Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
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Agradecemos a Virginie Ory, PhD por útiles debates y consejos sobre el enfoque del modelo de co-cultura 3D. También agradecemos a Elizabeth Jones por su excelente asistencia técnica con la sección IHC. Este estudio fue apoyado por subvenciones de la DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) a YL (LI 2547/4-1) y los Institutos Nacionales de Salud a AW (R01 CA231291), a ATR (R01 CA205632), a GWP (R01 CA218670) y a la subvención básica del Centro Oncológico (P30 CA51008).

Una lista y explicación de algunas palabras usadas con frecuencia en todo el protocolo se puede encontrar en el archivo suplementario 1.
1. Generación de esferoides
<ol><li>Preparar y autoclave 2% de agarosa en 1x PBS (por ejemplo, 1 g de agarosa en 50 ml de 1x PBS) y autoclave 35 y 81 micropojes de caucho. ADVERTENCIA: Evite el uso de agarosa de baja fusión para generar los moldes de agarosa para el procesamiento de IHC.</li>
	<li>Preparar moldes de agarosa NOTA: L...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+of+metastasis:+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities.">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models.">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).</li><li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture.">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li><li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

El método presentado aquí describe la generación de esferoides tumorales 3D, que permite el co-cultivo con células T, ensayos funcionales y moleculares basados en células, así como una variedad de posibilidades de monitoreo y análisis utilizando un solo dispositivo. La principal ventaja de nuestro enfoque es que no requiere la transferencia de la cultura 3D a un ensayo separado y mantiene la integridad de la cultura 3D a lo largo de los ensayos.
El flujo de trabajo que se presenta aquí...

A pesar de las mejoras significativas en la inmunoterapia contra el cáncer en la última década, nuestra comprensión mecanicista de la sensibilidad y la resistencia a los tratamientos siguen siendo bastante pobres1. Está bien establecido que los tumores muestran una heterogeneidad sustancial, y que las interacciones dinámicas de las células tumorales con su microambiente, así como con las células inmunitarias, afectan la muerte celular tumoral, el comportamiento invasivo y la respuesta a tratamientos que incluyen inmunoterapia1,,2,,3. Como un brazo del sistema inmunitario adaptativo, las células T ejecutan la citotoxicidad específica de la célula. El análisis del reconocimiento de células T y la respuesta a las células cancerosas proporciona información mecanicista sobre la resistencia y la sensibilidad a los tratamientos modulatorios inmunes.
El modelado in vitro y el seguimiento de las interacciones entre el cáncer y las células T en un entorno adecuado ha sido un desafío y hasta ahora, ha dado lugar a conocimientos mecánicos limitados. La mayoría de los ensayos basados en células se basan en un entorno bidimensional (2D), que carece de características clave que son críticas para la recapitulación de la fisiología in vivo tridimensional (3D)4,5,6, a saber, interacciones células espaciales, contacto con la matriz extracelular (ECM)7, demanda metabólica dinámica, aumento de la hipoxia debido al crecimiento de masa8, y los efectos del microambiente tumoral (TME)9. Por otro lado, todavía hay una serie de deficiencias con los sistemas de co-cultivo tridimensional (3D) y ensayo de invasión actualmente utilizados: (1) la naturaleza que consume mucho tiempo de la generación de esferoides y la cosecha5,10, (2) la falta de control sobre el tamaño del esferoide, forma y densidad celular11,12, (3) los ensayos de tipo de bajo rendimiento, (4) el requisito de equipos especiales13,14, (5) la necesidad de transferir el co-cultivo a entornos distintos para diferentes ensayos15,16,17. En particular, la transferencia de un ensayo de co-cultivo a menudo conduce a la interrupción de los esferoides y la pérdida de la integridad de la co-cultura. Esto se aplica especialmente para los esferoides "flojos" con una adhesión reducida de células celulares. Por ejemplo, la mayoría de los ensayos de invasión 3D requieren que los esferoides se cosechan después de su formación inicial y luego se resuspend en ECM14,,15,,16. Este paso de resuspensión resulta en una pérdida de control sobre la distancia entre los esferoides. Dado que la distancia entre los esferoides tumorales afecta su comportamiento invasivo, esta pérdida de control introduce una alta varianza entre ensayos y reduce la reproducibilidad. Además, la aplicación de ensayos de fraccionamiento celular mediante pasos de centrifugación consecutivos para la evaluación de las células inmunitarias infiltrantes de esferoides periféricos y tumorales se limita a las poblaciones de células tumorales que generan esferoides más estables17.
Concepto y enfoque
Nuestro enfoque aborda las deficiencias antes mencionadas utilizando un modelo de co-cultivo de esferoides 3D, que no requiere la transferencia de esferoides para ensayos posteriores. Adaptamos un dispositivo de formación de esferoides (ver Tabla de Materiales)para generar un ensayo para monitorear simultáneamente el comportamiento invasivo de las células cancerosas y la citotoxicidad de las células T co-cultivadas. Este método es fácil de usar, económico y permite un manejo rápido y fácil en un entorno 3D relativamente alto. Dependiendo del tipo de dispositivo utilizado, se pueden generar hasta 81 esferoides grandes de tamaño uniforme en un solo paso de pipeteo con control sobre el tamaño individual del esferoide modificando el número de células sembradas. La formación de esferoides es forzada por interacciones células celulares mejoradas en moldes de varios pozos libres de andamios con fondos en forma de U. Adaptamos este sistema 3D para estudios funcionales dinámicos basados en células, así como ensayos moleculares y bioquímicos variables que incluyen clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), inmunofluorescencia (IF) o tinción de inmunohistoquímica (IHC), así como análisis de expresión génica del cocultivo 3D intacto.
Para estudios funcionales,la incrustación de esferoides en colágeno tipo I dentro de los moldes de agarosa da como resultado la invasión de células cancerosas de esferoides equidistantes y permite monitorear características esenciales específicas de la línea celular, tales como la migración de células únicas frente a células colectivas18,,19. Además, la matriz de colágeno se separa fácilmente del molde de agarosa, lo que resulta en un parche de 1-u20122 mm de espesor que contiene múltiples esferoides, que se pueden procesar más para la tinción de IF y la toma de imágenes por microscopía confocal. Esto puede revelar interacciones distintas de la invasión celular y de la matriz celular en un cribado de alto rendimiento. Además, las células de la matriz de colágeno se pueden aislar después de la digestión del colágeno y la disociación de una sola célula para el posterior cultivo o análisis celular.
Para el análisis IHC de esferoides,después de la fijación y seccionamiento del molde de agarosa, las proteínas u otras moléculas de interés son detectables manteniendo las posiciones geográficas de los esferoides. En el enfoque descrito aquí, los esferoides están directamente incrustados en el gel de procesamiento de agarosa hidroxietilo dentro del molde de agarosa y el gel sirve como una "tapa" para retener los esferoides en la parte inferior de los micropocillos. Después de la incrustación de parafina de la agarosa fundida20, el seccionamiento horizontal en serie se realiza con la parte inferior del yeso sirviendo como punto de partida.
Este enfoque contrasta con el seccionamiento convencional de IHC de esferoides que requiere la recolección de células antes de incrustar en hidroxietilo agarose gel de procesamiento21 y corre el riesgo de interrupción de los esferoides, perdiendo así la disposición espacial de las células. Además, el fraccionamiento celular por centrifugación para evaluar si las células inmunitarias infiltradas o permanecidas periféricas a los esferoides tumorales17 se evita mediante la inserción directa.
Además, el co-cultivo 3D se puede realizar mezclando células tumorales, estromales o inmunitarias, y estudiando así la conversación cruzada de células tumorales o recapitulando diferentes microambientes tumorales para analizar interacciones células celulares incluyendo co-cultivos con células endoteliales16.
Este entorno de co-cultivo esferoides 3D se puede utilizar para realizar el co-cultivo de diferentes tipos de células presentes en el microambiente tumoral y para evaluar los efectos de los elementos ECM alterados. Además del colágeno tipo I, otros componentes de ECM (por ejemplo, matrigel, mezclas de matrigel/colágeno, fibronectina), se pueden utilizar ya que la invasión de células tumorales se ve afectada por la abundancia de diferentes sustratos22. Además, los micropocillos del molde de agarosa son adecuados para la formación de esferoides de líneas celulares primarias y para células con baja adherencia celular.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

Se han realizado progresos significativos en el tratamiento del cáncer con inmunoterapia, aunque un gran número de cánceres siguen siendo resistentes al tratamiento. Un número limitado de ensayos permiten un seguimiento directo y conocimientos mecánicos sobre las interacciones entre el tumor y las células inmunitarias, entre los cuales, las células T desempeñan un papel importante en la ejecución de la respuesta citotóxica del sistema inmunitario adaptativo a las células cancerosas. La mayoría de los ensayos se basan en el co-cultivo bidimensional (2D) de las células debido a la relativa facilidad de uso, pero con una representación limitada del fenotipo de crecimiento invasivo, una de las señas de identidad de las células cancerosas. Los sistemas actuales de co-cultivo tridimensional (3D) requieren equipo especial o monitoreo separado para la invasión de células cancerosas co-cultivadas y células T que interactúan.
Aquí describimos un enfoque para monitorear simultáneamente el comportamiento invasivo en 3D de los esferoides de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el co-cultivo. La formación de esferoides es impulsada por interacciones células celulares mejoradas en moldes de micropocillos de agarosa libres de andamios con fondos en forma de U. Tanto el co-cultivo de células T como la invasión de células cancerosas en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro de los micropocillos de los moldes de agarosa sin la necesidad de transferir las células, manteniendo así un sistema de cultivo conjunto 3D intacto a lo largo del ensayo. La matriz de colágeno se puede separar del molde de agarosa, lo que permite la tinción de inmunofluorescencia (IF) y la toma de imágenes confocales de las células. Además, las células pueden aislarse para un mayor crecimiento o someterse a análisis como la expresión génica o la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Por último, el co-cultivo 3D puede ser analizado por inmunohistoquímica (IHC) después de la incrustación y seccionamiento. Las posibles modificaciones del ensayo incluyen composiciones alteradas de la matriz extracelular (ECM), así como la inclusión de diferentes células estromales o inmunitarias con las células cancerosas.

El modelo de co-cultivo 3D permite diferentes ensayos que se muestran en la Figura 1A,que se pueden combinar o modificar según sea necesario. En nuestra configuración experimental establecida, las células tumorales y T se co-cultivan durante 2 días seguidos de la iniciación del ensayo de invasión para la selección de células tumorales invasivas y/o resistentes (Figura 1B). El día 4 se realiza la cuantificación de la invasión y las células "supervivie...

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Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

El enfoque presentado evalúa simultáneamente la invasión de células cancerosas en ensayos esferoides 3D y citotoxicidad de células T. Los esferoides se generan en un molde multimicropopo sin andamios. El cocultivo y la incrustación en la matriz de colágeno tipo I se realizan dentro del mismo dispositivo que permite monitorear la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad mediada de las células T.

Monitoreo de la invasión de células cancerosas y la citotoxicidad de células T en el cultivo 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Estos métodos pueden proporcionar información mecanicista sobre la citotoxicidad de las células tumorales mediadas por células inmunitarias y el comportamiento invasivo en un entorno 3D. La principal ventaja de esta técnica es que este modelo de co-cultivo esferoides 3D no requiere la transferencia de esferoides para múltiples ensayos posteriores. Demostrando este procedimiento estará Apsra Nasir, una estudiante de doctorado de nuestro departamento.Para generar los esferoides utilizando la técnica aséptica en una capucha de cultivo celular añadir 500 microlitros de agarosa fundida en un molde de caucho de 81 micropocillos teniendo cuidado de evitar burbujas. Cuando la agarosa se ha solidificado cuidadosamente flexionar el molde de goma para salir de la agarosa se funde en pozos individuales de una placa de 12 pozos. Para equilibrar los moldes añadir 2,5 mililitros de medio de cultivo celular complementado con 10%suero bovino fetal en cada pozo y colocar la placa en una incubadora de cultivo celular durante una hora.Al final de la incubación inclinar la placa para eliminar el medio de cultivo celular en el entorno primero, luego en la cámara de siembra y cuidadosamente sembrar 190 microlitros de la célula tumoral suspensión gota a gota en cada cámara de siembra celular. Después de una incubación de 15 minutos en la incubadora de cultivo celular añadir a 2,5 mililitros de medio al exterior del yeso y devolver la placa a la incubadora durante 48 horas. Para establecer un co-cultivo de células T resuspendir el número adecuado de células T en 190 microlitros de cultivo inapropiado de células T, medio por pozo hasta el pozo 12 para permitir la eliminación del medio de cultivo celular que rodea la agarosa echada primero.Luego, en la cámara de siembra, sin quitar los esferoides, utilice un microscopio de luz para comprobar si se ha aspirado algún esferoides y sosteniendo la pipeta cargada P200 aproximadamente medio centímetro por encima de cada yeso cuidadosamente sembrar las células T sobre los moldes de una manera gota sin desalojar los esferoides. Cuando todos los moldes han sido sembrados cuidadosamente devolvió la placa a la incubadora de cultivo celular durante 15 minutos antes de agregar medio de cultivo celular fresco complementado con suero bovino fetal al exterior de cada yeso para otra incubación de 48 horas. Para incrustar los co-cultivos 3D en colágeno diluido de colágeno tipo uno con base libre de suero medio a una concentración de trabajo final de tres miligramos por mililitro y añadir 11 microlitros de 10X PBS, añadir 1,2 microlitros de un hidróxido de sodio molar por 100 microlitros de colágeno.Después de neutralizar la solución de colágeno en hielo durante una hora, retire el medio de cultivo celular que rodea y dentro de cada yeso como se ha demostrado. Añadir cuidadosamente el colágeno neutralizado una mezcla a cada moldeado de una manera dropwise, e inmediatamente devolvió el plato a la incubadora de cultivo celular durante cinco minutos antes de invertir el plato durante una hora adicional en la incubación. Al final de la incubación coloque la placa del lado derecho hacia arriba en la campana de bioseguridad y agregue lentamente un medio de cultivo celular fresco por el lado de cada pozo.A continuación, devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular durante 48 horas. Para la tinción inmunofluorescente de los co-cultivos 3D incrustados fijar cada fundición de agarosa entera incluyendo los esferoides en 5.4% formalina durante la noche a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Al día siguiente, retire el formol que rodea el molde de agarosa y utilice pinzas de punta elegantes para agarrar la esquina de cada matriz de colágeno para permitir que los moldes se pelen de las cámaras de siembra en un solo movimiento fluido.Coloque cada parche de colágeno en un solo pozo de un portaobjetos de cámara de ocho pozos y agregue 250 microlitros de 0,5% de octoxinol a cada pozo. Después de una hora a temperatura ambiente reemplace el octoxinol con 250 microlitros de solución de bloqueo. Después de una hora a temperatura ambiente añadir un 250 microlitros del cóctel de anticuerpos primario de interés para cada pozo y colocar un tobogán en una cámara húmeda oscura durante la noche a temperatura ambiente.A la mañana siguiente, retire el anticuerpo primario de cada pozo y lave los pozos tres veces con 300 microlitros de Tampón IF durante cinco minutos a temperatura ambiente por lavado. Después del último lavado, agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos secundarios inapropiadas a cada pozo durante una incubación de una hora a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación retire el anticuerpo y lave cada muestra tres veces con Tampón IF como se ha demostrado.Después del último lavado enjuague las muestras con 300 microlitros de PBS por pozo y retire cuidadosamente las paredes del portaobjetos de la cámara. Para que sólo quede el tobogán de vidrio en la parte inferior. Añadir 200 microlitros de medio de montaje a la corredera de vidrio y dejar caer cuidadosamente el resbalón de cubierta en la muestra sin crear burbujas y luego almacenar las muestras montadas en un lugar oscuro seco durante la noche antes de la toma de imágenes por microscopía de fluorescencia confocal Aquí se pueden observar las configuraciones experimentales típicas para los ensayos y producen muestras representativas y analizables al final del experimento para cada protocolo.La incorporación del cultivo 3D en colágeno tipo uno dentro de los micro pozos de un molde de agarosa permite el seguimiento y análisis de la invasión por imagen J.In este análisis de dos líneas celulares de cáncer de páncreas primarias y páncreas se observaron diferentes formas esferoides y comportamientos invasivos. La primera línea celular demostró una formación de esferoides más compacta e invasión puntiaguda similar a la observada para las invasiones de una sola célula. Mientras que la segunda línea celular formó esferoides que estaban más sueltos y demostró un patrón de invasión colectiva.El co-cultivo se puede realizar con dos líneas celulares clonales tumorales diferentes sembradas al mismo tiempo o con tumor y células T tras la formación de esferoides tumorales o una evaluación posterior de la interacción del tumor en células T. Para una evaluación detallada del comportamiento invasivo, la tinción inmunofluorescente y las imágenes focales con se pueden realizar de una manera de alto rendimiento. El elenco de agarosa permite la inserción de todo el sistema de cultivo 3D en parafina para sección en serie y tinción de inmunohistoquímica para cuantificar la relación espacial entre el tumor y las células T.Por ejemplo, la infiltración de células T se puede identificar y caracterizar por la tinción de marcadores de superficie celular. Esta técnica permite el análisis de muestras de pacientes, así como el uso de fármacos estimulantes y bloqueadores para sondear las interacciones de células T de células tumorales.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Un sistema de cultivo en 3D basado en Insertar rápido de filtro para la próstata primario Diferenciación Celular

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

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Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

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Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

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En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generación de tumores pancreáticos ortotópicos y caracterización ex vivo de la citotoxicidad de células T infiltrantes en tumores

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...