Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture at JoVE.com

אנו מודים לוירג'יני אורי, PhD על דיונים מועילים וייעוץ על הגישה של מודל 3D שיתוף תרבות. אנו מודים גם לאליזבת ג'ונס על סיוע טכני מצוין עם המחלקה IHC. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מDFG (דויטשה Forschungsgemeinschaft) כדי YL (LI 2547/4-1) ואת המכונים הלאומיים לבריאות AW (R01 CA23 1291), ל-ATR (R01 CA205632), ל-GWP (R01 CA218670) ולמענק הליבה של המרכז לסרטן (P30 CA51008).

רשימה והסבר של כמה מילים הנמצאות בשימוש תכוף לאורך הפרוטוקול ניתן למצוא בקובץ משלים 1.
1. דור של כדוריות
<ol><li>הכנה ו autoclave 2% agarose ב 1x PBS (למשל, 1 גרם agarose ב 50 מ"ל של 1x PBS) ו autoclave 35- ו 81 מיקרווול גומי תבניות. התראה: הימנע משימוש באגהרוז עם התכה נמוכה ליצירת יצוק agarose לעיבוד IHC...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+of+metastasis:+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities.">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models.">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).</li><li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture.">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li><li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

השיטה המוצגת כאן מתארת דור ספרואידי גידול 3D, המאפשר שיתוף תרבות עם תאי T, תאים מבוססי פונקציונליות ומולקולריים, כמו גם מגוון רחב של אפשרויות ניטור וניתוח באמצעות מכשיר יחיד. היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שהיא אינה מחייבת העברת תרבות תלת-מימד לתסה נפרדת ושומרת על שלמות תרבות ה-3D לאורך כל ה?...

למרות שיפורים משמעותיים אימונותרפיה סרטן בעשור האחרון, ההבנה המכנית שלנו של רגישות והתנגדות לטיפולים הם עדיין עניים למדי1. זה מבוסס היטב כי גידולים להציג הטרוגניות משמעותית, כי האינטראקציות הדינמיות של התאים הסרטניים עם microenvironment שלהם, כמו גם עם התאים החיסוניים, השפעה על מוות תאי הגידול, התנהגות פולשנית ותגובה לטיפולים הכוללים אימונותרפיה1,,2,,3. כזרוע אחת של המערכת החיסונית הסתגלנית, תאי T מבצעים ציטוקסיות ספציפית לתא. הניתוח של זיהוי T-תא ותגובה לתאים סרטניים מספק תובנות מכניות להתנגדות ורגישות לטיפולים אפנון חיסוני.
במבחנה מידול וניטור אינטראקציות בין סרטן ותאי T בסביבה המתאימה היה מאתגר ועד כה, הביא תובנות מכניות מוגבלות. רוב ההתאסות המבוססות על תאים מסתמכות על סביבה דו-ממדית (דו-ממדית), כי חסר תכונות מפתח כי הם קריטיים עבור סיכום תלת מימדי (3D) בפיזיולוגיה vivo4,5,6,כל כךאינטראקציות תא מרחבי, מגע עם מטריצה חוץ תאית (ECM)7, ביקושחילוף חומרים דינמי, היפוקסיהמוגברת בשל צמיחה המונית 8, והשפעות של microenvironment הגידול (TME)9. מצד שני, יש עדיין מספר חסרונות עם כיום בשימוש תלת מימדי (3D) שיתוף תרבות ומערכות אסה פלישה: (1) את הזמן גוזל אופי של דורספרואידים וקציר 5,10, (2) חוסר שליטה על גודל spheroid,צפיפות צורה ותא 11,12, (3) סוג תפוקה נמוכה תפוקה אומר, (4) הדרישה עבורציוד מיוחד 13,14, (5) הצורך להעביר את התרבות ההתוכית לסביבותנפרדות עבור 15, 16,16,17. בפרט, העברת תרבות שיתוף סד לעתים קרובות מוביל לשיבוש של spheroids ואובדן שלמות התרבות ההתופת. זה חל במיוחד על ספרואידים "רופפים" עם הדבקה מופחתת תא. לדוגמה, רוב המקרים של פלישה תלת-מית'ר דורשים שספרואידים נקצרים לאחר היווצרותם הראשונית ולאחר מכן יתפרסו מחדש ב- ECM14,15,16. שלב זה של התחדשות פעולה כתוצאה מאובדן שליטה על המרחק בין spheroids. מאז המרחק בין spheroids הגידול משפיע על ההתנהגות הפולשנית שלהם, אובדן זה של שליטה מציג סטייה בין-אסראי גבוהה ומפחית את הרבייה. יתר על כן, היישום של שברים תאים אומר על ידי צעדי צנטריפוגציה עוקבים להערכת היקפית וגודול spheroid חדירה תאים חיסוניים מוגבלת לאוכלוסיות תאים סרטניים המייצרים spheroidsיציב יותר 17.
קונספט וגישה
הגישה שלנו מטפלת בליקויים הנ"ל באמצעות מודל "All-in-One" – מודל תרבות שיתופית של ספרואיד תלת-מימד, שאינו דורש העברת ספרואידים עבור האמורות הבאות. התאמנו מכשיר היווצרות spheroid (ראה טבלת חומרים)כדי ליצור תס"א לניטור בו זמנית התנהגות פולשנית של תאים סרטניים וcytotoxicity של תאי T תרבויות. שיטה זו ידידותית למשתמש, זולה ומאפשרת טיפול מהיר וקל בהגדרה תלת-מית-מית-מית-תפוקה גבוהה יחסית. בהתאם לסוג ההתקן המשמש, ניתן ליצור עד 81 כדורי spheroid גדולים בגודל אחיד בשלב pipetting יחיד עם שליטה על גודל spheroid בודד על ידי שינוי מספר התאים שנזרעו. היווצרות ספרואיד נכפתה על ידי אינטראקציות משופרות תא-תא בפיגומים ללא agarose יצוק מרובה היטב עם תחתיות בצורת U. התאמנו את מערכת תלת-מיD זו עבור מחקרים פונקציונליים דינמיים מבוססי תאים, כמו גם נקודות קצה מולקולרי וביוכימי ים הכוללים פלואורסצנציה מופעל תא מיון (FACS), immunofluorescence (IF) או אימונוהיסטוכימיה (IHC) הכתמה, כמו גם ניתוח ביטוי גנים של התרבות השותפות 3D שלם.
עבור מחקריםפונקציונליים , הטבעת spheroids בסוג אני קולגן בתוך agarose מטיל תוצאות פלישה של תאים סרטניים מspheroids equidistant ומאפשר ניטור תכונות חיוניות קו תאים ספציפיים, כגון תא יחיד לעומת הגירה תא קולקטיבי18,,19. יתר על כן, מטריצת קולגן מופרדת בקלות מן יצוק agarose, וכתוצאה מכך תיקון עבה 1\u20122 מ"מ המכיל spheroids מרובים, אשר ניתן לעבד עוד יותר עבור IF-כתמים והדמיה על ידי מיקרוסקופית confocal. זה יכול לחשוף פלישה תאים ברורים ואינטראקציות מטריצת תא בהקרנה בתפוקה גבוהה. כמו כן, תאים במטריצת הקולגן ניתן לבודד לאחר עיכול קולגן ותנתק תא יחיד עבור טיפוח תאים הבאים או ניתוח.
לניתוח IHC של spheroids, לאחר קיבעון וקטוס של יצוק agarose, חלבונים או מולקולות אחרות של עניין ניתנים לזיהוי תוך שמירה על העמדות הגיאוגרפיות של spheroids. בגישה המתוארת כאן, spheroids מוטבעים ישירות Hydroxyethyl agarose עיבוד ג'ל בתוך יצוק agarose ואת הג'ל משמש "מכסה" כדי לשמור על spheroids בתחתית microwells. לאחר הטמימת הפרפין של יציקת agarose20, קטע אופקי סדרתי מבוצע עם החלק התחתון של הגבס משמש כנקודת ההתחלה.
גישה זו מנוגדת לניתוח IHC קונבנציונלי של spheroids הדורש קצירת תאים לפני הטבעה בג'ל עיבוד הידרוקסיאתיל agarose21 וסיכונים הפרעה של spheroids ובכך לאבד את הסידור המרחבי של תאים. כמו כן, שברת תאים על ידי צנטריפוגציה להערכה אם תאים חיסוניים חדרו או נשארו היקפיים לספרואידיםגידול 17 נמנע על ידי הטבעה ישירה.
יתר על כן, 3D שיתוף תרבות יכול להתבצע על ידי גידול admixing, סטרומה או תאים חיסוניים, ובכך ללמוד crosstalk תא סרטני או סיכום microenvironments גידול שונים לניתוח אינטראקציות תא-תאים כולל תרבויות מצטלבות עם תאים אנדותל16.
הגדרה זו 3D spheroid שיתוף תרבות יכול לשמש כדי לבצע שיתוף תרבות של סוגי תאים שונים הנוכחי microenvironment הגידול כדי להעריך את ההשפעות של אלמנטים ECM שונה. מלבד סוג אני קולגן, רכיבים אחרים ECM (למשל, מטריג'ל, תערובת מטריג'ל / קולגן, פיברונקטין), ניתן להשתמש מאז פלישת תאים סרטניים מושפעת השפע של מצעיםשונים 22. כמו כן, microwells של יצוק agarose מתאימים להיווצרות spheroid של קווי תא ראשיים עבור תאים עם הדבקה תא נמוך.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

התקדמות משמעותית נעשתה בטיפול בסרטן עם אימונותרפיה, למרות מספר רב של סוגי סרטן להישאר עמידים לטיפול. מספר מוגבל של אסות מאפשרות ניטור ישיר ותובנות מכניות על האינטראקציות בין תאים סרטניים ותאי מערכת החיסון, ביניהם, T-תאים לשחק תפקיד משמעותי בביצוע התגובה cytotoxic של המערכת החיסונית אדפטיבית לתאים סרטניים. רוב ההתאסות מבוססות על דו מימדי (2D) שיתוף תרבות של תאים בשל קלות השימוש היחסית, אבל עם ייצוג מוגבל של פנוטיפ צמיחה פולשנית, אחד סימני ההיכר של תאים סרטניים. מערכות שיתוף תרבויות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) נוכחיות דורשות ציוד מיוחד או ניטור נפרד לפלישה לתאים סרטניים בעלי תרבות שיתופית ולאינטראקציה עם תאי T.
כאן אנו מתארים גישה כדי לפקח בו זמנית על התנהגות פולשנית ב3D של כדורי תאים סרטניים וcytotoxicity T-cell בתרבות השותפות. היווצרות ספרואיד מונעת על ידי אינטראקציות משופרות תא-תא בדגומים ללא אגרוז microwell יצוקות עם תחתיות בצורת U. הן T-cell שיתוף-תרבות ופלישה לתאים סרטניים לסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך microwells של יציקות agarose ללא צורך להעביר את התאים, ובכך שמירה על מערכת 3D שלם שיתוף תרבות לאורך כל ההסכם. ניתן להפריד את מטריצת הקולגן מהיצוק של אגרוז, המאפשר הכתמת אימונו-לוד (IF) והדמיה קונפוקולית של תאים. כמו כן, תאים יכולים להיות מבודדים לצמיחה נוספת או נתון לניתוחים כגון עבור ביטוי גנים או פלואורסצנציה מופעל תא מיון (FACS). לבסוף, ניתן לנתח את התרבות ההפוכה תלת-מיוד על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) לאחר הטבעה וקוריה. שינויים אפשריים של ההסדה כוללים קומפוזיציות שונות של מטריצה חוץ תאית (ECM) כמו גם הכללה של תאים סטרומה או חיסוניים שונים עם התאים הסרטניים.

מודל התרבות התת-ת-ית-ית-ית-ית-ית-יתור מאפשר תסה שונה המוצגת באות 1A, שניתן לשלב או לשנותה במידת הצורך. בהגדרה ניסיונית הוקמה שלנו, גידול ותאי T הם שיתוף תרבות במשך 2 ימים ואחריו חניכה של אסא הפלישה לבחירה של תאים סרטניים פולשניים ו / או עמידים(איור 1B). ביום 4 מבוצע...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture at JoVE.com

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

הגישה המוצגת בו זמנית מעריך פלישה לתאים סרטניים באסה 3D spheroid ו cytotoxicity T-cell. ספרואידים נוצרים בהצללת אגרוז מרובת מיקרווול ללא פיגומים. תרבות וטביעה בסוג אני מטריצת קולגן מבוצעים בתוך אותו מכשיר המאפשר לפקח על פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity בתיווך T-cell.

ניטור פלישת תאים סרטניים וcytotoxicity T-Cell בתרבות 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

שיטות אלה יכולות לספק תובנות מכניסטיות על ציטוטוקסיות של תאי הגידול התיווך בתאי החיסון והתנהגות פולשנית בסביבה תלת-מימדית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי מודל זה 3D ספרואיד תרבות שותף אינו דורש העברה של כדוריות עבור מאמרים רבים הבאים. הפגנת הליך זה תהיה אפסרה נאסיר, דוקטורנטית מהמחלקה שלנו.כדי ליצור את הכדורואידים באמצעות טכניקה אספטית במכסה המנוע של תרבות התא להוסיף 500 microliters של אגת מותכת לתוך עובש גומי 81 microwell דואג להימנע בועות. כאשר agarose התגבש בזהירות להגמיש את עובש הגומי כדי לפוצץ את יציקות אגרוז לתוך בארות בודדות של צלחת 12 היטב. כדי לצייד את הגבס להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיום תרבות התא בתוספת 10% סרום חזיר עוברי לתוך כל באר ולמקם את הצלחת לתוך אינקובטור תרבות התא במשך שעה אחת.בסוף הדגירה להטות את הצלחת כדי להסיר את מדיום תרבות התאים בסביבה הראשונה, לאחר מכן בתא הזריעה בזהירות זרע 190 microliters של מוכן גידול מתלים התא dropwise לתוך כל תא זריעת תא. לאחר אינקובציה של 15 דקות באינקובטור תרבות התא להוסיף ב 2.5 מיליליטר של בינוני לחוץ של הגבס ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור במשך 48 שעות. כדי להקים תא T-תא שיתוף תרבות resuspend את המספר המתאים של תאי T ב 190 microliters של תרבות תא T לא הולם, בינוני ל הבאר עד 12 גם צלחת כדי לאפשר הסרה של מדיום תרבות התא סביב יצוק agarose הראשון.ואז בתא הזריעה, מבלי להסיר את הכדורידים להשתמש במיקרוסקופ אור כדי לבדוק אם כל כדוריות כבר שאפו ומחזיק פיפטה טעון P200 כחצי סנטימטר מעל כל יצוק בזהירות לזרוע את תאי T על הגבס בצורה dropwise מבלי לנתק את כדוריות. כאשר כל הגבסים כבר זרעו בזהירות החזיר את הצלחת לחממת תרבות התא במשך 15 דקות לפני הוספת בינוני תרבות תאים טריים בתוספת סרום חזיר עוברי לצד החיצוני של כל גבס עוד 48 שעות דגירה. כדי להטמיע את תרבות שיתוף 3D בסוג אחד קולגן לדלל קולגן מלאי עם בסיס חופשי בסרום בינוני לריכוז עבודה סופי של שלושה מיליגרם למיליליטר ולהוסיף 11 microliters של 10X PBS, להוסיף 1.2 microliters של נתרן הידרוקסידית אחת טוחנת לכל 100 microliters של קולגן.לאחר נטרול ת פתרון הקולגן על הקרח למשך שעה אחת, הסר את מדיום תרבות התאים המקיפה ובתוך כל גבס כפי שהוכח. מוסיפים בזהירות את הקולגן המנוטרל תערובת אחת לכל גבס בצורה dropwise, ומיד החזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא במשך חמש דקות לפני היפוך הצלחת במשך שעה נוספת הדגירה. בסוף הדגירה מניחים את הצלחת בצד ימין למעלה במכסה המנוע biosafety ולאט לאט להוסיף מדיום תרבות תאים טריים לאורך הצד של כל באר.ואז להחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא במשך 48 שעות. עבור כתמים immunofluorescent של תרבויות 3D מוטבע לתקן כל יצוקה אגרוז כולל כדוריות ב 5.4% פורמלין לילה בטמפרטורת החדר בתא לח. למחרת, להסיר את הפורמלין המקיף את הגבס אגרוז ולהשתמש פינצטה קצה מלוטש לתפוס את הפינה של כל מטריצת קולגן כדי לאפשר את הגבס להיות קלוף מן תאי הזריעה בתנועת נוזל אחת.מניחים כל תיקון קולגן לתוך באר אחת של שמונה שקופית תא היטב ולהוסיף 250 microliters של 0.5% octoxynol כל טוב. לאחר שעה בטמפרטורת החדר להחליף את octoxynol עם 250 microliters של פתרון חסימה. לאחר שעה בטמפרטורת החדר מוסיפים 250 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים העיקרי המעניין כל באר ומ מניחים מגלשה בתא לח כהה לילה בטמפרטורת החדר.למחרת בבוקר להסיר את הנוגדן העיקרי מכל באר ולשטוף את הבארות שלוש פעמים עם 300 microliters של חיץ IF במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של תסנובות משניות לא הולמות לכל באר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה להסיר את הנוגדן ולשטוף כל מדגם שלוש פעמים עם מאגר IF כפי שהוכח.לאחר הכביסה האחרונה לשטוף את הדגימות עם 300 microliters של PBS ל הבאר בזהירות להסיר את הקירות של השקופית התא. כך שרק מגלשת הזכוכית בתחתית נשארת. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה לשקופית הזכוכית ושחרר בזהירות את החלקת הכיסוי על המדגם מבלי ליצור בועות ואז לאחסן את הדגימות המותקנות במקום יבש כהה לילה לפני הדמיה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי קונפוקלית כאן ניתן לראות הגדרות ניסיוניות טיפוסיות עבור הראיה והן מניבות דגימות מייצגות ונותנות לניתוח בסוף הניסוי עבור כל פרוטוקול.הטמע תרבות 3D בקולגן מסוג אחד בתוך בארות מיקרו של יצוקה אגרוז מאפשר ניטור וניתוח של הפלישה על ידי תמונה J.In ניתוח זה של שני מורין ראשי, תאי סרטן הלבלב קווים צורות כדוריות שונות והתנהגויות פולשניות נצפו. קו התא הראשון הפגין היווצרות ספרואידית קומפקטית יותר ופלישה חדה דומה לזו שנצפתה בפלישה לתא יחיד. בעוד קו התא השני יצר כדוריות שהיו משוחררות יותר והפגינו דפוס פלישה קולקטיבי.שיתוף תרבות יכול להתבצע עם שני קווי תאים שיבוט הגידול שונים זרע באותו זמן או עם גידול ותאי T על היווצרות ספרואיד הגידול או הערכות אינטראקציה גידול T-cell הבאים. להערכה מפורטת של הכתם האימונופלואורסצנטי של ההתנהגות הפולשנית והדמיה קון מוקדית ניתן לבצע באופן תפוקה גבוהה. הגבס אגרוז מאפשר הטממה של כל מערכת התרבות 3D בפרפין עבור חתך סדרתי וכתמים אימונוהיסטוכימיה לכמת את הקשר המרחבי בין הגידול לתאי T.לדוגמה, חדירת תאי T יכולה להיות מזוהה ומאופיינת על ידי כתמי סמן פני השטח של התא. טכניקה זו מאפשרת ניתוח של דגימות המטופל, כמו גם את השימוש בתרופות מגרה וחסימה כדי לחקור אינטראקציות תא גידול T-cell.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

מודל הפלישה Perineural ב קרצינומה תא ראש וצוואר קשקש

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

מסנן ראפיד הכנס מבוססת מערכת 3D תרבות התמיינות תאי ערמונית ראשית

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...