Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
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Agradecemos a Virginie Ory, PhD por discussões úteis e conselhos sobre a abordagem do modelo de cocultura 3D. Agradecemos também a Elizabeth Jones pela excelente assistência técnica com a secção IHC. Este estudo foi apoiado por subvenções do DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) para YL (LI 2547/4-1) e dos Institutos Nacionais de Saúde para AW (R01 CA231291), para ATR (R01 CA205632), para GWP (R01 CA218670) e a Bolsa Núcleo do Centro de Câncer (P30 CA51008).

Uma lista e explicação de algumas palavras usadas com frequência ao longo do protocolo podem ser encontradas no Arquivo Suplementar 1.
1. Geração de esferoides
<ol><li>Prepare e autoclave 2% agarose em 1x PBS (por exemplo, 1 g agarose em 50 mL de 1x PBS) e autoclave 35- e 81-microwell moldes de borracha. ATENÇÃO: Evite usar agarose de baixo derretimento para gerar os moldes de agarose para processamento de IHC.</li>
	<li>Preparem elencos de agarose NOTA: Os mold...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. 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C., Jia, x. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models.">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).</li><li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture.">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li><li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

O método aqui apresentado descreve a geração de esferoides tumorais 3D, que permite a co-cultura com células T, ensaios funcionais e moleculares baseados em células, bem como uma variedade de possibilidades de monitoramento e análise usando um único dispositivo. A grande vantagem da nossa abordagem é que ela não requer a transferência da cultura 3D para um ensaio separado e mantém a integridade da cultura 3D ao longo dos ensaios.
O fluxo de trabalho aqui apresentado pode ser modific...

Apesar de melhorias significativas na imunoterapia contra o câncer na última década, nossa compreensão mecanicista da sensibilidade e resistência aos tratamentos ainda é bastante pobre1. Está bem estabelecido que os tumores apresentam heterogeneidade substancial, e que as interações dinâmicas das células tumorais com seu microambiente, bem como com as células imunes, impactam a morte celular tumoral, comportamento invasivo e resposta a tratamentos que incluem imunoterapia1,,2,3. Como um braço do sistema imunológico adaptativo, as células T executam citotoxicidade específica das células. A análise do reconhecimento de células T e a resposta às células cancerosas fornecem insights mecanicistas sobre resistência e sensibilidade aos tratamentos modulatórios imunológicos.
A modelagem in vitro e o monitoramento das interações entre câncer e células T em um ambiente apropriado tem sido desafiador e, até agora, resultou em insights mecanicistas limitados. A maioria dos ensaios baseados em células dependem de um ambiente bidimensional (2D), que carece de características-chave que são fundamentais para recapitular a fisiologia tridimensional (3D) in vivo4,5,6, ou seja, interações células espaciais, contato com a matriz extracelular (ECM)7, demanda metabólica dinâmica, aumento da hipóxia devido ao crescimento de massa8, e efeitos do microambiente tumoral (TME)9. Por outro lado, ainda há uma série de deficiências com os sistemas de cocultura tridimensional (3D) atualmente utilizados (3D): (1) a natureza demorada da geração e colheita esferoides5,,10, (2) a falta de controle sobre o tamanho do esferoide, forma e densidade celular11,12, (3) ensaios do tipo de baixo rendimento, (4) a exigência de equipamento especial13,,14, (5) a necessidade de transferir a cocultura para ambientes distintos para diferentes ensaios15,,16,,17. Em particular, a transferência de um ensaio de co-cultura muitas vezes leva à interrupção dos esferoides e à perda da integridade da co-cultura. Isso se aplica especialmente a esferoides "soltos" com menor adesão celular. Por exemplo, a maioria dos ensaios de invasão 3D exigem que os esferoides sejam colhidos após sua formação inicial e, em seguida, resuspendidos em ECM14,15,16. Esta etapa de resuspensão resulta em uma perda de controle sobre a distância entre os esferoides. Uma vez que a distância entre os esferoides tumorais impacta seu comportamento invasivo, essa perda de controle introduz alta variância entre ensaios e reduz a reprodutibilidade. Além disso, a aplicação de ensaios de fracionamento celular por etapas de centrifugação consecutivas para avaliação das células imunes periféricas e tumorais infiltradas é limitada a populações de células tumorais que geram esferoides mais estáveis17.
Conceito e abordagem
Nossa abordagem aborda as deficiências acima mencionadas usando um modelo de cocultura spheroid 3D "All-in-One" — que não requer a transferência de esferoides para ensaios subsequentes. Adaptamos um dispositivo de formação de esferoides (ver Tabela de Materiais) para gerar um ensaio para monitorar simultaneamente o comportamento invasivo das células cancerosas e a citotoxicidade das células T co-cultivadas. Este método é fácil de usar, barato e permite um manuseio rápido e fácil em uma configuração 3D relativamente de alto rendimento. Dependendo do tipo de dispositivo utilizado, até 81 esferoides de grande porte uniforme podem ser gerados em uma única etapa de pipetação com controle sobre o tamanho esferoide individual modificando o número de células semeadas. A formação esferoide é forçada por interações células-células aprimoradas em elencos multi-poços livres de andaimes com fundos em forma de U. Adaptamos este sistema 3D para estudos funcionais baseados em células dinâmicas, bem como ensaios moleculares e bioquímicos que incluem fluorescência ativada de classificação celular (FACS), imunofluorescência (IF) ou imunohistoquímica (IHC), bem como análise de expressão genética da cocultura 3D intacta.
Para estudos funcionais,a incorporação de esferoides no colágeno tipo I dentro das castas agarose resulta na invasão de células cancerígenas de equidistantes e permite monitorar características essenciais da linha celular, como migração celular única vs. células coletivas18,,19. Além disso, a matriz de colágeno é facilmente separada do molde de agarose, resultando em um patch de 1\u20122 mm de espessura contendo vários esferoides, que podem ser processados para coloração de IF e imagens por microscopia confocal. Isso pode revelar distintas interações de invasão celular e matriz celular em uma triagem de alto rendimento. Além disso, as células da matriz de colágeno podem ser isoladas após a digestão do colágeno e dissociação de células únicas para posterior cultivo ou análise celular.
Para a análise de IHC de esferoides,após fixação e secção do molde de agarose, proteínas ou outras moléculas de interesse são detectáveis mantendo as posições geográficas dos esferoides. Na abordagem descrita aqui, os esferoides estão diretamente incorporados no gel de processamento de hidroxietila agarose dentro do molde de agarose e o gel serve como uma "tampa" para reter os esferoides na parte inferior dos microwells. Após a incorporação da parafina do elenco20,a seção horizontal serial é realizada com a parte inferior do elenco servindo como ponto de partida.
Essa abordagem contrasta com a secção convencional de Spheroids que requer a colheita de células antes de incorporar em gel de processamento de hidroxietilaagarose 21 e corre o risco de interrupção de esferoides, perdendo assim o arranjo espacial das células. Além disso, o fracionamento celular por centrifugação para avaliar se as células imunes infiltraram ou permaneceram periféricas aos esferoides tumorais17 é evitada pela incorporação direta.
Além disso, a cocultura 3D pode ser realizada por tumores admixantes, células estrômicas ou imunes, e, assim, estudar o crosstalk de células tumorais ou recapitular diferentes microambientes tumorais para analisar interações células-células, incluindo co-culturas com células endoteliais16.
Esta configuração de cocultura esféide 3D pode ser usada para realizar a co-cultura de diferentes tipos de células presentes no microambiente tumoral e para avaliar os efeitos dos elementos ECM alterados. Além do colágeno tipo I, outros componentes do ECM (por exemplo, matrigel, misturas de matrigel/colágeno, fibronectina), podem ser usados uma vez que a invasão de células tumorais é impactada pela abundância de diferentes substratos22. Além disso, as microiádeas do elenco de agarose são adequadas para a formação esferoide de linhas celulares primárias e para células com baixa adesão celular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

Avanços significativos foram feitos no tratamento do câncer com imunoterapia, embora um grande número de cânceres permaneça resistente ao tratamento. Um número limitado de ensaios permite o monitoramento direto e insights mecanicistas sobre as interações entre tumor e células imunes, entre as quais, as células T desempenham um papel significativo na execução da resposta citotóxica do sistema imunológico adaptativo às células cancerosas. A maioria dos ensaios são baseados na co-cultura bidimensional (2D) das células devido à relativa facilidade de uso, mas com representação limitada do fenótipo de crescimento invasivo, uma das marcas das células cancerosas. Os sistemas de cocultura tridimensionais atuais (3D) exigem equipamentos especiais ou monitoramento separado para invasão de células cancerígenas co-cultivadas e células T interativas.
Aqui descrevemos uma abordagem para monitorar simultaneamente o comportamento invasivo em 3D de esferoides de células cancerosas e citotoxicidade de células T na co-cultura. A formação esferoide é impulsionada por interações células-células aprimoradas em moldes de microwell agarose livres de andaimes com fundos em forma de U. Tanto a co-cultura das células T quanto a invasão de células cancerígenas na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro das microwells dos moldes de agarose sem a necessidade de transferir as células, mantendo assim um sistema de cocultura 3D intacto durante todo o ensaio. A matriz de colágeno pode ser separada do molde de agarose, permitindo a coloração da imunofluorescência (IF) e para imagens confocal das células. Além disso, as células podem ser isoladas para maior crescimento ou submetidas a análises como para expressão genética ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS). Finalmente, a cocultura 3D pode ser analisada pela imunohistoquímica (IHC) após a incorporação e secção. As possíveis modificações do ensaio incluem composições alteradas da matriz extracelular (ECM), bem como a inclusão de diferentes células estromais ou imunes com as células cancerosas.

O modelo de cocultura 3D permite diferentes ensaios mostrados na Figura 1A, que podem ser combinados ou modificados conforme necessário. Em nossa configuração experimental estabelecida, tumores e células T são co-cultivados por 2 dias seguidos pelo início do ensaio de invasão para seleção de células tumorais invasivas e/ou resistentes(Figura 1B). No dia 4 é realizada a quantitação da invasão e as células "sobreviventes" são isoladas da matriz de ...

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Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

A abordagem apresentada avalia simultaneamente a invasão de células cancerígenas em ensaios esferoides 3D e citotoxicidade de células T. Esferoides são gerados em um elenco multi-microwell livre de andaimes. A cocultura e a incorporação na matriz de colágeno tipo I são realizadas dentro do mesmo dispositivo que permite monitorar a invasão de células cancerígenas e a citotoxicidade mediada por células T.

Monitoramento da invasão celular cancerígena e citotoxicidade de células T na cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Esses métodos podem fornecer insights mecanicistas sobre citotoxicidade de células tumorais mediadas por células imunes e comportamento invasivo em um ambiente 3D. A principal vantagem dessa técnica é que este modelo de cocultura 3D esferoide não requer a transferência de esferoides para múltiplos ensaios subsequentes. Demonstrando este procedimento será Apsra Nasir, uma estudante de doutorado do nosso departamento.Para gerar os esferoides usando técnica asséptica em uma capa de cultura celular adicione 500 microliters de agarose derretida em um molde de borracha de 81 microwells tomando cuidado para evitar bolhas. Quando a agarose se solidificou cuidadosamente flexionar o molde de borracha para sair as lanças agarose em poços individuais de uma placa de 12 poços. Para equilibrar os moldes adicione 2,5 mililitros de cultura celular meio suplementado com soro bovino 10% fetal em cada poço e coloque a placa em uma incubadora de cultura celular por uma hora.No final da incubação inclinar a placa para remover o meio de cultura celular no ambiente em primeiro lugar, em seguida, na câmara de semeadura e cuidadosamente semeado 190 microliters do preparado para a suspensão de células tumorais dropwise em cada câmara de semeadura celular. Após uma incubação de 15 minutos na incubadora de cultura celular adicione a 2,5 mililitros de médio a fora do gesso e devolva a placa à incubadora por 48 horas. Para configurar uma co-cultura de células T resuspenque o número apropriado de células T em 190 microliters de cultura inapropriada de células T, médio por poço até os 12 poços para permitir a remoção do meio de cultura celular em torno do elenco agarose primeiro.Em seguida, na câmara de semeadura, sem remover os esferoides use um microscópio leve para verificar se algum esferoides foi aspirado e segurando a pipeta carregada P200 cerca de meio centímetro acima de cada fundamento cuidadosamente semeado as células T nos moldes de forma dropwise sem desalojar os spheroids. Quando todos os moldes foram semeados cuidadosamente devolvido a placa para a incubadora de cultura celular por 15 minutos antes de adicionar meio de cultura celular fresca complementado com soro bovino fetal para o exterior de cada gesso para outra incubação de 48 horas. Para incorporar as co-culturas 3D no colágeno diluído tipo um colágeno com meio base livre de soro para uma concentração final de trabalho de três miligramas por mililitro e adicionar 11 microliters de 10X PBS, adicione 1,2 microliters de um hidróxido de sódio molar por 100 microliters de colágeno.Depois de neutralizar a solução de colágeno no gelo por uma hora, remova o meio de cultura celular ao redor e dentro de cada gesso como demonstrado. Adicione cuidadosamente o colágeno neutralizado uma mistura a cada molde de forma dropwise, e imediatamente devolveu a placa à incubadora de cultura celular por cinco minutos antes de inverter a placa por mais uma hora na incubação. No final da incubação coloque a placa do lado direito para cima no capô de biossegurança e adicione lentamente um meio de cultura celular fresco ao lado de cada poço.Em seguida, devolva a placa à incubadora de cultura celular por 48 horas. Para a coloração imunofluorescente das co-culturas 3D incorporadas fixar cada elenco inteiro de agarose, incluindo os esferoides em 5,4% formalina durante a noite em temperatura ambiente em uma câmara umidificada. No dia seguinte, remova a formalina em torno do molde de agarose e use pinças de ponta elegantes para agarrar o canto de cada matriz de colágeno para permitir que os moldes sejam descascados das câmaras de semeadura em um único movimento fluido.Coloque cada patch de colágeno em um único poço de um slide de câmara de oito poços e adicione 250 microliters de 0,5% octoxynol todos a cada poço. Após uma hora em temperatura ambiente substitua o octoxynol por 250 microliters de solução de bloqueio. Depois de uma hora à temperatura ambiente adicione 250 microliters do coquetel de anticorpos primário de interesse a cada poço e coloque um slide em uma câmara escura umidificada durante a noite à temperatura ambiente.Na manhã seguinte, remova o anticorpo primário de cada poço e lave os poços três vezes com 300 microliters de amortecedor IF por cinco minutos à temperatura ambiente por lavagem. Após a última lavagem, adicione 250 microliters de solução de anticorpos secundários inadequados a cada poço para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação remova o anticorpo e lave cada amostra três vezes com o buffer IF como demonstrado.Após a última lavagem enxágue as amostras com 300 microliters de PBS por poço e remova cuidadosamente as paredes do escorregador da câmara. De modo que apenas o deslizamento de vidro na parte inferior permanece. Adicione 200 microliters de meio de montagem ao slide de vidro e solte cuidadosamente o deslizamento da tampa na amostra sem criar bolhas e, em seguida, armazene as amostras montadas em um lugar seco escuro durante a noite antes da imagem por microscopia de fluorescência confocal Aqui configurações experimentais típicas para os ensaios e produzem amostras representativas e analisáveis no final do experimento para cada protocolo podem ser observadas.Incorporar a cultura 3D no colágeno tipo um dentro dos micro poços de um molde de agarose permite o monitoramento e análise da invasão por imagem J.In essa análise de duas linhas primárias de células cancerígenas do pâncreas diferentes formas e comportamentos invasivos foram observadas. A primeira linha celular um demonstrou uma formação mais compacta de esferoides e uma invasão espetada semelhante à observada para invasões de células únicas. Enquanto a segunda linha celular formava esferoides mais soltos e demonstrava um padrão de invasão coletiva.A co-cultura pode ser realizada com duas diferentes linhas de células clonais tumorais semeadas ao mesmo tempo ou com tumores e células T após a formação de esferoides tumorais ou avaliações subsequentes de interação tumoral de células T. Para uma avaliação detalhada do comportamento invasivo, a coloração imunofluorescente e a imagem con focal podem ser realizadas de forma de alto rendimento. O elenco de agarose permite a incorporação de todo o sistema de cultura 3D em parafina para seção serial e coloração imunohistoquímica para quantificar a relação espacial entre tumor e células T.Por exemplo, a infiltração de células T pode ser identificada e caracterizada pela coloração do marcador de superfície celular. Esta técnica permite a análise de amostras de pacientes, bem como o uso de drogas estimulantes e de bloqueio para sondar interações células T-células tumorais.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Pesquisa do câncer

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Um Modelo para Perineural Invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Um sistema de cultura 3D baseado em Inserir Filtro Rápido para próstata primário Diferenciação Celular

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Um protocolo para a Cultura rápidos post-mortem celular de Difuso Intrínseca Pontine glioma (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapia de testes em um modelo de cultura celular 3D baseado no Spheroid para cabeça e pescoço Carcinoma de células escamosas

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Geração de tumores pancreáticos ortotópicos e caracterização ex vivo da citotoxicidade de células T infiltrada tumoral

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...