Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
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3Dコカルチャーモデルのアプローチに関する有益な議論やアドバイスをしてくれたヴァージニー・オリ博士に感謝します。また、エリザベス・ジョーンズのIHC断面に関する優れた技術支援に感謝します。この研究は、DFG(ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト)からYL(LI 2547/4-1)および国立衛生研究所からAW(R01 CA231291)、ATR(R01 CA205632)、GWP(R01 CA218670)への助成金とCA00がんセンターのコアグラント(Ca00がんセンター)への助成金によって支えられた。

プロトコル全体で頻繁に使用される単語の一覧と説明は 、補足ファイル 1にあります。
1. スフェロイドの生成
<ol><li>1x PBS(例えば、1gのアガロース1x PBSの50 mL)およびオートクレーブ35マイクロウェルゴム型で2%アガロースを調製し、オートクレーブ。 注意:IHC処理用のアガロースキャストを生成するために低融解アガロースを使用しないでください。</li>
	<li...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+of+metastasis:+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities.">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models.">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).</li><li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture.">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li><li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

ここで提示される方法は、T細胞との共培養、細胞ベースの機能的および分子アッセイ、ならびに単一の装置を用いた様々なモニタリングおよび分析の可能性を可能にする3D腫瘍スフェロイド生成について説明する。我々のアプローチの大きな利点は、3D培養物を別のアッセイに移す必要がなくて、アッセイ全体で3D培養の完全性を維持する点です。
ここで示すワークフロ?...

過去10年間のがん免疫療法の大幅な改善にもかかわらず、治療に対する感受性と耐性に関する私たちの機械学的理解はまだかなり貧弱です。腫瘍が実質的な不均一性を示し、腫瘍細胞とそれらの微小環境および免疫細胞との動的相互作用が、腫瘍細胞死に影響を与え、免疫療法11、2、32,3を含む治療に対する侵襲的な行動および応答を示すことが十分に確立されている。適応免疫系の一つの腕として、T細胞は細胞特異的細胞毒性を実行する。T細胞認識とがん細胞への応答の分析は、免疫調節治療に対する耐性と感受性に関する機械的な洞察を提供します。
適切な環境におけるがんとT細胞の相互作用をインビトロでモデル化し、モニタリングすることは困難であり、これまでのところ、限られた機械主義的な洞察をもたらしました。ほとんどの細胞ベースのアッセイは、生体,内生理学44、5、6、すなわち空間細胞相互作用、細胞外マトリックス(ECM)7との接触、5動的代謝需要、質量増殖による低酸素増加8、および微小微生物(TME)の微小環境(9ME)の影響による増大する3次元(3D)を再現するために重要な重要な特徴を欠く2次元(2D)環境に依存している。679一方、現在使用されている3次元(3D)共培養と侵略アッセイシステムには、まだ多くの欠点があります:(1)スフェロイド生成と,収穫5、10、(2)10スフェロイド5サイズの制御の欠如の時間を消費する性質、 形状および細胞密度11、12、(3)12低スループット型アッセイは、(4)特殊機器13、14、(5)異なるアッセイ111415、16、17,16に対する異なる環境に共培養を移す必要性を要求する。,17特に、共培養アッセイの転移は、しばしばスフェロイドの破壊および共培養完全性の喪失をもたらす。これは、細胞-細胞接着が減少した「緩い」スフェロイドに特に当てはまります。例えば、ほとんどの3Dの侵略アッセイは、スフェロイドが最初の形成後に収穫され、ECM 14、15、1615,16で再中断されることを要求する。14このリサスペンションステップは、回転楕円体間の距離に対する制御の損失をもたらす。腫瘍スフェロイド間の距離は侵襲的な挙動に影響を与えるので、この制御の喪失は高いアッセイ間分散を導入し、再現性を低下させる。さらに、末梢および腫瘍スフェロイド浸潤免疫細胞の評価のための連続した遠心分離工程による細胞分画アッセイの適用は、より安定したスフェロイド17を生成する腫瘍細胞集団に限定される。
コンセプトとアプローチ
当社のアプローチでは、上記の不具合に対して、後述のアッセイ用に回転楕円体の移動を必要としない「オールインワン」3Dスフェロイド共培養モデルを使用して対処しています。我々は、スフェロイド形成装置( 材料表を参照)を適応させ、同時に癌細胞の侵襲的挙動と共培養T細胞の細胞傷害性をモニタリングするためのアッセイを生成した。この方法はユーザーフレンドリーで安価で、比較的高スループットの3D設定で迅速かつ容易に処理できます。使用される装置のタイプに依存して、最大81の大きい均一サイズのスフェロイドは、播種された細胞の数を変更することによって個々のスフェロイドサイズを制御して単一のピペットステップで生成することができる。スフェロイド形成は、U字型の底部を有する足場を含まないアガロースマルチウェルキャストにおける細胞間相互作用の強化によって強制される。この3Dシステムは、動的細胞ベースの機能研究と、蛍光活性化細胞選別(FACS)、免疫蛍光(IF)または免疫組織化学(IHC)染色、無傷の3D共培養の遺伝子発現解析を含むエンドポイント分子および生化学的アッセイに適応させた。
機能研究のために、アガロースキャスト内のI型コラーゲンにスフェロイドを埋め込むと、等距離のスフェロイドからの癌細胞の浸潤を生じ、単一細胞対集団細胞移動18、19,19などの必須細胞株特異的特徴をモニタリングすることを可能にする。さらに、コラーゲンマトリックスはアガロースキャストから容易に分離され、複数のスフェロイドを含む1\u20122 mmの厚さのパッチをもたらし、共焦点顕微鏡によるIF染色およびイメージングのためにさらに処理することができる。これにより、ハイスループットスクリーニングで細胞浸潤と細胞マトリックス相互作用が明確に明らかになります。また、コラーゲンマトリックス中の細胞は、コラーゲン消化後に単一細胞解離後に分離して、その後の細胞培養または分析を行うことができる。
スフェロイドのIHC分析では、アガロースキャストの固定および切除後、タンパク質または関心のある他の分子が、スフェロイドの地理的位置を維持しながら検出可能である。ここで説明するアプローチでは、スフェロイドはアガロースキャスト内のHydroxyethylアガロース処理ゲルに直接埋め込まれ、ゲルはマイクロウェルの底部にスフェロイドを保持する「蓋」として機能する。アガロースキャスト20のパラフィン埋め込み後、連続横切りは、キャストの底部を出発点として行う。
このアプローチは、Hydroxyethylアガロース処理ゲル21 に埋め込む前に細胞の収穫を必要とするスフェロイドの従来のIHC断面とは対照的であり、このように細胞の空間配置を失うスフェロイドの破壊を招くリスクがある。また、腫瘍スフェロイド17 に浸潤した免疫細胞または末梢のいずれに免疫細胞が直接埋め込まれるのかを評価するための遠心分離による細胞分画は、直接埋め込むことによって回避される。
さらに、3D共培養は、腫瘍、間質または免疫細胞を付着させることによって行うことができる、そしてこのように腫瘍細胞クロストークを研究するか、または内皮細胞16との共培養を含む細胞間相互作用を分析するための異なる腫瘍微小環境を再現する。
この3Dスフェロイド共培養設定は、腫瘍微小環境に存在する異なる細胞タイプの共培養を行い、改変されたECM要素の効果を評価するために使用することができる。I型コラーゲン以外にも、他のECM成分(例えば、マトリゲル、マトリゲル/コラーゲン混合物、フィブロネクチン)は、腫瘍細胞浸潤が異なる基質22の存在によって影響を受けるので使用することができる。また、アガロースキャストのマイクロウェルは、一次細胞株のスフェロイド形成および低細胞接着を有する細胞に適している。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

多くの癌は治療に耐性を持ち続けているが、免疫療法による癌の治療には大きな進歩が見られた。アッセイの限られた数は、腫瘍と免疫細胞の相互作用に直接監視し、機械化的な洞察を可能にし、その中で、T細胞は、癌細胞に対する適応免疫系の細胞傷害応答を実行する上で重要な役割を果たす。ほとんどのアッセイは、使用の相対的な容易さによる細胞の2次元(2D)共培養に基づいていますが、癌細胞の特徴の1つである侵襲的な成長表現型の表現は限られています。現在の3次元(3D)共培養システムは、特別な装置または共培養癌細胞の侵入と相互作用T細胞のための別々の監視を必要とします。
ここでは、共培養における癌細胞スフェロイドとT細胞細胞毒性の3Dにおける侵襲的挙動を同時にモニタリングするアプローチについて述べている。スフェロイド形成は、U字型の底部を有する足場を含まないアガロースマイクロウェルキャストにおける細胞間相互作用の強化によって駆動される。T細胞共培養および癌細胞の両方のI型コラーゲンマトリックスへの浸潤は、アガロースキャストのマイクロウェル内で細胞を転移することなく行われ、アッセイ全体で無傷の3D共培養システムを維持する。コラーゲンマトリックスはアガロースキャストから分離することができ、免疫蛍光(IF)染色および細胞の共焦点イメージングを可能にする。また、細胞は、さらなる増殖のために単離したり、遺伝子発現や蛍光活性化細胞選別(FACS)などの分析を行ったりすることができる。最後に、3D共培養は、埋め込みおよび切除後の免疫検査(IHC)によって分析することができる。アッセイの可能な修飾は、細胞外マトリックス(ECM)の変質された組成物だけでなく、癌細胞と異なる間質または免疫細胞を含めることが含まれる。

3Dの共培養モデルは、必要に応じて組み合わせたり変更したりできる 、図1Aに示すさまざまなアッセイを可能にします。我々の確立された実験セットアップにおいて、腫瘍およびT細胞は、侵襲的および/または耐性腫瘍細胞の選択のための浸潤アッセイの開始に続いて2日間共培養される(図1B)。4日目に、浸潤の定量が行われ、「生存者」細胞はコラ...

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Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

提示されたアプローチは、3DスフェロイドアッセイおよびT細胞細胞毒性における癌細胞浸潤を同時に評価する。スフェロイドは、足場のないアガロースマルチマイクロウェルキャストで生成されます。I型コラーゲンマトリックスにおける共培養および埋め込みは、同じ装置内で行われ、癌細胞浸潤およびT細胞媒介性細胞傷害をモニタリングすることができる。

3D培養におけるがん細胞浸潤とT細胞毒性のモニタリング

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

これらの方法は、免疫細胞介在性腫瘍細胞傷害性および侵襲的行動に対する3D設定における機械的な洞察を提供することができる。この技術の主な利点は、この3Dスフェロイド共培養モデルは、複数の後続のエッセイのためのスフェロイドの転送を必要としないことです。この手順をデモンストレーションすることは、私たちの部門の博士課程の学生であるアプスラ・ナシルです。細胞培養フードで無菌技術を用いてスフェロイドを生成するには、500マイクロリットルの溶融アガロースを81マイクロウェルゴム型に加え、気泡を避けるように注意を払う。アガロースが慎重に固まった場合、12ウェルプレートの個々の井戸にアガロースキャストを飛び出すためにゴム型を曲げます。各ウェルに10%の牛血清を添加した細胞培養培地の2.5ミリリットルを各ウェルに加え、1時間細胞培養インキュベーターにプレートを入れる。インキュベーションの終わりにプレートを傾けて、まず周囲の細胞培養培地を除去し、次に播種チャンバー内で、各細胞の播種室に滴下して腫瘍細胞懸濁液に調製した190マイクロリットルを慎重に播種する。細胞培養インキュベーターで15分間インキュベーターを加えた後、キャストの外側に培地2.5ミリリットルで添加し、プレートを48時間インキュベーターに戻します。T細胞共培養を設定するために、適切な数のT細胞を190マイクロリットルの不適切なT細胞培養で再懸濁し、12ウェルプレートまでウェル毎に培地を、アガロースキャストを取り巻く細胞培地を除去することを可能にした。次に、播種室で、回転楕円体を取り除かずに、回転楕円体が吸引されたかどうかを確認し、P200に装填されたピペットを各キャストの約半センチメートル上に保持し、T細胞をスフェロイドを除去することなくドロップワイズの方法で慎重にキャストに播種します。すべてのキャストを播種すると、15分間プレートを細胞培養インキュベーターに戻してから、胎児ウシ血清を添加した新鮮な細胞培養培地を各キャストの外側にさらに48時間のインキュベーションを加えた。3D共培養物を1型糖尿病のコラーゲン希釈ストックコラーゲンに血清フリーベース培地を用いたコラーゲンを1ミリリットル当たり3ミリグラムの最終作業濃度に埋め込み、10X PBSの11マイクロリットルを加える場合は、100マイクロリットル当たり1.2マイクロリットルの水酸化ナトリウムを1.2マイクロリットル加える。1時間氷上でコラーゲン溶液を中和した後、デモンストレーションしたように、周囲および各キャスト内の細胞培養培地を除去する。中和したコラーゲンを各キャストに慎重に加え、ドロップワイズで投げ、すぐにプレートを5分間培養インキュベーターに戻してから、インキュベーションでさらに1時間プレートを反転させた。インキュベーションの最後に、プレートを右側にバイオセーフティフードに置き、新鮮な細胞培養培地を各ウェルの側面にゆっくりと加えます。その後、プレートを細胞培養インキュベーターに48時間戻す。埋め込まれた3D共培養の免疫蛍光染色のために、加湿チャンバ内の室温で一晩5.4%ホルマリンにスフェロイドを含むアガロースキャスト全体を固定する。翌日、アガロースキャストを取り巻くホルマリンを取り除き、洗練された先端ピンセットを使用して各コラーゲンマトリックスの角をつかみ、鋳物を単一の流体運動で播種チャンバーから剥離できるようにします。各コラーゲンパッチを8つのウェルチャンバースライドの単一の井戸に入れ、各ウェルに0.5%オクトキシノールの250マイクロリットルを加えます。室温で1時間後にオクトキシノールを250マイクロリットルのブロッキング溶液に交換してください。室温で1時間後、各ウェルに目的の一次抗体カクテルの250マイクロリットルを追加し、室温で一晩暗い加湿チャンバーにスライドを置きます。翌朝、各ウェルから一次抗体を取り除き、洗浄ごとに室温で5分間300マイクロリットルのIFバッファでウェルを3回洗浄します。最後の洗浄後、250マイクロリットルの不適切な二次抗体溶液を各ウェルに加え、光から保護された室温で1時間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに抗体を取り除き、示されるようにIFバッファで各サンプルを3回洗浄します。最後の洗浄後、PBSの300マイクロリットルでサンプルを洗浄し、チャンバースライドの壁を慎重に取り外します。下部のガラススライドだけが残るように。200マイクロリットルの取り付け媒体をガラススライドに加え、気泡を作成せずに慎重にカバースリップをサンプルに落とし、共焦点蛍光顕微鏡によるイメージングの前に一晩暗い乾燥した場所に取り付けられたサンプルを保存し、アッセイの典型的な実験セットアップと、各プロトコルの実験終了時に代表的および分析可能なサンプルの収量を観察することができる。アガロースキャストのマイクロウェル内の1型コラーゲンに3D培養を埋め込むことで、2つの原生マウスのこの分析J.Inによる浸潤のモニタリングと分析が可能となり、膵臓癌細胞株の異なるスフェロイド形状および侵襲的挙動が観察された。第1の細胞株は、単一細胞の浸潤に対して観察されたものと同様に、よりコンパクトなスフェロイド形成およびスパイキーな侵入を実証した。第二の細胞株は、より緩いスフェロイドを形成し、集団浸潤パターンを実証しながら。共培養は、腫瘍スフェロイド形成またはその後の腫瘍T細胞相互作用評価の際に、同時に、または腫瘍およびT細胞と同時に播種した2つの異なる腫瘍クローナル細胞株で行うことができる。侵襲的挙動の詳細な評価のために、免疫蛍光染色およびコン焦点イメージングは、高スループット方式で行うことができる。アガロースキャストは、腫瘍とT細胞の間の空間的関係を定量化するために、連続断面および免疫組織化学染色のためのパラフィン中の全体の3D培養系の埋め込みを可能にする。例えば、T細胞浸潤は、細胞表面マーカー染色によって同定および特徴付けることができる。この技術は、患者のサンプルの分析だけでなく、腫瘍細胞T細胞相互作用をプローブするために刺激および遮断薬の使用を可能にする。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

共培養アッセイは、神経膠芽腫の浸潤のマクロファージとミクログリアの刺激を研究します

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

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Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

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びまん性内因橋膠腫の迅速な死後の細胞培養のためのプロトコル（DIPG）

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

治療の頭頸部扁平上皮癌に対する回転楕円体に基づく 3 D 細胞培養モデルのテスト

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

住セルイメージ投射アッセイ研究神経膠腫脳腫瘍幹細胞の遊走と浸潤に

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

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Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...