaad van de T-cellen op de afgietsemt in een dropwise manier zonder los te maken van de sferoïden. Wanneer alle afgietselen zorgvuldig zijn teruggegeven de plaat naar de celkweek incubator voor 15 minuten voor het toevoegen van verse cel cultuur medium aangevuld met foetale runder serum aan de buitenkant van elke cast voor nog eens 48 uur incubatie. Om de 3D co-culturen in type één collageen te verdunnen boucollageen met serumvrije basismedium tot een uiteindelijke werkconcentratie van drie milligram per milliliter en voeg 11 microliter van 10X PBS toe, voeg 1,2 microliter van één molaire natriumhydroxide per 100 microliter collageen toe.Na het neutraliseren van de collageenoplossing op ijs gedurende een uur, verwijder de cel cultuur medium rondom en binnen elke cast zoals aangetoond. Voeg voorzichtig de geneutraliseerde collageen een mengsel aan elke cast in een dropwise mode, en onmiddellijk terug de plaat naar de cel cultuur incubator voor vijf minuten voor het omkeren van de plaat voor een extra een uur in de incubatie. Aan het einde van de incubatie plaats de plaat rechts omhoog in de bioveiligheidskap en voeg langzaam een vers celkweekmedium aan de zijkant van elke put toe.Breng de plaat vervolgens 48 uur terug naar de couveuse van de celcultuur. Voor immunofluorescente kleuring van de ingebedde 3D co-culturen fix elke hele agarose gegoten met inbegrip van de sferoïden in 5,4%formaline 's nachts bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. De volgende dag, verwijder de formaline rond de agarose gegoten en gebruik slanke tip pincet om de hoek van elk collageen matrix te grijpen om de afgietselt te worden geschild uit de zaaienkamers in een enkele vloeiende beweging.Plaats elk collageen patch in een enkele put van een acht goed kamer dia en voeg 250 microliter van 0,5% octoxynol allemaal aan elke put. Vervang na een uur bij kamertemperatuur de octoxynol door 250 microliter blokkeeroplossing. Voeg na een uur bij kamertemperatuur een 250 microliter van de primaire antilichaamcocktail van belang toe aan elke put en plaats een glijbaan 's nachts in een donkere bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.De volgende ochtend verwijder het primaire antilichaam uit elke put en was de putten drie keer met 300 microliter IF-buffer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur per wasbeurt. Voeg na de laatste wasbeurt een 250 microliter ongepaste secundaire antilichaamoplossing toe aan elke put gedurende een incubatie van een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Verwijder aan het einde van de incubatie het antilichaam en was elk monster drie keer met IF-buffer zoals aangetoond.Na de laatste wasspoeling spoelen de monsters met 300 microliter PBS per put en verwijder voorzichtig de wanden van de kamerplaat. Zodat alleen de glazen schuif aan de onderkant overblijft. Voeg 200 microliters van montagemedium toe aan de glazen schuif en laat de afdekking voorzichtig op het monster vallen zonder bellen te creëren en sla de gemonteerde monsters 's nachts op een donkere droge plaats op voordat beeldvorming door confocale fluorescentiemicroscopie Hier typische experimentele opstellingen voor de testen en ze leveren representatieve en analyseerbare monsters op aan het einde van het experiment voor elk protocol kan worden waargenomen.Het inbedden van de 3D-cultuur in type een collageen in de microputten van een agarose gegoten maakt monitoring en analyse van de invasie door beeld J.In deze analyse van twee primaire murine, alvleesklierkanker cellijnen verschillende sferoïde vormen en invasieve gedrag werden waargenomen. De eerste cel lijn één toonde een compactere sferoïde vorming en stekelige invasie aan gelijkend op die waargenomen voor één celinvasies. Terwijl de tweede cellijn sferoïden vormde die meer los waren en een collectief invasiepatroon demonstreerden.Co-cultuur kan worden uitgevoerd met twee verschillende tumor klonnale cellijnen gezaaid op hetzelfde moment of met tumor en T-cellen bij tumor sferoïde vorming of een volgende tumor T-cel interactie evaluaties. Voor een gedetailleerde beoordeling van het invasieve gedrag kunnen immunofluorescente kleuring en con focal imaging op een hoge doorvoermanier worden uitgevoerd. De agarose cast maakt het mogelijk om het hele 3D-kweeksysteem in paraffine in te bedden voor seriële secties en immunohistochemie kleuring om de ruimtelijke relatie tussen tumor en T-cellen te kwantificeren.Bijvoorbeeld, T-cel infiltratie kan worden geïdentificeerd en gekenmerkt door celoppervlak marker kleuring. Deze techniek maakt het mogelijk de analyse van patiënt monsters evenals het gebruik van stimulerende en blokkerende drugs om tumorcel T-cel interacties sonde.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Een Model voor perineurale invasie in hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Een Rapid Filter Insert-gebaseerde 3D Cultuur System for Primary Prostaat Cel Differentiatie

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Een protocol voor snelle post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsieke Pontine glioom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Therapie testen in een sferoïde gebaseerde 3D cel cultuur Model voor hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-cel Imaging tests studie Glioblastoma Brain Tumor stamcel migratie en invasie

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...