Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
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우리는 3D 공동 문화 모델의 접근 방식에 대한 유용한 토론과 조언을 위한 Virginie Ory 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 IHC 단면에 우수한 기술 지원을 엘리자베스 존스 감사합니다. 이 연구는 DFG (도이치 포중지마인샤프트)에서 YL(LI 2547/4-1)과 국립 보건원에서 AW(R01 CA231291), ATR(R01 CA205632), GWP(R01 CA218670), 그리고 GP(R01 CA218670) 및 G5(G101 CA218670)의 보조금에 의해 지원되었다.

프로토콜 전체에서 자주 사용되는 일부 단어에 대한 목록 및 설명은 보충 파일 1에서찾을 수 있습니다.
1. 스페로이드 생성
<ol><li>준비 및 오토클레이브 2% 아가로즈 1x PBS(예: 1x PBS의 50mL에서 아가로즈 1g) 및 오토클레이브 35- 및 81 마이크로웰 고무 금형. 주의: IHC 처리를 위한 아가로즈 캐스트를 생성하기 위해 저용 아가로즈를 사용하지 마십시오.</li>
	<li>아가로...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+of+metastasis:+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities.">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models.">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).</li><li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture.">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li><li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

여기에 제시된 방법은 T 세포, 세포 기지를 둔 기능 및 분자 분석과 공동 배양을 허용하는 3D 종양 스페로이드 생성뿐만 아니라 단일 장치를 사용하여 다양한 모니터링 및 분석 가능성을 설명합니다. 우리의 접근 방식의 주요 장점은 3D 문화를 별도의 분석으로 이전할 필요가 없으며 분석 전반에 걸쳐 3D 문화의 무결성을 유지한다는 것입니다.
여기에 제시된 워크플로는 필요에 ...

지난 10 년간 암 면역 요법에 있는 중요한 개선에도 불구하고, 처리에 감도 그리고 저항의 우리의 기계적인 이해는 아직도 상당히 가난한1입니다. 종양이 상당한 이질성을 표시하고, 면역 세포뿐만 아니라 자신의 마이크로 환경과 종양 세포의 동적 상호 작용이 종양 세포 사멸에 영향을 미치고, 침습적 행동및 면역 요법1,,2,3을3포함하는 치료에 대한 반응이 잘 확립된다. 적응형 면역 계통의 한 팔로, T 세포는 세포 특정 세포 독성을 실행합니다. T 세포 인식 및 암세포에 대한 반응의 분석은 면역 변조 치료에 대한 저항과 민감성에 대한 기계적 통찰력을 제공합니다.
적절한 환경에서 암과 T 세포 사이의 체외 모델링 및 모니터링 상호 작용은 도전적이고 지금까지 제한된 기계론적 통찰력을 초래했습니다. 대부분의 세포 기반 아세약은 2차원(2D) 환경에 의존하며, 생체 내생리학 4,5,6,6공간 세포 상호 작용, 세포 외 매트릭스(ECM)와의접촉,세포 외 세포7세포 상호 작용, 세포 외 세포(ECM)와의 접촉, 동적 대사 수요, 대량성장(TME)및 마이크로환경(TME)의 효과로 인한 저산소증(TME) 및 마이크로환경(TME)의 효과에 따라 3차원(3D)을 재구성하는 데 중요한 주요 특징이 부족하다.9 한편, 현재 사용되고 있는 3차원(3D) 공동배양 및 침입 분석 시스템과는 여전히 많은 단점이 있다: (1) 스페로이드 생성및수확5,,10,(2) 스페로이드 크기에 대한 제어부족, 형상 및 세포밀도(11)12,(3) 저처리량 형 어설약, (4)특수장비(13)14,14(5) 상이한 형상을 위한 뚜렷한 환경으로 공동배양을 전송할 필요가 있다15,,16,,17. 특히, 공동 문화 분석의 전송은 종종 스페로이드의 붕괴와 공동 문화 무결성의 손실로 이어진다. 이것은 감소된 세포 세포 접착을 가진 "느슨한" 스페로이드에 특히 적용됩니다. 예를 들어, 대부분의 3D 침입 소법은 스페로이드가 초기 형성 후 수확한 다음 ECM14,,15,,16에서 다시 중단될 것을요구한다. 이 재서스펜션 단계는 스페로이드 사이의 거리를 제어하지 않습니다. 종양 스페로이드 사이의 거리가 침습적 행동에 영향을 미치기 때문에, 이러한 통제 상실은 높은 간 분석 차이를 유발하고 재현성을 감소시킵니다. 더욱이, 세포 분획 의 적용은 면역 세포에 침투하는 말초 및 종양 스페로이드의 평가를 위한 연속원심분리 단계에 의해 보다 안정적인 스페로이드를 생성하는 종양 세포 집단으로제한된다(17).
개념 및 접근 방식
우리의 접근 방식은 후속 에세이를 위해 스페로이드의 전송을 요구하지 않는 "All-in-One"-3D 스페로이드 공동 배양 모델을 사용하여 위에서 언급 한 결함을 해결합니다. 우리는 결합된 T 세포의 암세포의 침습적 행동과 세포 독성을 동시에 모니터링하기 위한 분석서를 생성하기 위해 스페로이드 형성 장치(재료표참조)를 조정했습니다. 이 방법은 사용자 친화적이고 저렴하며 비교적 높은 처리량 3D 설정에서 빠르고 쉽게 처리 할 수 있습니다. 사용되는 장치의 유형에 따라, 최대 81개의 큰 균일한 크기의 스페로이드는 시드된 셀 수를 수정하여 개별 스페로이드 크기를 제어하여 단일 파이펫팅 단계에서 생성될 수 있다. 스페로이드 형성은 U자형 바닥으로 비계가 없는 아가로즈 멀티웰 캐스트에서 향상된 세포 세포 상호 작용에 의해 강요됩니다. 당사는 형광 활성 세포 선별(FACS), 면역형광(IF) 또는 면역히스토케(IHC) 염색뿐만 아니라 그대로 3D 공동 배양의 유전자 발현 분석을 포함하는 종점 분자 및 생화학적 분석을 위한 이 3D 시스템을 조정했습니다.
기능적 연구를위해, 아가로즈 캐스트 내에 제1형 콜라겐에 스페로이드를 삽입하면 등평성 스페로이드로부터 암세포를 침범시키고 단일 세포 대 집단세포이동(18,19)과같은 필수 세포주 별 특징을 모니터링할 수 있다., 더욱이, 콜라겐 매트릭스는 아가로즈 주조에서 쉽게 분리되어, 다중 스페로이드를 포함하는 1\u20122 mm 두께 패치가 생성되어, 이는 공초점 현미경검사에 의해 IF 염색 및 이미징을 위해 추가로 처리될 수 있다. 이것은 높은 처리량 검열에 있는 명백한 세포 침략 및 세포 매트릭스 상호 작용을 드러낼 수 있습니다. 또한, 콜라겐 매트릭스내의 세포는 후속 세포 재배 또는 분석을 위해 콜라겐 소화 및 단일 세포 해리 후 분리될 수 있다.
스페로이드의 IHC 분석을위해, 아가로즈 주조의 고정 및 단면 후, 단백질 또는 관심의 다른 분자는 스페로이드의 지리적 위치를 유지하면서 검출할 수 있다. 여기서 설명된 접근법에서, 스페로이드는 아가로즈 주조 내의 하이드록스테틸 아가로즈 가공 젤에 직접 내장되어 있으며, 겔은 마이크로웰의 바닥에 스페로이드를 유지하기 위한 "뚜껑"의 역할을 한다. 아가로즈캐스트(20)의파라핀 포함 후, 직렬 수평 단면은 캐스트의 바닥으로 시작점으로 수행된다.
이 접근법은 Hydroxyethyl 아가로즈 처리젤(21)에 포함되기 전에 세포를 수확해야 하는 기존의 IHC 단면과 대조되며 스페로이드의 붕괴가 세포의 공간 적 배열을 잃을 위험이 있습니다. 또한, 면역 세포가 종양스페로이드(17)에 침투하거나 말초로 남아 있는지 여부를 평가하기 위한 원심분리에 의한 세포 분획은 직접 적인 포함에 의해 피된다.
더욱이, 3D 공동배양은 종양, 기질 또는 면역세포를 혼합하여 수행될 수 있고, 따라서 종양 세포 상호작용을 연구하거나 내피세포와 공동 배양을 포함하는 세포 세포 상호 작용을 분석하기 위한 상이한 종양 마이크로환경을 재수량하여16.
이러한 3D 스페로이드 공동 배양 설정은 종양 미세 환경에 존재하는 상이한 세포 유형의 공동 배양을 수행하고 변경된 ECM 요소의 효과를 평가하는 데 사용될 수 있다. 제형 I 콜라겐 외에 다른 ECM 성분(예를 들어, 마트리겔, 마트리겔/콜라겐 혼합물, fibronectin) 종양 세포 침전이 상이한기판(22)의풍부에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에 사용될 수 있다. 또한, 아가로즈 주조의 마이크로웰은 1차 세포주 및 세포 세포 접착력이 낮은 세포에 적합한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

많은 수의 암이 치료에 저항하는 남아 있지만 면역 요법으로 암 치료에 상당한 진전이 있었습니다. 제한된 수의 아세약은 종양과 면역 세포 사이의 상호 작용에 대한 직접적인 모니터링 및 기계론적 통찰력을 허용하며, 그 중 T 세포는 적응형 면역 계통의 세포 독성 반응을 암세포에 실행하는 데 중요한 역할을 합니다. 대부분의 아세약은 상대적으로 사용이 용이하기 때문에 세포의 2차원(2D) 공동 배양을 기반으로 하지만 암세포의 특징 중 하나인 침습적인 성장 표현형의 제한된 표현으로 인해. 현재 3차원(3D) 공동 배양 시스템은 공동 배양 된 암세포의 침입과 T 세포 상호 작용에 대한 특수 장비 또는 별도의 모니터링이 필요합니다.
여기서 우리는 공동 배양에서 암 세포 스페로이드 및 T 세포 중독의 3D에서 침습적 행동을 동시에 모니터링하는 접근법을 설명합니다. 스페로이드 형성은 U자형 바닥으로 비계가 없는 아가로즈 마이크로웰 캐스트에서 향상된 세포 세포 상호 작용에 의해 구동됩니다. T세포 공동배양및 암세포 침입을 모두 타입 I 콜라겐 매트릭스로 하여 세포를 전송할 필요 없이 아가로즈 캐스트의 마이크로웰 내에서 수행되므로 분석 전반에 걸쳐 온전한 3D 공동 배양 시스템을 유지한다. 콜라겐 매트릭스는 아가로즈 주조에서 분리될 수 있어 면역형광(IF) 염색 및 세포의 공초점 이미징을 허용한다. 또한, 세포는 유전자 발현 또는 형광 활성화 세포 선별(FACS)과 같은 추가 성장을 위해 격리되거나 분석될 수 있다. 마지막으로, 3D 공동배양은 면역히토화학(IHC)을 포함시키고 단면화한 후에 분석될 수 있다. 분석의 가능한 변형은 암세포를 가진 상이한 기질 또는 면역 세포의 포함뿐만 아니라 세포외 매트릭스 (ECM)의 변경 된 조성물을 포함한다.

3D 공동 배양 모델은 그림 1A에도시된 다른 어필을 허용하며, 필요에 따라 결합하거나 수정할 수 있습니다. 우리의 확립된 실험 설정에서, 종양 및 T 세포는 침략및/또는 내성 종양 세포의 선택을 위한 침략 분석의 개시에 선행된 2 일 동안 공동 배양됩니다(도 1B). 4일째에 침략의 양은 콜라겐 매트릭스로부터 분리되거나 RNA23 또는 매트?...

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Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

이러한 방법은 3D 설정에서 면역 세포 매개 종양 세포 세포 독성 및 침략적 행동에 기계적인 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 3D 스페로이드 공동 배양 모델이 여러 후속 에세이에 대한 스페로이드의 전송을 필요로하지 않는다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 부서의 박사 과정 학생 인 Apsra Nasir입니다.세포 배양 후드에서 무균 기술을 사용하여 스페로이드를 생성하기 위해 500 마이크로리터의 용융 아가로즈를 81 마이크로웰 고무 몰드에 첨가하여 거품을 피한다. 아가로즈가 고화되면 고무 몰드를 조심스럽게 구부려 아가로즈를 12웰 플레이트의 개별 우물로 던져 넣습니다. 캐스트를 평형화하기 위해 각 우물에 10 %의 태아 소 혈청으로 보충 된 세포 배양 배지의 2.5 밀리리터를 추가하고 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.인큐베이션의 끝에서 먼저 주변의 세포 배양 배지를 제거하기 위해 플레이트를 기울인 다음, 종착실에서 각 세포 종자 챔버로 종양 세포 현탁액에 대한 준비된 190 마이크로리터를 신중하게 종자한다. 세포 배양에서 15분 동안 인큐베이션을 한 후 배지의 2.5 밀리리터에서 주조의 외부로 첨가하고 플레이트를 48시간 동안 인큐베이터로 반납한다. T세포 공동배양을 설정하여 190마이크로리터에서 부적절한 T세포 배양의 적절한 수의 T세포를 재중단하고, 12개의 웰 플레이트당 배지가 먼저 주조된 세포 배양 배지의 제거를 허용한다.그런 다음 파종 실에서, 스페로이드를 제거하지 않고, 어떤 구체가 흡인되었는지 여부를 확인하기 위해 가벼운 현미경을 사용하고 각 캐스트 위의 P200로드 파이펫을 조심스럽게 스퍼로이드를 해체하지 않고 드롭 와이즈 방식으로 캐스트에 T 세포를 시드. 모든 캐스트가 신중하게 시드되면 15 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반납한 후 태아 소 혈청으로 보충된 신선한 세포 배양 배지를 추가하여 48시간 의 배양에 대한 추가로 배양한다. 3D 공동 배양을 1형 콜라겐 희석 주식 콜라겐과 혈청 프리 베이스 배지로 원료 콜라겐을 밀리리터당 3밀리그램의 최종 작동 농도로 포함하고 10X PBS의 11마이크로리터를 추가하려면 콜라겐 100마이크로리터당 1개의 어금니 암나트륨 수산화수소 1.2 마이크로리터를 첨가한다.얼음에 콜라겐 용액을 1시간 동안 중화한 후, 각 주조 내 및 각 주전 내의 세포 배양 매체를 제거한다. 중화 콜라겐 1개의 혼합물을 드롭와이즈 방식으로 각 캐스트에 신중하게 추가하고, 즉시 배양에서 1시간 동안 플레이트를 반전시키기 전에 5분 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반납하였다. 인큐베이션의 끝에 플레이트 오른쪽을 생물 안전 후드에 올려 놓고 천천히 각각의 양쪽에 신선한 세포 배양 배지를 추가합니다.그런 다음 48 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다. 임베디드 3D 공동 배양의 면역형 염색을 위해 가습 챔버에서 실온에서 하룻밤 동안 5.4%의 포르말린으로 스페로이드를 포함한 각 전체 아가로즈 캐스트를 수정한다. 다음 날, 아가로즈 캐스트를 둘러싼 포르말린을 제거하고 매끄러운 팁 핀셋을 사용하여 각 콜라겐 매트릭스의 모서리를 파악하여 캐스트가 단일 유체 운동으로 파종 챔버에서 벗겨질 수 있도록 합니다.각 콜라겐 패치를 8개의 웰 챔버 슬라이드의 단일 웰에 넣고 각각 우물에 0.5%의 옥옥시놀 250 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 1 시간 후 차단 용액의 250 마이크로 리터로 옥옥시놀을 대체합니다. 실온에서 1 시간 후 각 우물에 관심의 주요 항체 칵테일의 250 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 밤새 어두운 가습 챔버에 슬라이드를 배치합니다.다음날 아침 각 우물에서 1차 항체를 제거하고 300 마이크로리터의 IF 버퍼로 3회 세척당 실온에서 5분간 세척합니다. 마지막 세척 후, 빛으로부터 보호실온에서 1시간 동안 각 웰에 부적절한 이차 항체 용액 250마이크로리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서 항체를 제거하고 입증된 바와 같이 IF 버퍼로 각 샘플을 세 번 세척한다.마지막 세척 후 잘 당 PBS의 300 마이크로 리터와 샘플을 헹구고 조심스럽게 챔버 슬라이드의 벽을 제거합니다. 그래서 하단에 유리 슬라이드만 남아 있습니다. 유리 슬라이드에 장착 매체 200 마이크로리터를 추가하고 조심스럽게 거품을 만들지 않고 샘플에 커버 슬립을 떨어뜨린 다음 공초점 형광 현미경에 의해 이미징하기 전에 밤새 어두운 건조한 장소에 장착 된 샘플을 저장하고 각 프로토콜에 대한 실험의 끝에 대표및 분석 가능한 샘플을 산출 할 수 있습니다.아가로즈 캐스트의 마이크로 웰 내에 3D 배양을 배합하면 이미지에 의한 침략을 모니터링 및 분석할 수 J.In 2개의 1차 뮤린, 췌장암 세포주상이 다른 스페로이드 모양 및 침습적 행동을 관찰했다. 첫 번째 세포주 하나는 단일 세포 침공을 관찰한 것과 유사한 보다 컴팩트한 스페로이드 형성과 뾰족한 침공을 보여 주었다. 제 2 세포주는 더 느슨하고 집단 침략 패턴을 입증 하는 스페로이드를 형성 하는 동안.공동 배양은 종양 스페로이드 형성 또는 후속 종양 T 세포 상호 작용 평가시 종양 및 T 세포와 동시에 시드되는 두 가지 상이한 종양 클론 세포 주체로 수행될 수 있다. 침습적 행동의 상세한 평가를 위해 면역형광 염색 및 콘 초점 이미징은 높은 처리량 방식으로 수행될 수 있다. 아가로즈 캐스트는 종양과 T 세포 사이의 공간 관계를 정량화하기 위해 직렬 단면 및 면역 히스토케화학 염색을 위해 파라핀에 전체 3D 배양 시스템을 포함시킬 수 있게 한다.예를 들어, T 세포 침투는 세포 표면 마커 염색을 식별하고 특성화할 수 있다. 이 기술은 환자 샘플의 분석뿐만 아니라 자극 및 종양 세포 T 세포 상호 작용을 탐구하는 약물을 차단의 사용을 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

연구

암 연구학

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머리와 목 편평 ​​세포 암에서 신경초 침략을위한 모델

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

기본 전립선 세포 분화에 대한 신속한 필터 삽입 기반의 3D 문화 시스템

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...