Name: rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

ويعترف المؤلفون بإمكانية الوصول إلى مختبر الإشعاع الذي يوفره المعهد المضيف والمعهد البريطاني للنظائر المشعة. ويدعم مختبر PVS المركز الوطني للعلوم البيولوجية، معهد تاتا للبحوث الأساسية والمنح (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014؛ BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19؛ BT/PR25767/GET/119/151/2017) من وزارة التكنولوجيا الحيوية، حكومة الهند. النائب يعترف DBT البحوث المنتسبين، DBT، حكومة الهند.

1. إعداد 15٪ denaturing هلام بوليكريلاميد
<ol><li>وزن وإضافة 4.8 غرام من اليوريا، إضافة 3.75 مل من 40٪ أكريلاميد: البيسكريلاميد (19:1) حل و 1 مل من 10x TBE pH 8.2 في أنبوب 50 مل عقيمة.</li>
	<li>حل اليوريا باستخدام حمام مائي تعيين في 60 درجة مئوية في حل واضح.</li>
	<li>المكياج وحدة التخزين إلى 10 مل باستخدام المياه المعقمة الطا...

<ol>
	<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li><li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis.">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li><li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis.">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li><li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants.">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li><li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs.">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li><li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs.">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li><li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species.">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li><li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes.">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li><li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization.">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li><li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing.">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li></ol>

ويمكن استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للكشف عن الرنا الصغير وتحديد كمهاته بما في ذلك الرنا الرنا الأقل وفرة. البروتوكول يصف أساسا الخطوات ل denaturing مجموع الجيش الملكي النيبالي في مخزن التحميل العازلة ، وحجم الفصل بواسطة جل electrophoresis ، ونقل الجيش الملكي النيبالي إلى غشاء ، عبر ربط الجيش الم?...

الاكتشاف الأخير للرنا RNAs التنظيمية الصغيرة، microRNAs، قاد البحوث في فهمها ودورها في النباتات والحيوانات1. تتم معالجة السلائف الطويلة من miRNAs إلى 21 إلى 24 nt ناضجة miRNAs بواسطة HYL1 والبروتينات المحددة مثل dicer2,3. A 22 NT ميرنا يمكن أن تبدأ تتالي إسكات عن طريق توليد siRNAs الثانوية4. وقد أظهرت الدراسات دور ميرناس و siRNAs الثانوية في التنمية, الخلية مصير واستجابات الإجهاد5,6.
التهجين الشمالي هو طريقة تجريبية تستخدم بشكل روتيني للكشف عن جزيئات الحمض النووي الريبي محددة. هذا الأسلوب يخصص استخدامه في الكشف عن حوالي 19 -24 NT RNAs صغيرة طويلة من مجموعة من مجموع RNAs7. في هذه التظاهرة، ونحن توضيح استخدام هذه التقنية للكشف عن وكمية من miRNAs. وتستخدم هذه الطريقة وسم المجس باستخدام النظائر المشعة؛ وبالتالي، يمكن الكشف عن مستويات ميرنا في العينة مع زيادة الحساسية. على عكس الطرق القائمة على PCR، يضمن هذا الأسلوب تحديد كم التعبير وكذلك تحديد حجم miRNAs. في هذا البروتوكول، نعرض خطوات حاسمة لتحسين الكشف عن ميرنا. لقد قمنا بتعديل الخطوات في النشاف والتهجين للحصول على الكشف إشارة عالية الدقة من miRNAs. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية للكشف عن RNAs صغيرة أخرى الذاتية مثل RNAs، رنا فاسي الثانوية وsnoRNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide-bisacrylamide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>whatmann blotting paper I</td>
			<td>1001-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary loading tips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>2239915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+nylon membrane</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374792-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1211V79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7024-25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager</td>
			<td>GE- Typhoon scanner</td>
			<td>29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager screen and cassette</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, models: P20 and P10</td>
			<td>FA10002M, FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658003EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>27532501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20-548-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinwin</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transblot apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRAHyb hybridization buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>NEOLAB</td>
			<td>D-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas

MicroRNAs (miRNAs) هي فئة من غير ترميز أعرب عن الذات، ~ 21 NT RNAs صغيرة تشارك في تنظيم التعبير الجيني في كل من النباتات والحيوانات. معظم miRNAs بمثابة مفاتيح سلبية للتعبير الجيني التي تستهدف الجينات الرئيسية. في النباتات، يتم إنشاء النصوص miRNAs الأولية (pri-miRNAs) بواسطة بوليميراز RNA الثاني، وأنها تشكل أطوال متفاوتة من هياكل حلقة الجذعية مستقرة تسمى ما قبل ميرناس. و endonuclease، Dicer-مثل1، يعالج ما قبل ميرناس في ميرنا ميرنا * دوبليكس. يتم اختيار أحد الخيوط من ميرنا ميرنا * دوبليكس وتحميلها على بروتين Argonaute 1 أو homologs للتوسط في شق mRNAs الهدف. على الرغم من أن الجزيئات الرئيسية التي تشير إلى الإشارات miRNAs، غالبا ما يتم الكشف عنها من قبل أقل من الطرق المثلى القائمة PCR بدلا من تحليل البقعة الشمالية الحساسة. نحن وصف طريقة بسيطة وموثوقة، وحساسة للغاية الشمالية التي هي مثالية للكمية من مستويات ميرنا مع حساسية عالية جدا، حرفيا من أي نسيج نباتي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتأكيد حجم واستقرار ووفرة الـ miRNAs وسلائفها.

في هذه التظاهرة، لقد كشفنا وكميا التعبير عن miR397 في أنسجة مختلفة من رايس انديكا فار whiteponni (الشكل 1). miR397 هو 22 NT ميرنا والحفاظ عليها ميرنا. ويمكن الكشف عن التعبير عن miR397 في جميع العينات التي تم اختبارها. وفقا لبيانات تسلسل الجيل التالي، العينة 1 (أنسجة الشتلات) لديها miR3...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

يوضح هذا الأسلوب استخدام تقنية التهجين الشمالي للكشف عن الميرناس من إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي.

تحليل RNA لطخة للكشف عن و الكم من MicroRNAs النبات

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

مرحبًا بكم. إذن هذا بروتوكول شمالي صغير للـ(رنا) انها مشتقة بروتوكول الأمثل أصلا من قبل الدكتور رشيد Akbergenov.في هذه الطريقة، يمكن للمرء أن يكتشف RNA الصغيرة في أي مكان بين 20-24 النيوكليوتيد في الطول، بدقة شديدة وبدقة عالية جدا. البروتوكول هو في الأساس شكل معدل من التحليل الشمالي التقليدي ، ولكن هنا ، فإن نسبة الأكريلاميد مرتفعة جدًا ، فهي 15 في المائة. هذا شماليّ يستطيع كنت استعملت ل يكشف سابقا يعرف [رنا] صغيرة, إمّا ميكرو رنا أو أخرى مجموعة من [رنا] صغيرة, عندما التسلسل يكون عرفت أو هو يستطيع كنت استعملت ل تأكيد من وفرة من [رنا] صغيرة يأتي من جيل تالية تسلسل مجموعة بيانات.ميزة من هذه الطريقة هو أن, لا يمكن للمرء أن ننظر فقط في وفرة RNA الصغرى, ولكن أيضا وفرة من السلائف, على سبيل المثال قد يترك RNAs الصغيرة خارج السلائف التي هي حوالي 30 إلى قد يكون بضع مئات من النيوكليوتيدات طويلة, وهذا يمكن أيضا الكشف عنها في وقت واحد, جنبا إلى جنب مع الحمض النووي الريبي الصغير. البروتوكول بسيط جدا، على التوالي جدا إلى الأمام، ولكن يجب على المرء أن يكون حذرا جدا في حين إجراء بعض الخطوات الحاسمة التي ترد في نهاية هذا البروتوكول. لإعداد مزيج هلام 10 مل، إضافة 4.8 غرام من اليوريا، 3.75 مل من 40٪ محلول أكريلاميد، و 1 مل من 10X TBE الطازجة المعدة، pH 8.2 وخلط بلطف الحل.يُذوّب اليوريا تمامًا، عن طريق تسخين الخليط في حمام مائي، حتى يبدو المحلّل واضحًا. تشكل وحدة التخزين إلى 10 مل، وذلك باستخدام الماء معقمة MilliQ وتبريد مزيج هلام إلى درجة حرارة الغرفة. غسل الجهاز المطلوب مع المنظفات، فرك لهم بلطف لإزالة المتبقية TBE والأكريلاميد.مزيد من شطف لهم مع المياه MilliQ والسماح لها لتجف. تجميع لوحة زجاجية معا، وضمان كل منهما في نفس المستوى. وضعها بحزم على الاسفنج.إضافة 8 ميكرو لتر من TEMED و 80 لتر صغير من 10٪ APS أعدت طازجة لمزيج هلام. مزيج بلطف وصب مزيج هلام لوحات تجميعها. تأكد من أن الجل لا تسرب.ضع المشط بعناية. السماح للجل البلمرة لمدة 45 دقيقة تقريبا. بعد البلمرة من هلام، وإزالة لوحات الزجاج من الجمعية.اغسل الألواح الزجاجية بالماء ميليك. ووضعها في الكاسيت الجاري. ضع الكاسيت الجاري داخل الخزان.صب أعدت حديثا 1X TBE، pH 8.2. إزالة المشط بعناية. غسل آبار هلام جيدا عن طريق الأنابيب العازلة.هذه الخطوة يزيل الترسبات من اليوريا من البئر ويخفف RNA لتشغيل موحد عبر هلام. أغلق غطاء الجهاز وركض ما قبل الجل الفارغ عند 80 فولت لمدة 30 دقيقة ، للتحقق من وجود أي تسرب عازل. لإعداد 10 مل صبغة التحميل، تزن 5 ملغ من بروموفينول الأزرق، 5 ملغ من السيلين سيانول وإضافة 10 مل من فورماماميد deioinised وخلطها جيدا.Aliquot الصبغة وتخزينها في 4 درجة لمزيد من الاستخدام. Aliquot 10 ميكروغرام من مجموع RNA في أنابيب معقم 1.5 مل. تأكد من أن نوعية الجيش الملكي النيبالي، أي.نسبة 260:230 أكبر من أو أقرب إلى اثنين. وضع أنبوب داخل speedVac وفراغ الجافة العينات. إعادة تعليق عينات الحمض النووي الريبي المجفف في 8 ميكرو لتر من صبغة التحميل.سخني العينات على درجة حرارة 98 لمدة دقيقتين. تبريدها لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. دوامة عينات الحمض النووي الريبي المبردة لضمان إعادة تعليق السليم في صبغة التحميل.تدور الأنابيب. كرر خطوات التدفئة والتبريد ودوامة لمدة ثلاث مرات للحصول على RNA المتدفقة بحرية. أوقف الركض المسبق للجل.اغسل الآبار جيداً، قبل تحميل العينة، لإزالة رواسب اليوريا داخل الآبار. سخني عينات الحمض النووي الريبي التي أعيد تعليقها عند 98 درجة لدقيقة واحدة. تحميل العينات الساخنة في الآبار باستخدام نصائح شعرية.تجنب إدخال فقاعات الهواء. تحميل كامل لجميع العينات وتجميع الغطاء. تشغيل الجل في 80 فولت لمدة ثلاث ساعات أو حتى يعمل الأزرق بروموفينول تماما.استخدام غشاء النايلون المشحونة إيجابيا لنقل. قطعه لأبعاد لوحة زجاجية. تسمية الغشاء في الزاوية اليمنى العليا.ضع الغشاء بلطف على سطح المياه المعقمة MilliQ تأكد من وضع الجانب الملصق إلى الأسفل ، في مواجهة سطح الماء. خذ صينية نظيفة واحضر ساندويتش هلام لنقلها كهربائيا. ضع الجانب الرمادي من الكاسيت لأسفل.صب 1X TBE قليلا فوق مستوى كاسيت. قبل الرطب لوحة الألياف في 1X TBE والضغط عليه لإزالة فقاعات الهواء. قطع قطعتين من الورق النشاف إلى حجم وسادة الألياف.قبل الرطب قطعة من الورق النشاف في 1X TBE ووضعها على وسادة الألياف. إزالة فقاعات الهواء عن طريق المتداول ماصة بلاستيكية على الورق. قبل الرطب قطعة أخرى من الورق النشاف في 1X TBE ووضعها على الكاسيت.لفة أكثر لإزالة فقاعات الهواء. الآن إعداد ساندويتش جاهز للنقل الكهربائي. بعد الانتهاء من electrophoresis، ووقف تشغيل وإزالة الغطاء من الجهاز.قم بإزالة الكاسيت قيد التشغيل من الإعداد. أخرج اللوحات الزجاجية من الكاسيت الجاري. إزالة بعناية هلام من الجمعية.وضعها على ورقة النشاف بحيث أول عينة الحمض النووي الريبي تحميل نحو حقك. تراجع بلطف الغشاء قبل نقع في 1X TBE ووضعها على هلام، التي تواجه الجانب المسمى إلى أسفل. لا تسمح للغشاء والجل لتجف.لفة فوق بلطف لإزالة فقاعة الهواء. تراجع قطعة واحدة من الورق النشاف في 1X TBE ووضعها على الغشاء. إزالة فقاعات الهواء.وضع قطعة أخرى من الورق النشاف وإزالة فقاعات الهواء. إكمال شطيرة عن طريق وضع وسادة الألياف على الجمعية. أغلق الكاسيت بإحكام.ضع الكاسيت عبر لطخة في الوحدة النمطية. ملء خزان مع 1X TBE، pH 8.2، تصل إلى علامة النشاف. أغلق غطاء الجهاز ونقله عند 10 فولت بين عشية وضحاها عند 4 درجات أو في غرفة باردة.حافظ على وصلة الأشعة فوق البنفسجية عبر جاهزة وتعيينه إلى 1200، قبل الانتهاء من نقل الكهربائية. بعد الانتهاء من نقل، وإزالة كاسيت من وحدة. ضع الغشاء الرطب على ورقة A4، ووضع الجانب المميز لأعلى.عبر ربط الجيش الملكي النيبالي إلى الغشاء عن طريق التشعيع مع 254 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية في 120 مللي جول. ويمكن تخزين البقعة المترابطة عند أربع درجات أو استخدامها في التهجين. تصميم مسبار مجاني تماما لرنا الصغيرة التي يجب الكشف عنها.نهاية التسمية المسبار في انها خمسة نهاية رئيس باستخدام انزيم PNK والجمع بين المكونات كما هو مبين. احتضان خليط التفاعل في 37 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة من الحضانة استخدام G-25 أعمدة لفصل المسابير unlabeled من خليط التفاعل.لتحسين وضع العلامات للمسبار، قم بإعداد عمود G-25 قبل الاستخدام. وضع لطخة، الجانب RNA التي تواجه أعلى، داخل زجاجة التهجين. مزيج بقوة المخزن المؤقت التهجين قبل الاستخدام.إضافة 10 مل من العازلة التهجين داخل ووضع زجاجة التهجين داخل الفرن التهجين، والحفاظ على 35 درجة مع دوران. تنفيذ ما قبل التهجين لمدة 20 إلى 30 دقيقة. بعد ما قبل التهجين إزالة زجاجة من الفرن.إضافة التحقيق المسمى إلى المخزن المؤقت التهجين بلطف. تأكد من عدم خلق فقاعات الهواء. احتضان لطخة داخل الفرن في 35 درجة مع دوران لمدة 12 ساعة.بعد التهجين، قم بإزالة المخزن المؤقت التهجين من الزجاجة. قم بإجراء غسل سريع لللطخات، باستخدام مخزن الغسيل العازل I. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة حل التهجين الزائد من البقع.مزيد من احتضان البقع في 35 درجة لمدة 30 دقيقة باستخدام غسل العازلة I. قم بإجراء غسيل آخر باستخدام المخزن المؤقت-II في 35 درجة لمدة 30 دقيقة. بعد غسل البقعة، ضعها داخل غطاء التهجين، وإزالة العازلة الزائدة وختمه.وضعه داخل كاسيت ويعرضه على شاشة خالية من الإشعاع فوسفو- صور لمدة 12 ساعة. اكتشاف إشارة التهجين باستخدام صور الاعصار الجزيئي الحيوي وتحليل النتائج باستخدام برنامج ImageJ. لتهجين من البقعة مع تحقيقات أخرى، تنفيذ خطوات تجريد كما هو موضح.مع هذا تقنية واحدة يستطيع تقدير الوفرة من [رنا] دقيقة, [س] هو طول. من هذه الصورة، يمكن الكشف عن التعبير عن RNA 397 الصغرى في جميع العينات. في هذه البقعة ، وفرة عينة واحدة هو ما يقرب من 5 يقرأ في المليون ، وفقا لبيانات تسلسل الجيل القادم ، مما يشير إلى أن أسلوبنا يمكن الكشف عن أقل وفرة RNAs الصغيرة أيضا.بالإضافة إلى ذلك، باستخدام برنامج قياس الكم ImageJ، يمكن للمرء أن يحدد كمي التعبير عن 397 الدقيقة بين العينات. هنا استخدمنا U6 وMIcro RNA 168 كضوابط التحميل. وسوف أتحدث عن بعض الخطوات الحاسمة التي يجب النظر فيها أثناء تنفيذ التجربة.تأكد من استخدام RNA ذات نوعية جيدة لإعداد العينة. بينما فراغ تجفيف العينات، وتجنب أكثر من تجفيفها. إعادة تعليق الجيش الملكي النيبالي في صبغة التحميل أمر بالغ الأهمية.ضمان إعداد عينة التدفق الحر. يجب توخي الحذر أثناء تحميل الجل. يجب غسل آبار الجل ويجب تحميل العينة في خط مستقيم داخل الآبار.أثناء النقل الكهربائي، وانتشار الغشاء في الماء، قبل غمسه في 1X TBE أمر ضروري، فإنه يحسن النقل. التهجين من البقعة ينبغي كنت أنجزت في 35 درجات. الحفاظ على درجة حرارة الفرن التهجين.للاستخدام المتكرر لللطخات، يجب تخزين الأغشية عند 4 درجة. وينبغي أن تبقى رطبة في 2X SSE. وعلى عكس الطرق الأخرى القائمة على أساس PCR، فإن هذه الطريقة تضمن التحديد الكمي للتعبير، وكذلك تحديد حجم الرنا الرنا الصغير.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة لغير الترميز الصغيرة RNA الكمي

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

تصميم تجريبي ليزر تسليخ مجهري RNA تسلسل: دروس من تحليل التنمية الذرة ورقة

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

الأفقي جل الكهربائي للكشف عن تعزيز المجمعات البروتين رنا

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

إنتاجية عالية، وتحديد محتوى البروتين المحددة في مستويات الأنسجة باستخدام نقطة الكمية المطلقة لطخة تحليل (قدب)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

جمع الأنسجة الدهنية للماوس وتجهيزها لتحليل الحمض النووي الريبي

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...