Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
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Wir danken Virginie Ory, PhD für hilfreiche Diskussionen und Ratschläge zum Ansatz des 3D-Cokulturmodells. Wir danken auch Elizabeth Jones für die ausgezeichnete technische Unterstützung bei der IHC-Sektion. Diese Studie wurde durch Stipendien der DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) an YL (LI 2547/4-1) und der National Institutes of Health to AW (R01 CA231291), ATR (R01 CA205632), GWP (R01 CA218670) und des Core Grant of the Cancer Center (P30 CA51008) unterstützt.

Eine Liste und Erläuterung einiger häufig verwendeter Wörter im gesamten Protokoll finden Sie in Der Zusatzdatei 1.
1. Erzeugung von Sphäroiden
<ol><li>Vorbereiten und Autoklaven 2% Agarose in 1x PBS (z.B. 1 g Agarose in 50 ml 1x PBS) und Autoklav 35- und 81-Mikrowell-Gummiformen. VORSICHT: Vermeiden Sie die Verwendung von niedrigschmelzender Agarose zur Erzeugung der Agarosegussteile für die IHC-Verarbeitung.</li>
	<li>Bereiten Agarose-Gussteile vor HINWEIS: 35-M...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

Die hier vorgestellte Methode beschreibt die 3D-Tumorsphäroid-Generierung, die eine Kokultur mit T-Zellen, zellbasierte funktionelle und molekulare Assays sowie eine Vielzahl von Überwachungs- und Analysemöglichkeiten mit einem einzigen Gerät ermöglicht. Der hauptvorteil unseres Ansatzes besteht darin, dass er keine Übertragung der 3D-Kultur auf einen separaten Assay erfordert und die Integrität der 3D-Kultur während der gesamten Assays aufrechterhält.
Der hier vorgestellte Workflow k...

Trotz signifikanter Verbesserungen in der Krebsimmuntherapie in den letzten zehn Jahren ist unser mechanistisches Verständnis von Empfindlichkeit und Resistenz gegen Behandlungen immer noch ziemlich schlecht1. Es ist allgemein bekannt, dass Tumoren eine erhebliche Heterogenität aufweisen und dass die dynamischen Wechselwirkungen der Tumorzellen mit ihrer Mikroumgebung sowie mit den Immunzellen den Tod von Tumorzellen, das invasive Verhalten und die Reaktion auf Behandlungen beeinflussen, die immuntherapeutische1,2,3umfassen. Als ein Arm des adaptiven Immunsystems führen T-Zellen eine zellspezifische Zytotoxizität aus. Die Analyse der T-Zell-Erkennung und -Reaktion auf Krebszellen liefert mechanistische Einblicke in Resistenz und Empfindlichkeit gegenüber immunmodulatorischen Behandlungen.
Die In-vitro-Modellierung und Überwachung von Wechselwirkungen zwischen Krebs und T-Zellen in einer geeigneten Umgebung war eine Herausforderung und führte bisher zu begrenzten mechanistischen Erkenntnissen. Die meisten zellbasierten Assays basieren auf einer zweidimensionalen (2D) Umgebung, der es an Schlüsselmerkmalen mangelt, die für die Rekapitulation der dreidimensionalen (3D) in vivo Physiologie4,5,6, nämlich räumlichezell-zell-Interaktionen, Kontakt mit der extrazellulären Matrix (ECM)7, dynamischer metabolischer Nachfrage, erhöhter Hypoxie aufgrund des Massenwachstums8, und Auswirkungen der Tumormikroumgebung (TME)9sind. Auf der anderen Seite gibt es immer noch eine Reihe von Mängeln mit den derzeit verwendeten dreidimensionalen (3D) Kokultur- und Invasions-Assay-Systemen: (1) die zeitaufwändige Natur der Sphäroiderzeugung und -ernte5,10, (2) die fehlende Kontrolle über die Sphäroidgröße, Form und Zelldichte11,12, (3) die Low-Throughput-Typ-Assays, (4) die Anforderung für spezielle Ausrüstung13,14, (5) die Notwendigkeit, die Co-Kultur in verschiedene Umgebungen für verschiedene Assays übertragen15,16,17. Insbesondere die Übertragung eines Co-Kultur-Assays führt oft zu einer Störung der Sphäroide und zum Verlust der Integrität der Kokultur. Dies gilt insbesondere für "lockere" Sphäroide mit reduzierter Zellzellhaftung. Zum Beispiel erfordern die meisten 3D-Invasionstests, dass Sphäroide nach ihrer Erstausbildung geerntet und dann in ECM14,,15,16wieder ausgesetzt werden. Dieser Resuspensionsschritt führt zu einem Verlust der Kontrolle über den Abstand zwischen Sphäroiden. Da die Entfernung zwischen Tumorsphäroiden ihr invasives Verhalten beeinflusst, führt dieser Kontrollverlust zu einer hohen Inter-Assay-Varianz und reduziert die Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus ist die Anwendung von Zellfraktionierungstests durch aufeinander folgende Zentrifugationsschritte zur Beurteilung der peripheren und Tumorsphäroid-infiltrierenden Immunzellen auf Tumorzellpopulationen beschränkt, die stabilere Sphäroiden erzeugen17.
Konzept und Ansatz
Unser Ansatz behebt die oben genannten Mängel mit einem "All-in-One"-3D-Sphäroid-Cokulturmodell, das die Übertragung von Sphäroiden für nachfolgende Assays nicht erfordert. Wir haben ein Sphäroid-Bildungsgerät (siehe Tabelle der Materialien) angepasst, um einen Assay zur gleichzeitigen Überwachung des invasiven Verhaltens von Krebszellen und der Zytotoxizität von ko-kultivierten T-Zellen zu generieren. Diese Methode ist benutzerfreundlich, kostengünstig und ermöglicht eine schnelle und einfache Handhabung in einer relativ hohen 3D-Einstellung. Je nach Art der verwendeten Vorrichtung können bis zu 81 große sphärische Sphäroide in einem einzigen Pipettierschritt mit Kontrolle über die individuelle Sphäroidgröße erzeugt werden, indem die Anzahl der ausgesäten Zellen geändert wird. Die Sphäroidbildung wird durch verbesserte Zell-Zell-Wechselwirkungen in gerüstfreien Agarose-Multi-Well-Gussteilen mit U-förmigen Böden erzwungen. Wir haben dieses 3D-System für dynamische zellbasierte Funktionsstudien sowie Endpunktmolekular- und biochemische Assays adaptiert, die fluoreszisaktivierte Zellsortierung (FACS), Immunfluoreszenz (IF) oder Immunhistochemie (IHC) Färbe sowie Genexpressionsanalyse der intakten 3D-Kokultur umfassen.
Für funktionelle Studienführt das Einbetten von Sphäroiden in Kollagen Typ I in die Agarose-Abgüsse zur Invasion von Krebszellen aus äquidistanten Sphäroiden und ermöglicht die Überwachung wesentlicher zelllinienspezifischer Merkmale, wie Z. I. kollektive Zellmigration18,19. Darüber hinaus lässt sich die Kollagenmatrix leicht vom Agaroseguss trennen, was zu einem 1,2222 mm dicken Pflaster mit mehreren Sphäroiden führt, das durch konfokale Mikroskopie für IF-Färbung und Bildgebung weiterverarbeitet werden kann. Dies kann deutliche Zellinvasion und Zell-Matrix-Wechselwirkungen in einem High-Throughput-Screening offenbaren. Auch Zellen in der Kollagenmatrix können nach Kollagenverdauung und Einzelzelldissoziation für die nachfolgende Zellkultivierung oder -analyse isoliert werden.
Für die IHC-Analyse von Sphäroidensind nach Fixierung und Schnitt der Agarose-Gussteile Proteine oder andere Moleküle von Interesse nachweisbar, während die geographischen Positionen der Sphäroide erhalten bleiben. In dem hier beschriebenen Ansatz werden Sphäroide direkt in Hydroxyethyl-Agarorose-Verarbeitungsgel in den Agaroseguss eingebettet und das Gel dient als "Deckel", um die Sphäroide an der Unterseite der Mikrowells zu behalten. Nach der Paraffineinbettung der Agarose20wird eine serielle horizontale Schnitte mit der Unterseite des Gusses als Ausgangspunkt durchgeführt.
Dieser Ansatz steht im Gegensatz zu herkömmlichen IHC-Sektionen von Sphäroiden, die die Entnahme von Zellen vor der Einbettung in Hydroxyethyl-Agarose-Verarbeitungsgel21 erfordern und Gefahr läuft, Sphäroide zu stören, wodurch die räumliche Anordnung der Zellen verloren geht. Auch die Zellfraktionierung durch Zentrifugation zur Beurteilung, ob Immunzellen infiltriert oder peripher zu Tumorsphäroiden17 bleiben, wird durch direkte Einbettung vermieden.
Darüber hinaus kann die 3D-Kokultur durch Beimischung von Tumor-, Strom- oder Immunzellen durchgeführt werden und so Tumorzell-Übersprechen untersucht oder verschiedene Tumormikroumgebungen zur Analyse von Zell-Zell-Wechselwirkungen einschließlich Kokulturen mit Endothelzellen16rekapituliert.
Diese 3D-Sphäroid-Cokultur-Einstellung kann verwendet werden, um Co-Kultur verschiedener Zelltypen in der Tumormikroumgebung durchzuführen und die Auswirkungen veränderter ECM-Elemente zu bewerten. Neben Kollagen Typ I können auch andere ECM-Komponenten (z.B. Matrigel, Matrigel/Kollagen-Mischungen, Fibronectin) verwendet werden, da die Tumorzellinvasion durch die Fülle verschiedener Substrate beeinträchtigt wird22. Auch die Mikrobrunnen des Agarosegusses eignen sich für die Sphäroidbildung von Primärzelllinien und für Zellen mit geringer Zellzelladhäsion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

Bei der Behandlung von Krebs mit Immuntherapie wurden erhebliche Fortschritte erzielt, obwohl eine große Anzahl von Krebsarten weiterhin resistent gegen die Behandlung ist. Eine begrenzte Anzahl von Assays ermöglicht eine direkte Überwachung und mechanistische Einblicke in die Wechselwirkungen zwischen Tumor- und Immunzellen, unter denen T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Durchführung der zytotoxischen Reaktion des adaptiven Immunsystems auf Krebszellen spielen. Die meisten Assays basieren auf einer zweidimensionalen (2D) Kokultur von Zellen aufgrund der relativen Benutzerfreundlichkeit, aber mit begrenzter Darstellung des invasiven Wachstumsphänotyps, einem der Kennzeichen von Krebszellen. Aktuelle dreidimensionale (3D) Co-Kultursysteme erfordern entweder spezielle Ausrüstung oder separate Überwachung für die Invasion von ko-kultivierten Krebszellen und interagierenden T-Zellen.
Hier beschreiben wir einen Ansatz zur gleichzeitigen Überwachung des invasiven Verhaltens von Krebszellsphäroiden und T-Zell-Zytotoxizität in der Co-Kultur in 3D. Die Sphäroidbildung wird durch verbesserte Zell-Zell-Wechselwirkungen in gerüstfreien Agarose-Mikrowell-Gussteilen mit U-förmigen Böden angetrieben. Sowohl die T-Zell-Kokultur als auch die Krebszellinvasion in die Kollagenmatrix Typ I werden in den Mikrobrunnen der Agarose-Gussteile durchgeführt, ohne dass die Zellen übertragen werden müssen, wodurch ein intaktes 3D-Kokultursystem während des gesamten Assays erhalten bleibt. Die Kollagenmatrix kann von der Agarose-Umwandlung getrennt werden, was eine Immunfluoreszenz (IF) Färbung und eine konfokale Bildgebung von Zellen ermöglicht. Außerdem können Zellen für weiteres Wachstum isoliert oder Analysen wie Genexpression oder Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) unterzogen werden. Schließlich kann die 3D-Kokultur durch Immunhistochemie (IHC) nach Einbettung und Schnitt analysiert werden. Mögliche Modifikationen des Assays sind veränderte Zusammensetzungen der extrazellulären Matrix (ECM) sowie die Einbeziehung verschiedener stromaler oder Immunzellen in die Krebszellen.

Das 3D-Cokulturmodell ermöglicht verschiedene Assays, die in Abbildung 1Adargestellt sind und bei Bedarf kombiniert oder geändert werden können. In unserem etablierten Versuchsaufbau werden Tumor- und T-Zellen für 2 Tage ko-kultiviert, gefolgt von der Einleitung des Invasions-Assays zur Auswahl invasiver und/oder resistenter Tumorzellen (Abbildung 1B). Am 4. Tag wird die Quantifizierung der Invasion durchgeführt und "Überlebende" Zellen werden aus der Koll...

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Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Der vorgestellte Ansatz bewertet gleichzeitig die Krebszellinvasion in 3D-Sphäroid-Assays und t-Zell-Zytotoxizität. Sphäroide werden in einem gerüstfreien Agarose-Multi-Mikrowell-Guss erzeugt. Co-Kultur und Einbettung in Typ I Kollagenmatrix werden innerhalb des gleichen Geräts durchgeführt, das Krebszellinvasion und T-Zell vermittelte Zytotoxizität zu überwachen ermöglicht.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Diese Methoden können mechanistische Einblicke in immunzellvermittelte Tumorzellzytotoxizität und invasives Verhalten in einer 3D-Einstellung liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass dieses 3D-Sphäroid-Cokulturmodell nicht die Übertragung von Sphäroiden für mehrere nachfolgende Essays erfordert. Demonstriert dieses Verfahren wird Apsra Nasir, eine Doktorandin aus unserer Abteilung.Um die Sphäroide mit aseptischer Technik in einer Zellkulturhaube zu erzeugen, fügen Sie 500 Mikroliter geschmolzener Agarose in eine 81 Mikrowell-Gummiform ein, die darauf achtet, Blasen zu vermeiden. Wenn die Agarose gefestigt hat, beugen Sie vorsichtig die Gummiform, um die Agarosegussteile in einzelne Brunnen einer 12-Well-Platte herauszuspringen. Um die Abgüsse zu equilibrate fügen 2,5 Milliliter ZellkulturMedium mit 10% fetalem Rinderserum in jeden Brunnen ergänzt und legen Sie die Platte in einen Zellkultur-Inkubator für eine Stunde.Am Ende der Inkubation kippen Sie die Platte, um zuerst das Zellkulturmedium in der Umgebung zu entfernen, dann in der Säkammer und säen sie vorsichtig 190 Mikroliter der vorbereiteten Tumorzellsuspension tropfenweise in jede Zellsäkammer. Nach einer 15-minütigen Inkubation im Zellkultur-Inkubator mit 2,5 Millilitern Medium an die Außenseite des Gusses geben und die Platte für 48 Stunden an den Inkubator zurückgeben. Um eine T-Zell-Kokultur einzurichten, setzen Sie die entsprechende Anzahl von T-Zellen in 190 Mikroliter nder ungeeigneter T-Zell-Kultur wieder auf, Medium pro Brunnen bis zur 12 Well-Platte, um die Entfernung des Zellkulturmediums um die Agarose zuerst zu ermöglichen.Dann in der Säkammer, ohne die Sphäroide zu entfernen, verwenden Sie ein Lichtmikroskop, um zu überprüfen, ob Sphäroide angesaugt wurden und halten Sie die P200 geladene Pipette etwa einen halben Zentimeter über jedem Guss sorgfältig säen die T-Zellen auf die Gussteile in einer tropfenweise Weise, ohne die Sphäroide zu vertreiben. Wenn alle Abgüsse ausgesät wurden, gab die Platte sorgfältig an den Zellkultur-Inkubator für 15 Minuten zurück, bevor sie frisches Zellkulturmedium hinzufügte, das mit fetalem Rinderserum an der Außenseite jedes Gusses für eine weitere 48-stündige Inkubation ergänzt wurde. Um die 3D-Kokulturen in Typ eins Kollagen verdünnt Eskollagen mit serumfreiem Basismedium auf eine endgültige Arbeitskonzentration von drei Milligramm pro Milliliter einzubetten und 11 Mikroliter 10X PBS hinzuzufügen, fügen Sie 1,2 Mikroliter eines Molaren-Natriumhydroxids pro 100 Mikroliter Kollagen hinzu.Nach der Neutralisierung der Kollagenlösung auf Eis für eine Stunde, entfernen Sie die Zellkultur Medium umgeben und in jedem Guss wie gezeigt. Fügen Sie das neutralisierte Kollagen vorsichtig tropfenweise zu jedem Guss hinzu und geben Sie die Platte sofort für fünf Minuten an den Zellkultur-Inkubator zurück, bevor Sie die Platte für eine weitere Stunde in der Inkubation umkehren. Am Ende der Inkubation die Platte rechts oben in die Biosicherheitshaube legen und langsam ein frisches Zellkulturmedium an der Seite jedes Brunnens hinzufügen.Dann geben Sie die Platte für 48 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurück. Für die immunfluoreszierende Färbung der eingebetteten 3D-Kokulturen fixieren Sie jeden gesamten Agaroseguss einschließlich der Sphäroide in 5,4% formalin über Nacht bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer. Am nächsten Tag entfernen Sie das Formalin, das den Agaroseguss umgibt, und verwenden Sie eine schlanke Spitzenpinzette, um die Ecke jeder Kollagenmatrix zu erfassen, damit die Gussteile in einer einzigen Flüssigkeitsbewegung aus den Säkammern geschält werden können.Legen Sie jedes Kollagen-Patch in einen einzigen Brunnen einer acht Wellkammerrutsche und fügen Sie 250 Mikroliter 0,5%Octoxynol alle zu jedem Brunnen hinzu. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur das Octoxynol durch 250 Mikroliter Blockierlösung ersetzen. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur 250 Mikroliter des primären Antikörpercocktails hinzufügen, der für jeden Brunnen von Interesse ist, und eine Rutsche über Nacht bei Raumtemperatur in eine dunkle befeuchtete Kammer legen.Am nächsten Morgen den primären Antikörper aus jedem Brunnen entfernen und die Brunnen dreimal mit 300 MikroliterIF-Puffer für fünf Minuten bei Raumtemperatur pro Waschgang waschen. Nach der letzten Wäsche, fügen Sie eine 250 Mikroliter unangemessene sekundäre Antikörperlösung zu jedem Brunnen für eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation den Antikörper entfernen und jede Probe dreimal mit IF-Puffer waschen, wie gezeigt.Nach dem letzten Waschen spülen Sie die Proben mit 300 Mikroliter PBS pro Brunnen und entfernen Sie vorsichtig die Wände der Kammerrutsche. Damit nur noch die Glasrutsche unten bleibt. Fügen Sie 200 Mikroliter Montagemedium auf die Glasrutsche und vorsichtig fallen die Abdeckung Slip auf die Probe, ohne Blasen zu schaffen dann speichern Sie die montierten Proben an einem dunklen trockenen Ort über Nacht vor der Bildgebung durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie Hier typische experimentelle Setups für die Assays und sie ergeben repräsentative und analyzierbare Proben am Ende des Experiments für jedes Protokoll beobachtet werden.Die Einbettung der 3D-Kultur in Typ-eins-Kollagen in die Mikrobrunnen eines Agarose-Gusses ermöglicht die Überwachung und Analyse der Invasion durch Bild J.In diese Analyse von zwei primären murinen, Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien verschiedene Sphäroidformen und invasive Verhaltensweisen beobachtet wurden. Die erste Zelllinie zeigte eine kompaktere Sphäroidbildung und stachelige Invasion ähnlich der bei Einzelzellinvasionen beobachteten. Während die zweite Zelllinie Sphäroide bildete, die lockerer waren und ein kollektives Invasionsmuster zeigten.Die Co-Kultur kann mit zwei verschiedenen tumorklonalen Zelllinien durchgeführt werden, die gleichzeitig gesät werden, oder mit Tumor- und T-Zellen bei Tumorsphäroidbildung oder einer anschließenden Tumor-T-Zell-Interaktionsauswertung. Für eine detaillierte Beurteilung des invasiven Verhaltens können immunfluoreszierende Färbungen und konfokale Bildgebung in hoher Durchsatzweise durchgeführt werden. Der Agaroseguss ermöglicht die Einbettung des gesamten 3D-Kultursystems in Paraffin für serielle Schnitte und immunhistochemische Färbung, um die räumliche Beziehung zwischen Tumor und T-Zellen zu quantifizieren.Beispielsweise kann die T-Zell-Infiltration identifiziert und durch Zelloberflächenmarkerfärbung charakterisiert werden. Diese Technik ermöglicht die Analyse von Patientenproben sowie die Verwendung von stimulierenden und blockierenden Medikamenten zur Untersuchung von Tumorzell-T-Zell-Wechselwirkungen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

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Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

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Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

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The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

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In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...