Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture at JoVE.com

Vi tackar Virginie Ory, PhD för hjälpsamma diskussioner och råd om tillvägagångssättet i 3D-samkultur modell. Vi tackar också Elizabeth Jones för utmärkt tekniskt bistånd med IHC-snittningen. Denna studie stöddes av bidrag från DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) till YL (LI 2547/4-1) och National Institutes of Health to AW (R01 CA231291), till ATR (R01 CA205632), till GWP (R01 CA218670), och Core Grant of the Cancer Center (P30 CA51008).

En lista och förklaring av några ofta använda ord i hela protokollet finns i Tilläggsfil 1.
1. Generering av sfäroider
<ol><li>Preparera och autoklavera 2% agaros i 1x PBS (t.ex., 1 g agaros i 50 mL av 1x PBS) och autoklav 35- och 81-microwell gummiformar. FÖRSIKTIGHET: Undvik att använda lågsmältnings uppstod för att generera de agaros gjutna för IHC-bearbetning.</li>
	<li>Förbered agarose avgjutningar OBS: 35-mikrobrunnar används för invasion, immunoflu...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+of+metastasis:+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities.">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models.">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).</li><li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture.">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li><li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

Metoden som presenteras här beskriver 3D tumör sfäroid generation, som möjliggör samkultur med T-celler, cell-baserade funktionella och molekylära analyser, samt en mängd olika övervakning och analys möjligheter med hjälp av en enda enhet. Den stora fördelen med vårt tillvägagångssätt är att det inte nödvändiggör överföring av 3D-kulturen till en separat analys och upprätthåller integriteten hos 3D-kulturen i hela analyserna.
Arbetsflödet som presenteras här kan ändra...

Trots betydande förbättringar i cancer immunterapi under det senaste decenniet, vår mekanistiska förståelse av känslighet och resistens mot behandlingar är fortfarande ganska dålig1. Det är väletablerat att tumörer visar betydande heterogenitet, och att de dynamiska interaktionerna av tumörcellerna med deras mikromiljö samt med immuncellerna, inverkan tumörcelldöd, invasivt beteende och svar på behandlingar som inkluderar immunterapi1,2,3. Som ena armen av det adaptiva immunsystemet verkställer T-celler cellspecifik cytotoxicitet. Analysen av T-cellsigenkänning och svar på cancerceller ger mekanistiska insikter i resistens och känslighet för immunmodulerande behandlingar.
In vitro-modellering och övervakning av interaktioner mellan cancer och T-celler i en lämplig miljö har varit utmanande och hittills har resulterat i begränsade mekanistiska insikter. De flesta cellbaserade analyser förlitar sig på en tvådimensionell (2D) miljö, som saknar nyckelfunktioner som är kritiska för rekapitulering av den tredimensionella (3D) in vivo fysiologi4,5,6, nämligen rumsliga cell-cell interaktioner, kontakt med extracellulära matrisen (ECM)7, dynamisk metabolisk efterfrågan, ökad hypoxi på grund av masstillväxt8, och effekter av tumören mikromiljö (TME)9. Å andra sidan finns det fortfarande ett antal brister med de för närvarande används tredimensionella (3D) samkultur och invasion assay system: (1) den tidskrävande karaktär sfäroid generation och skörd5,10, (2) bristen på kontroll över sfäroid storlek, form och celltäthet11,12, (3) de låg-genomströmning typ analyser, (4) kravet på särskild utrustning13,14, (5) behovet av att överföra samkulturen i distinkta miljöer för olika analyser15,16,17. I synnerhet leder överföring av en samkultur assay ofta till störningar av sfäroider och förlust av samkultur integritet. Detta gäller speciellt för "lösa" sfäroider med minskad cell-cell vidhäftning. Till exempel, de flesta 3D-invasion assays kräver att sfäroider skördas efter deras första bildande och sedan återsuspenderade i ECM14,15,16. Detta resuspension steg resulterar i en förlust av kontroll över avståndet mellan sfäroider. Eftersom avståndet mellan tumör sfäroider påverkar deras invasiva beteende, denna förlust av kontroll införs hög inter-assay varians och minskar reproducerbarhet. Vidare är tillämpningen av cellfraktionationsanalyser genom på varandra följande centrifugeringssteg för bedömning av de perifera och tumörsfäroidinfiltrera immuncellerna begränsad till tumörcellpopulationer som genererar stabilare sfäroider17.
Koncept och förhållningssätt
Vårt tillvägagångssätt tar upp de ovan nämnda bristerna med hjälp av en "Allt-i-ett"—3D sfäroid samkultur modell, som inte kräver överföring av sfäroider för efterföljande analyser. Vi anpassade en spheroid formation enhet (se Tabell över material) för att generera en analys för samtidigt övervaka invasiva beteende av cancerceller och cytotoxicitet av co-odlade T-celler. Denna metod är användarvänlig, billig och möjliggör snabb och enkel hantering i en relativt hög genomströmning 3D-inställning. Beroende på vilken typ av enhet som används, upp till 81 stora likformigt stora sfäroider kan genereras i en enda pipettering steg med kontroll över den enskilda sfäroidstorleken genom att ändra antalet celler sådd. Sfäroidbildningen tvingas fram genom förstärkta cell-cell interaktioner i byggnadsställningsfria agaros multi-well-gjutna med U-formade bottnar. Vi anpassade detta 3D-system för dynamiska cellbaserade funktionella studier samt endpoint molekylära och biokemiska analyser som inkluderar fluorescens aktiverad cellsortering (FACS), immunofluorescens (IF) eller immunohistokemi (IHC) färgning samt genuttrycksanalys av den intakta 3D-samkulturen.
För funktionellastudier , inbäddning sfäroider i typ I kollagen inom agaros kastar resulterar i invasion av cancerceller från ekvidanta sfäroider och tillstånd övervakning väsentliga cellinje-specifika funktioner, såsom encelliga vs. kollektiv cell migration18,19. Vidare separeras kollagenmatrisen lätt från agarosgjuten, vilket resulterar i en 1\u20122 mm tjock lapp som innehåller flera sfäroider, som kan bearbetas ytterligare för IF-färgning och avbildning genom konfokalmikroskopi. Detta kan avslöja distinkt cell invasion och cell-matris interaktioner i en hög genomströmning screening. Även celler i kollagenmatrisen kan isoleras efter kollagenslutning och encellig dissociation för efterföljande cellodling eller analys.
För IHC-analys av sfäroider, efter fixering och snittning av agarosgjuten, är proteiner eller andra molekyler av intresse detekterbara samtidigt som de geografiska positionerna hos sfäroiderna bibehålls. I det tillvägagångssätt som beskrivs här, är sfäroider direkt inbäddade i Hydroxyethyl agaros bearbetning gel inom agarose rösterna och gelen fungerar som ett "lock" för att behålla sfäroiderna i botten av mikrobrunn. Efter paraffininbäddning av agarosgjuten20utförs seriell horisontell snittning med den nedersta av gjutna som utgångspunkt.
Detta tillvägagångssätt kontrasterar med konventionellA IHC-snittning av sfäroider som kräver skörd av celler innan inbäddning i Hydroxyethyl agarose bearbetning gel21 och riskerar störningar av sfäroider därmed förlora den rumsliga arrangemang av celler. Också cell fraktionering genom centrifugeringen för bedömning av huruvida immunceller infiltrerade eller förblev perifera till tumör sfäroider17 undviks genom direkt inbäddning.
Vidare kan 3D-samkultur utföras genom att blanda tumör- stromal eller immunceller, och därmed studera tumörcellsöverhör eller rekapitulera olika tumörmikromiljöer för analys av cell-cell interaktioner inklusive samkulturer med endotelceller16.
Denna 3D sfäroida co-kultur inställning kan användas för att utföra samkultur av olika celltyper som finns i tumören mikromiljö och att bedöma effekterna av förändrade ECM element. Förutom typ I kollagen, andra ECM komponenter (t.ex., matrigel, matrigel /kollagen blandningar, fibronectin), kan användas eftersom tumörcell invasionen påverkas av överflödet av olika substrat22. Också, mikrobrunnarna i agaros gjutna är lämpliga för sfäroidbildning av primära cellinjer och för celler med låg cell-cell adhesion.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

Betydande framsteg har gjorts vid behandling av cancer med immunterapi, även om ett stort antal cancerformer fortfarande är resistenta mot behandling. Ett begränsat antal analyser möjliggör direkt övervakning och mekanistiska insikter i samspelet mellan tumör och immunceller, bland vilka, T-celler spelar en viktig roll i verkställandet av det cytotoxiska svaret hos det adaptiva immunsystemet till cancerceller. De flesta analyser är baserade på tvådimensionella (2D) samkultur av celler på grund av den relativa användarvänlighet men med begränsad representation av den invasiva tillväxt fenotyp, en av kännetecknen för cancerceller. Nuvarande tredimensionella (3D) samkultur system antingen kräver särskild utrustning eller separat övervakning för invasion av co-odlade cancerceller och interagerande T-celler.
Här beskriver vi ett tillvägagångssätt för att samtidigt övervaka invasiva beteende i 3D av cancer cell sfäroider och T-cell cytotoxicitet i samkultur. Sfäroidbildning drivs av förbättrade cell-cell interaktioner i byggnadsställning-fria agaros microwell kastar med U-formade bottnar. Både T-cells samkultur och cancer cell invasion i typ I kollagen matris utförs inom mikrobrunnar av agarose kastar utan att behöva överföra cellerna, därmed upprätthålla en intakt 3D-co-kultur system i hela analysen. Kollagenmatrisen kan separeras från agarosgjuten, vilket möjliggör immunofluorescens (IF) färgning och för konfokal avbildning av celler. Även celler kan isoleras för ytterligare tillväxt eller utsättas för analyser som för genuttryck eller fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Slutligen kan 3D-samkultur analyseras av immunohistokemi (IHC) efter inbäddning och snittning. Möjliga modifieringar av analysen inkluderar förändrade sammansättningar av den extracellulära matrisen (ECM) samt införandet av olika stromala eller immunceller med cancercellerna.

3D-samkulturmodellen möjliggör olika analyser som visas i figur 1A, som kan kombineras eller modifieras efter behov. I vår etablerade experimentella setup, tumör och T-celler är co-odlade i 2 dagar följt av inledande av invasionen assay för val av invasiva och / eller resistenta tumörceller (Figur 1B). Dag 4 quantitationen av invasionen utförs och "överlevande" celler isoleras från kollagenmatrisen eller direkt bearbetas för RNA23 e...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture at JoVE.com

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Den presenterade metoden utvärderar samtidigt cancer cell invasion i 3D sfäroid analyser och T-cell cytotoxicitet. Sfäroider genereras i en byggnadsställning-fri agaros multi-microwell rösterna. Samkultur och inbäddning i typ I kollagen matris utförs inom samma enhet som gör det möjligt att övervaka cancer cell invasion och T-cells medierad cytotoxicitet.

Övervakning Cancer Cell Invasion och T-Cell cytotoxicitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Dessa metoder kan ge mekanistiska insikter i immun cell-medierad tumör cell cytotoxicitet och invasiva beteende i en 3D-inställning. Den största fördelen med denna teknik är att denna 3D sfäroida samkultur modell inte kräver överföring av sfäroider för flera efterföljande uppsatser. Demonstrera denna procedur kommer att Apsra Nasir, en doktorand från vår institution.För att generera sfäroider med hjälp av aseptisk teknik i en cellkultur huva lägga 500 mikroliter av smält agaros i en 81 microwell gummi mögel noga med att undvika bubblor. När agarose har stelnat noggrant flex gummi mögel att poppa ut agarose kastar i enskilda brunnar av en 12 väl platta. För att jämvikt avgjutningar lägga 2,5 milliliter cellodling medium kompletteras med 10%fetala nötkreatur serum i varje brunn och placera plattan i en cellkultur inkubator i en timme.I slutet av inkubationen luta plattan för att ta bort cellodlingsmediet i den omgivande först, sedan i såddkammaren och försiktigt utsäde 190 mikroliter av de beredda att tumörcell suspension dropwise i varje cell seedning kammare. Efter en 15 minuters inkubation i cellodlingen inkubatorn lägga till på 2,5 milliliter medium till utsidan av gjutna och tillbaka plattan till inkubatorn i 48 timmar. För att inrätta en T-cell samkultur resuspend lämpligt antal T-celler i 190 mikroliter av olämplig T-cell kultur, medium per brunn tills 12 väl-platta för att möjliggöra avlägsnande av cellkultur mediet kring agaros rösterna först.Sedan i såddkammaren, utan att ta bort sfäroiderna använda ett ljus mikroskop för att kontrollera om några sfäroider har varit aspirerade och hålla P200 lastade pipett ungefär en halv centimeter över varje gjutna försiktigt utsäde T-celler på rösterna i en droppvis sätt utan att rubba sfäroider. När alla avgjutningar har sådd försiktigt tillbaka plattan till cellkultur inkubatorn i 15 minuter innan du lägger till färska cellkultur medium kompletteras med fetala nötkreatur serum på utsidan av varje rösterna för ytterligare 48 timmars inkubation. För att bädda in 3D-co-kulturer i typ ett kollagen späda lager kollagen med serum fri bas medium till en slutlig arbetskoncentration på tre milligram per milliliter och lägga till 11 mikroliter av 10X PBS, tillsätt 1,2 mikroliter av en molar natriumhydroxid per 100 mikroliter av kollagen.Efter neutralisering av kollagenlösningen på is i en timme, ta bort cellodlingsmediet som omger och inom varje gjuten som visats. Tillsätt försiktigt det neutraliserade kollagenet en blandning till varje gjuten i en dropwise mode, och omedelbart tillbaka plattan till cellkulturen inkubatorn i fem minuter innan invertera plattan i ytterligare en timme i inkubationen. I slutet av inkubationen placera plattan höger sida upp i biosäkerhet huva och långsamt lägga till en fräsch cell kultur medium ner sidan av varje brunn.Sedan tillbaka plattan till cellkulturen inkubatorn i 48 timmar. För immunofluorescerande färgning av de inbäddade 3D-samkulturerna fixa varje hel agaros rösterna inklusive sfäroider i 5,4%formalin över natten vid rumstemperatur i en befuktad kammare. Nästa dag, ta bort formalin kring agaros rösterna och använda elegant spets pincett för att förstå hörnet av varje kollagen matris för att göra det möjligt för rösterna att skalas från såddkamrarna i en enda vätska rörelse.Placera varje kollagen lapp i en enda brunn av en åtta väl kammare glida och tillsätt 250 mikroliter av 0,5%octoxynol alla till varje brunn. Efter en timme i rumstemperatur ersätta okoxynol med 250 mikroliter av blockerande lösning. Efter en timme i rumstemperatur lägga till en 250 mikroliter av den primära antikropp cocktail av intresse för varje brunn och placera en bild i en mörk befuktad kammare över natten vid rumstemperatur.Nästa morgon ta bort den primära antikroppen från varje brunn och tvätta brunnarna tre gånger med 300 mikroliter IF buffert i fem minuter vid rumstemperatur per tvätt. Efter den sista tvätten, tillsätt en 250 mikroliter av olämplig sekundär antikroppslösning till varje brunn för en en timmes inkubation vid rumstemperatur skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen avlägsna antikroppen och tvätta varje prov tre gånger med IF buffert som påvisas.Efter den sista tvätten skölja proverna med 300 mikroliter PBS per brunn och försiktigt ta bort väggarna i kammaren slide. Så att endast glaset glida längst ner kvar. Lägg 200 mikroliter av monteringsmedium till glaset glida och försiktigt släppa locket glida på provet utan att skapa bubblor sedan lagra de monterade proverna i en mörk torr plats över natten innan avbildning av konfokal fluorescensmikroskopi Här typiska experimentella uppställningar för analyserna och de ger av representativa och analysbara prover i slutet av experimentet för varje protokoll kan observeras.Bädda in 3D-kulturen i typ ett kollagen inom mikro brunnarna i en agaros rösterna möjliggör övervakning och analys av invasionen av bild J.In denna analys av två primära murine, bukspottkörtelcancer celllinjer olika sfäroid former och invasiva beteenden observerades. Den första cellinje en visat en mer kompakt sfäroidbildning och taggiga invasion liknar den som observerats för encelliga invasioner. Medan den andra cellinjen bildade sfäroider som var mer lös och visade en kollektiv invasion mönster.Co-kultur kan utföras med två olika tumör klonurskelcell linjer seedade samtidigt eller med tumör och T-celler på tumör sfäroid bildas eller en efterföljande tumör T-cellens interaktion utvärderingar. För en detaljerad bedömning av invasiva beteendet immunofluorescent färgning och con focal imaging kan utföras i en hög genomströmning sätt. Den agarose rösterna tillåter inbäddning av hela 3D-kultur systemet i paraffin för seriell sectioning och immunohistokemi färgning för att kvantifiera det rumsliga förhållandet mellan tumör och T-celler.T-cells infiltration kan till exempel identifieras och karakteriseras av cellytans markörfärgning. Denna teknik gör det möjligt att analysera patientprover samt användning av stimulerande och blockerande läkemedel för att sond tumörcell T-cell interaktioner.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Analyser för att studera makrofager och mikroglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

En modell för Perineural invasion i huvud- och hals Skivepitelcancer

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

En snabb Filterinsats-baserad 3D Culture System för primär prostatacelldifferentiering

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ett protokoll för Rapid Post mortem Cell Culture av Diffus Intrinsic Pontine Gliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytta uppåt: Ett enkelt och flexibelt In Vitro tredimensionella Invasion Assay protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Terapi testning i sfäroid-baserat 3D Cell kultur modell för huvud och hals skivepitelcancer

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live-Cell Imaging analyser för studien Glioblastoma hjärnan tumören Stem cellmigration och Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-D cellodlingssystem för att studera Invasion och utvärdera Therapeutics i Cancer i urinblåsan

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...