Name: monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture
Uploaded: 2020-06-23T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture at JoVE.com

Biz Virginie Ory, Yararlı tartışmalar ve 3D co-kültür modelinin yaklaşımı hakkında tavsiyeler için Doktora teşekkür ederiz. Ayrıca IHC bölümleme ile mükemmel teknik yardım için Elizabeth Jones teşekkür ederiz. Bu çalışma, DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) yl (LI 2547/4-1) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden AW'ye (R01 CA231291), ATR'ye (R01 CA205632), GWP'ye (R01 CA218670) ve Kanser Merkezi'nin (P300000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000

Protokol boyunca sık kullanılan bazı sözcüklerin listesi ve açıklaması Ek Dosya 1'debulunabilir.
1. Küresel nesil
<ol><li>Hazırlamak ve otoklav 2% agarose 1x PBS (örneğin, 1 g agarose 50 mL 1x PBS) ve otoklav 35- ve 81-microwell kauçuk kalıplar. DİkKAT: IHC işleme için agarose dökümleri üretmek için düşük eriyen agarose kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Agarose dökümleri hazırlayın NOT: 35-microwell dökümleri invazyon, immünoresans (IF) ...

<ol>
	<li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elements+of+cancer+immunity+and+the+cancer-immune+set+point.">Elements of cancer immunity and the cancer-immune set point.</a> Nature. 541 (7637), 321-330 (2017).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+mechanisms+of+immune+checkpoint+therapy.">Dissecting the mechanisms of immune checkpoint therapy.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (2), 75-76 (2020).</li><li>Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+regulation+of+metastasis:+mechanistic+insights+and+therapeutic+opportunities.">Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities.</a> Disease Model Mechanisms. 11 (10), (2018).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> Journal of Cell Science. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).</li><li>xu, x., Farach-Carson, M. C., Jia, x. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+In+vitro+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+evaluation.">Three-dimensional In vitro tumor models for cancer research and drug evaluation.</a> Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).</li><li>Lamichhane, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulating+epithelial+tumor+microenvironment+In+vitro+using+three+dimensional+tri-culture+of+human+epithelial,+endothelial,+and+mesenchymal+cells.">Recapitulating epithelial tumor microenvironment In vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells.</a> BioMed Central Cancer. 16 (581), (2016).</li><li>Klimkiewicz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+tumour+angiogenic+microenvironment+to+monitor+hypoxia+effects+on+cell+interactions+and+cancer+stem+cell+selection.">A 3D model of tumour angiogenic microenvironment to monitor hypoxia effects on cell interactions and cancer stem cell selection.</a> Cancer Letters. 396, 10-20 (2017).</li><li>Cavo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironment+complexity+and+matrix+stiffness+regulate+breast+cancer+cell+activity+in+a+3D+In+vitro+model.">Microenvironment complexity and matrix stiffness regulate breast cancer cell activity in a 3D In vitro model.</a> Scientific Reports. 6, 35367 (2016).</li><li>Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+fluoresecent+imaging+approaches+for+drug+discovery+using+In+vitro+and+in+vivo+three-dimensional+models.">High throughput fluoresecent imaging approaches for drug discovery using In vitro and in vivo three-dimensional models.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (12), 1347-1361 (2015).</li><li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+tumor+spheroid+models+for+In+vitro+therapeutic+screening:+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained.">3D tumor spheroid models for In vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Scientific Reports. 11 (6), 19103 (2016).</li><li>Veelken, C., Bakker, G., Drell, D., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell-based+automated+quantification+of+therapy+responses+of+invasive+cancer+spheroids+in+organotypic+3D+culture.">Single cell-based automated quantification of therapy responses of invasive cancer spheroids in organotypic 3D culture.</a> Methods. 1 (128), 139-149 (2017).</li><li>Puls, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Novel+3D+Tumor-tissue+Invasion+Model+for+High-throughput,+High-content+Phenotypic+Drug+Screening.">Development of a Novel 3D Tumor-tissue Invasion Model for High-throughput, High-content Phenotypic Drug Screening.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13039 (2018).</li><li>Jenkins, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Profiling+of+PD-1+Blockade+Using+Organotypic+Tumor+Spheroids.">Ex Vivo Profiling of PD-1 Blockade Using Organotypic Tumor Spheroids.</a> Cancer Discovery. 8 (2), 196-215 (2018).</li><li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting.">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (105), (2015).</li><li>Shoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+and+their+crosstalk+with+endothelial+cells+in+3D+spheroids.">Tumor cells and their crosstalk with endothelial cells in 3D spheroids.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10428 (2017).</li><li>Giannattasio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+infiltration+of+human+NK+cells+in+in+vivo-like+tumor+spheroids.">Cytotoxicity and infiltration of human NK cells in in vivo-like tumor spheroids.</a> BioMed Central Cancer. 3 (15), 351 (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+migration+is+driven+by+a+few+trailblazer+cells+with+a+unique+molecular+signature+narrowly+confined+to+the+invasive+front.">Neural crest migration is driven by a few trailblazer cells with a unique molecular signature narrowly confined to the invasive front.</a> Development. 142 (11), 2014-2025 (2015).</li><li>Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpOT+the+Correct+Tissue+Every+Time+in+Multi-tissue+Blocks.">SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).</li><li>Brenner, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Letters. 155 (2), 199-205 (2000).</li><li>Farhat, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Extraction+from+Collagen+Gels+Using+Qiagen's+RNeasy+Kit.">RNA Extraction from Collagen Gels Using Qiagen's RNeasy Kit.</a> The Protocol Place. 2012, (2019).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720 (2011).</li></ol>

Burada sunulan yöntem, T-hücreleri, hücre bazlı fonksiyonel ve moleküler tahliller ile ortak kültür ve tek bir cihaz kullanarak izleme ve analiz olanakları çeşitli sağlar 3D tümör sfüzyon, açıklar. Yaklaşımımızın en büyük avantajı, 3B kültürünün ayrı bir tahlile aktarılmasını gerektirmemesi ve tahliller boyunca 3B kültürünün bütünlüğünü korumasıdır.
Burada sunulan iş akışı gerektiği gibi değiştirilebilir. Küresel formasyon, T-hücre ko-kült?...

Son on yılda kanser immünoterapi önemli gelişmelere rağmen, duyarlılık ve tedavilere direnç bizim mekanistik anlayış hala oldukça kötü1. Tümörlerin önemli heterojenite ler gösterdiği ve tümör hücrelerinin mikro çevrelerinin yanı sıra bağışıklık hücreleriyle olan dinamik etkileşimlerinin, etki tümör hücresi ölümü, invaziv davranış ve immünoterapi1,2,3içeren tedavilere yanıt verdiği iyi belirlenmiştir. Adaptif bağışıklık sisteminin bir kolu olarak, T-hücreleri hücreye özgü sitotoksisite yürütmek. T-hücre tanıma ve kanser hücrelerine yanıt analizi direnç ve bağışıklık modülatör tedavilere duyarlılık içine mekanistik anlayışlar sağlar.
In vitro modelleme ve uygun bir ortamda kanser ve T-hücreleri arasındaki etkileşimleri izleme zorlu olmuştur ve şimdiye kadar, sınırlı mekanistik anlayışlar sonuçlandı. Çoğu hücre tabanlı tahliller iki boyutlu (2D) ortama güveniyor, bu üç boyutlu (3D) in vivofizyolojisi4,5,6,yani uzamsal hücre etkileşimleri, ekstrasellüler matriks ile temas (ECM)7, dinamik metabolik talep, kitle büyüme nedeniyle artan hipoksi,ve tümör mikroçevre etkileri (TME) 9 özetlemek için kritik olan temel özellikleriyoksundur9 . Öte yandan, şu anda kullanılan üç boyutlu (3D) co-kültür ve işgal araştırma sistemleri ile eksiklikleri bir dizi hala vardır: (1) küresel nesil ve hasat zaman alıcı doğa5,10, (2) küresel boyutu üzerinde kontrol eksikliği, şekil ve hücre yoğunluğu11,12, (3) düşük iş letimat türü tahliller, (4) özel ekipman 13 için gereksinim13,14, (5) farklı tahliller için ayrı ortamlara ortak kültür aktarmak için ihtiyaç15,16,17. Özellikle, bir ortak kültür titreşme aktarımı genellikle küresel bozulma ve co-kültür bütünlüğünün kaybına yol açar. Bu özellikle azaltılmış hücre-hücre adezyonu ile "gevşek" küreseller için geçerlidir. Örneğin, en 3D işgali tahlilleri küresel ilk oluşumundan sonra hasat ve daha sonra ECM14,15,,16resuspended gerektirir. Bu resuspension adım küresel ler arasındaki mesafe üzerinde kontrol kaybına neden. Tümör spheroidleri arasındaki mesafe invaziv davranışlarını etkilediğiiçin, bu kontrol kaybı yüksek ara elekt varyans ayarı sağlar ve tekrarlanabilirliği azaltır. Ayrıca, periferik ve tümör sferoid infiltrasyon bağışıklık hücrelerinin değerlendirilmesi için ardışık santrifüj adımları ile hücre fraksiyonu tahlilleri uygulaması daha istikrarlı sferoidler oluşturmak tümör hücre popülasyonları ile sınırlıdır17.
Kavram ve yaklaşım
Yaklaşımımız, daha sonraki tahliller için küresel lerin transferini gerektirmeyen 3D spheroid ortak kültür modeli olan "Hepsi Bir Arada"— 3D spheroid eş kültür modelini kullanarak yukarıda belirtilen eksiklikleri gidermektedir. Kanser hücrelerinin invaziv davranışlarını ve eş kültürlü T hücrelerinin sitotoksisitesini eş zamanlı olarak izlemek için bir küresel oluşum cihazı (Bkz. Malzemeler Tablosu)uyarladık. Bu yöntem kullanıcı dostu, ucuz dur ve nispeten yüksek işlemli 3B ayarında hızlı ve kolay kullanım sağlar. Kullanılan cihazın türüne bağlı olarak, 81'e kadar büyük düzgün boyutlu sferoidler, tohumlanan hücre sayısını değiştirerek tek bir borulama adımında tek bir küresel boyut üzerinde kontrol ile oluşturulabilir. Sheroid oluşumu U şekilli dipleri ile iskele içermeyen agarose çok iyi dökümlerde gelişmiş hücre-hücre etkileşimleri tarafından zorlanır. Bu 3D sistemi dinamik hücre tabanlı fonksiyonel çalışmaların yanı sıra floresan aktif hücre ayrıştırma (FACS), immünororesans (IF) veya immünohistokimya (IHC) boyama ve bozulmamış 3B ortak kültürün gen ekspresyonu analizini içeren son nokta moleküler ve biyokimyasal tahliller için uyarladık.
Fonksiyonel çalışmalariçin, agarose içinde tip I kollajen katıştırma küresel ler eşit uzak küresel kanser hücrelerinin işgali ile sonuçlanır ve temel hücre hattı özgü özellikleri izleme izin verir, tek hücre vs kolektif hücre göçü gibi18,19. Ayrıca, kollajen matris kolayca agarose döküm ayrılır, birden fazla spheroidler içeren bir 1\u20122 mm kalınlığında yama ile sonuçlanan, daha fazla if boyama ve konfokal mikroskopi ile görüntüleme için işlenebilir. Bu, yüksek işlemli bir taramada farklı hücre istilası ve hücre-matris etkileşimlerini ortaya çıkarabilir. Ayrıca, kollajen matris hücreleri kollajen sindirim ve sonraki hücre ekimi veya analizi için tek hücreli ayrışma sonra izole edilebilir.
Spheroidlerin IHC analiziiçin, agarose döküm fiksasyonu ve kesitinden sonra, proteinler veya diğer ilgi molekülleri spheroidlerin coğrafi konumlarını korurken tespit edilebilir. Burada açıklanan yaklaşımda, küreseloidler doğrudan agarose döküm içinde Hidroksietil agarose işleme jel gömülü ve jel mikrowells altındaki küreseloidler korumak için bir "kapak" olarak hizmet vermektedir. Agarose döküm parafin gömme sonra20, seri yatay kesit başlangıç noktası olarak hizmet veren döküm alt ile yapılır.
Bu yaklaşım, Hidroksietil agarose işlemejeli 21'e gömmeden önce hücrelerin hasatını gerektiren küresel lerin konvansiyonel IHC kesiti ile tezat oluşturur ve böylece hücrelerin uzamsal düzenini kaybederek küreseloidlerin bozulması riski taşır. Ayrıca, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyon veya tümör sferoidler17 periferik kaldı olup olmadığını değerlendirmek için santrifüj ile hücre fraksiyonu doğrudan katıştırma ile önlenir.
Ayrıca, 3D co-kültür tümör, stromal veya bağışıklık hücreleri admixing ve böylece tümör hücre crosstalk çalışma veya endotel hücreleri ile co-kültürleri de dahil olmak üzere hücre-hücre etkileşimleri analiz etmek için farklı tümör mikroortamları recapitulating yapılabilir16.
Bu 3D küresel ortak kültür ayarı tümör mikroortamında bulunan farklı hücre tiplerinin ortak kültürünü gerçekleştirmek ve değiştirilmiş ECM elementlerinin etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Tip I kollajen yanı sıra, diğer ECM bileşenleri (örneğin, matrigel, matrigel / kollajen karışımları, fibronektin), tümör hücre invazyonu farklı substratların bolluğu etkilenir beri kullanılabilir22. Ayrıca, agarose döküm mikrowellleri primer hücre hatlarının küresel oluşumu ve düşük hücre-hücre adezyonu olan hücreler için uygundur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Petri Dishes</td>
			<td>Microtissues Inc</td>
			<td>Z764019 &#38; Z764051</td>
			<td>referred to as &#34;rubber molds&#34; in the protocols; 81-microwell &#38; 35-microwell molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well Chamber Slides</td>
			<td>Lab-Tek</td>
			<td>154534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose Type I, low EEO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-HRP conjugated secondary antibody</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>K4003</td>
			<td>ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>08-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type 4, 1 g</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11965092, 16000044</td>
			<td>referred to as &#34;cell culture medium&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris hematoxylin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SH30-500D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>referred to as &#34;Hydroxyethyl agarose processing gel&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H1399</td>
			<td>1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>486624</td>
			<td>1/200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-CD8 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>98941</td>
			<td>1/25 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rat anti-keratin 8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-I AB_531826</td>
			<td>1/500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>referred to as &#34;RNA extraction kit&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td>for T-cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610407</td>
			<td>referred to as &#34;Octoxynol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>referred to as &#34;guanidinium thiocyanate with phenol&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td>referred to as &#34;polysorbate 20&#34; in the protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TypLE</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12604013</td>
			<td>referred to as &#34;cell dissociation enzymes solution&#34; in the protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cancer cell invasion and t-cell cytotoxicity in 3d culture

Çok sayıda kanser tedaviye dirençli kalmasına rağmen, immünoterapi ile kanser tedavisinde önemli ilerleme kaydedilmiştir. Tahliller sınırlı sayıda tümör ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri doğrudan izleme ve mekanistik anlayışlar için izin, aralarında, T-hücreleri kanser hücrelerine adaptif bağışıklık sisteminin sitotoksik yanıt yürütülmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Çoğu tahliller kullanım bağıl kolaylığı nedeniyle hücrelerin iki boyutlu (2D) co-kültür dayanmaktadır ama invaziv büyüme fenotip sınırlı temsili ile, kanser hücrelerinin özelliklerinden biri. Mevcut üç boyutlu (3D) co-kültür sistemleri ya özel ekipman veya ortak kültürlü kanser hücrelerinin işgali ve t-hücreleri etkileşim için ayrı izleme gerektirir.
Burada eş-kültürde kanser hücresi küreseloidleri ve T-hücre sitotoksisitesi 3D invaziv davranışı izlemek için aynı anda bir yaklaşım açıklar. Speküoid oluşumu U şekilli dipleri ile iskele içermeyen agarose microwell dökümleri gelişmiş hücre-hücre etkileşimleri tarafından tahrik edilir. Tip I kollajen matris içine T-hücre co-kültür ve kanser hücresi invazyonu hücreleri aktarmak için gerek kalmadan agarose dökümmikrowells içinde gerçekleştirilir, böylece töz boyunca sağlam bir 3D co-kültür sistemi koruyarak. Kollajen matriks agarose döküm ayrılabilir, immünoresans için izin (IF) boyama ve hücrelerin konfokal görüntüleme için. Ayrıca, hücreler daha fazla büyüme için izole edilebilir veya gen ekspresyonu veya floresan aktif hücre sıralama (FACS) gibi analizlere tabi tutulabilir. Son olarak, 3D co-kültür katıştırma ve kesit sonra immünohistokimya (IHC) ile analiz edilebilir. Tgörünüşe olası değişiklikler ekstrasellüler matriks değiştirilmiş kompozisyonları içerir (ECM) yanı sıra kanser hücreleri ile farklı stromal veya bağışıklık hücrelerinin dahil.

3B ortak kültür modeli, Şekil 1A'dagösterilen ve gerektiğinde birleştirilebilen veya değiştirilebilen farklı tahliller sağlar. Yerleşik deneysel kurulumumuzda tümör ve T-hücreleri 2 gün boyunca birlikte kültürlenir ve invaziv ve/veya dirençli tümör hücrelerinin seçimi için invaziv tayini başlatılması nı takip eder(Şekil 1B). 4. günde invazyonun nicelliği gerçekleştirilir ve "kurtulan" hücreler kollajen matrisinden izole edilir ve...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture at JoVE.com

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Bu yöntemler 3D ayarda bağışıklık hücre aracılı tümör hücre sitotoksisitesi ve invaziv davranış içine mekanistik anlayışlar sağlayabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu 3D küresel eş kültür modelinin daha sonraki denemeler için küresel oidlerin transferini gerektirmemesidir. Bu prosedürü gösteren Apsra Nasir, bölümümüzden bir doktora öğrencisi olacaktır.Bir hücre kültürü başlık aseptik tekniği kullanarak küresel oluşturmak için kabarcıklar önlemek için özen bir 81 microwell kauçuk kalıp içine erimiş agarose 500 mikrolitre ekleyin. Agarose dikkatle 12 kuyu plaka bireysel kuyular içine agarose dökümleri dışarı pop kauçuk kalıp esnek olduğunda. Dökümleri dengelemek için her kuyuya %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 2,5 mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin ve plakayı bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.Kuluçka sonunda ilk çevredeki hücre kültürü ortamı kaldırmak için plaka eğim, daha sonra tohumlama odasında ve dikkatle her hücre tohumlama odasına damla tümör hücre süspansiyon için hazırlanan 190 mikrolitre tohum. Hücre kültüründe 15 dakikalık bir kuluçka dan sonra kuluçka makinesi 2,5 mililitre orta döküm dışında ekleyin ve 48 saat boyunca kuvöz için plaka dönmek. Bir T-hücre co-kültür kurmak için uygun sayıda T-hücre kurmak için uygun sayıda T-hücre uygunsuz T-hücre kültürünün 190 mikrolitre, iyi başına orta kadar 12 iyi plaka agarose döküm çevreleyen hücre kültürü ortamının kaldırılmasına izin vermek için ilk döküm.Daha sonra tohumlama odasında, küresel leri çıkarmadan herhangi bir küresel emişli olup olmadığını kontrol etmek için bir ışık mikroskobu kullanın ve her döküm üzerinde yaklaşık yarım santimetre p200 yüklü pipet tutarak dikkatle sheroidler ayrıştırma olmadan bir damla şeklinde dökümler üzerine T-hücreleri tohum. Tüm dökümler dikkatlice hücre kültürü kuluçka için plaka iade edildiğinde 15 dakika boyunca başka bir 48 saat kuluçka için her döküm dışında fetal sığır serum uymuş taze hücre kültürü orta eklemeden önce. Tip bir kollajen seyreltik stok kollajen mililitre başına üç miligram son çalışma konsantrasyonu ve 10X PBS 11 mikrolitre eklemek için tip bir kollajen seyreltik stok kollajen gömmek için, kollajen 100 mikrolitre başına bir molar sodyum hidroksit 1.2 mikrolitre ekleyin.Bir saat boyunca buz üzerinde kollajen çözeltisi nötralize ettikten sonra, hücre kültürü orta çevreleyen ve her döküm içinde gösterildiği gibi kaldırın. Dikkatle bir damla moda her döküm nötralize kollajen bir karışımı ekleyin ve hemen kuluçka ek bir saat için plaka ters önce beş dakika boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka döndü. Kuluçka sonunda biyogüvenlik başlık kadar plaka sağ tarafı yerleştirin ve yavaş yavaş her kuyunun yan aşağı taze bir hücre kültürü orta ekleyin.Sonra 48 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için plaka dönün. Gömülü 3D co-kültürlerin immünofloresan boyama için nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında bir gecede% 5.4 formalin küreseloidler de dahil olmak üzere her agarose döküm düzeltmek. Ertesi gün, agarose döküm çevreleyen formalin kaldırmak ve tek bir sıvı hareketi içinde tohumlama odalarından soyulmuş için dökümizin izin vermek için her kollajen matris köşesinde kavramak için şık ucu cımbız kullanın.Sekiz iyi oda slayt tek bir kuyu içine her kollajen yama yerleştirin ve her iyi için% 0.5 octoxynol 250 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında bir saat sonra tıkanan çözelti250 mikrolitre ile octoxynol değiştirin. Oda sıcaklığında bir saat sonra her kuyuya ilgi birincil antikor kokteyl 250 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında bir gecede koyu nemli bir odaya bir slayt yerleştirin.Ertesi sabah her kuyudan birincil antikor çıkarın ve yıkama başına oda sıcaklığında beş dakika boyunca IF tampon 300 mikrolitre ile kuyuları üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için her kuyuya 250 mikrolitre uygunsuz ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Kuluçka sonunda antikor çıkarın ve gösterildiği gibi IF tampon ile her örnek üç kez yıkayın.Son yıkamadan sonra numuneleri kuyu başına 300 mikrolitre PBS ile durula ve hazne deki slaytın duvarlarını dikkatlice çıkarın. Böylece sadece alttaki cam kaydırak kalır. Cam slayta 200 mikrolitre montaj ortamı ekleyin ve kabarcıkoluşturmadan kapak fişini dikkatlice numunenin üzerine bırakın sonra monte edilen numuneleri konfokal floresan mikroskobu ile görüntülemeden önce bir gecede karanlık kuru bir yerde saklayın Burada tahliller için tipik deneysel kurulumlar ve her protokol için deney sonunda temsili ve analiz edilebilir numuneler üretilebilir.Bir agarose döküm mikro kuyular içinde tip bir kollajen 3D kültürü gömme iki birincil murine bu analiz J.In görüntü ile invazyon izleme ve analizi sağlar, pankreas kanser hücre hatları farklı küresel şekiller ve invaziv davranışlar gözlenmiştir. İlk hücre hattı bir tek hücre invazyoniçin gözlenen benzer daha kompakt bir küresel oluşumu ve dikenli invazyon gösterdi. İkinci hücre hattı daha gevşek ve kolektif bir istila paterni gösteren küresel oluşturdu.Eş-kültür aynı anda tohumlu iki farklı tümör klonal hücre hatları ile veya tümör ve T-hücreleri tümör sferoid oluşumu veya sonraki tümör T-hücre etkileşimdeğerlendirmeleri üzerine yapılabilir. İnvaziv davranış immünüoresan boyama ve con fokal görüntüleme ayrıntılı bir değerlendirme için yüksek iş lenme şekilde yapılabilir. Agarose döküm tümör ve T-hücreleri arasındaki mekansal ilişkiyi ölçmek için seri kesit ve immünohistokimya boyama için parafin tüm 3D kültür sisteminin gömme sağlar.Örneğin, T-hücre infiltrasyonu tanımlanabilir ve hücre yüzey marker boyama ile karakterize. Bu teknik, tümör hücresi T-hücre etkileşimlerini araştırmak için hasta örneklerinin analizinin yanı sıra uyarıcı ve bloke edici ilaçların kullanılmasını sağlar.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Baş ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu içinde perinöral invazyon İçin Bir Model

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Primer Prostat Hücre Farklılaşma için hızlı Filtre Ekle tabanlı 3D Kültür Sistemi

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Baş ve boyun Skuamöz hücreli karsinom için bir küresel tabanlı 3D hücre kültür modelinde test terapi

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-b hücre kültür sistemi istila eğitim ve Mesane kanserinde tedavi değerlendirmek için

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...