Name: rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

作者承认宿主研究所和英国为放射性同位素提供的辐射实验室。PVS实验室由国家生物科学中心、塔塔基础研究所和赠款支持（BT/PR12394/AGIII/103/891/2014;BT/IN/瑞士/47/JGK/2018-19;BT/PR25767/GET/119/151/2017） 来自印度政府生物技术部。MP 承认印度政府 DBT 研究助理。

1. 制备15%变性聚丙烯酰胺凝胶
<ol><li>称重并加入4.8克尿素，加入3.75 mL的40%丙烯酰胺：双丙烯酰胺（19：1）溶液和1 mL的10x TBE pH 8.2放入无菌50 mL管中。</li>
	<li>使用 60°C 的水浴将尿素溶解成清晰的溶液。</li>
	<li>使用新鲜自功能开的无菌水将体积放大至 10 mL，将凝胶混合物冷却至室温。</li>
	<li>准备新鲜的 10%（w/v）铵硫酸盐溶液。</li>
</ol>2. 玻璃板和电泳装置的组装
<ol><li>用洗?...

<ol>
	<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li><li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis.">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li><li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis.">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li><li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants.">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li><li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs.">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li><li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs.">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li><li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species.">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li><li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes.">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li><li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization.">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li><li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing.">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li></ol>

该方法可广泛用于检测和定量小RNA，包括不太丰富的miRNA。该协议主要描述了在加载缓冲液中变性总RNA的步骤，通过凝胶电泳进行大小分离，将RNA转移到膜上，将RNA交叉链接到膜，并使用所需的放射性标记寡聚探针进行杂交。
任何印迹实验的关键步骤是使用优质RNA进行样品制备。在装载凝胶之前，必须确保样品自由流动，不要粘在装料尖端。装载样品时必须小心，尖端应插入...

最近发现的小型调控RNA，微RNA，已经领导了研究，了解它们及其在植物和动物中的作用1。miRNA的长前体由HYL1和特定的骰子样蛋白质2，3加工成21至24nt成熟的3miRNA。22 nt miRNA 可以通过生成二级 siRNA4启动级联沉默。研究表明，miRNA和二级siRNA在发育、细胞命运和压力反应5，6,中的作用。
北方杂交是一种常规用于检测特定RNA分子的实验方法。此方法自定义其在检测大约 19 -24 nt 长的小 RNA 从总 RNA7 的池中的使用。在此演示中，我们演示了该技术用于检测和定量 miRNA。该方法使用放射性同位素对探头进行标签标记;因此，可以提高灵敏度检测样品中的miRNA水平。与基于 PCR 的方法不同，此方法可确保表达式的量化以及 miRNA 的大小确定。在该协议中，我们展示改善miRNA检测的关键步骤。我们修改了印迹和杂交步骤，以获得 miRNA 的高分辨率信号检测。此技术还可用于检测其他内生小RNA，如 siRNA、tasi-辅助RNA 和 snoRNA。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide-bisacrylamide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>whatmann blotting paper I</td>
			<td>1001-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary loading tips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>2239915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+nylon membrane</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374792-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1211V79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7024-25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager</td>
			<td>GE- Typhoon scanner</td>
			<td>29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager screen and cassette</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, models: P20 and P10</td>
			<td>FA10002M, FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658003EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>27532501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20-548-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinwin</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transblot apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRAHyb hybridization buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>NEOLAB</td>
			<td>D-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas

MicroRNA （miRNA） 是一类内源性表达的非编码，±21 nt 小型RNA参与植物和动物基因表达的调控。大多数miRNA充当针对关键基因的基因表达的负开关。在植物中，原发性miRNA（原始miRNA）转录本由RNA聚合酶II生成，它们形成不同长度的稳定茎环结构，称为前miRNA。内核糖酶，像迪瑟一样1，将预米RNA处理成miRNA-miRNA*双工。从miRNA-miRNA* 双面的一股被选择并加载到Argonaute 1蛋白或其同源体上，以调解目标mRNA的裂解。虽然miRNA是关键信号分子，但它们的检测通常采用不太理想的基于PCR的方法，而不是敏感的北方印迹分析。我们描述了一种简单、可靠和极其敏感的北方方法，它非常适合从任何植物组织中对具有极高灵敏度的 miRNA 水平进行定量。此外，此方法可用于确认米RNA及其前体的尺寸、稳定性和丰度。

在本次演示中，我们检测并量化了miR397在稻谷白粉不同组织中的表现（图1）。 varmiR397 是一个 22 nt miRNA 和保存的 miRNA。可以在所有测试的样品中检测到miR397的表达。根据下一代测序数据，样本 1（幼苗组织）具有 miR397，每百万（rpm）读取 5 次。我们舒适地检测到其信号，表明该方法非常敏感，可用于检测甚至非常低的丰富的miRNA。在此实验中，我们使用 miR168 ?...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

此方法演示了利用北方杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。

用于植物微RNA检测和定量的RNA斑点分析

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

嘿，你好。所以这是一个小的RNA北方协议。它是最初由拉希德·阿克贝吉诺夫博士优化的协议的衍生物。在这种方法中，可以非常精确、非常高分辨率地检测长度在20-24核苷酸之间的小RNA。该协议基本上是一种传统的北方分析的修改形式，但在这里，丙烯酰胺的百分比相当高，是15%。当序列已知或可用于确认来自下一代测序数据集的小RNA丰度时，该北方可用于检测已知小RNA、微RNA或其他一组小RNA。这种方法的优点是，人们不能只看微RNA丰度，还可以看前体的丰度，例如微RNA可能留下一种前体，大约30到几百核苷酸长，这也可以同时检测，以及微RNA。该协议非常简单，非常直截了当，但在执行一些在协议末尾列出的关键步骤时，必须非常谨慎。对于制备 10 mL 凝胶混合物，加入 4.8 克尿素、3.75 mL 的 40% 丙烯酰胺溶液和 1 mL 新鲜制备的 10X TBE、pH 8.2 并轻轻混合溶液。完全溶解尿素，在水浴中加热混合物，直到溶液看起来清晰。将体积放大到 10 mL，使用无菌的 MilliQ 水，将凝胶混合物冷却至室温。用洗涤剂清洗所需的设备，轻轻擦洗，以去除残留的TBE和丙烯酰胺。进一步用 MilliQ 水冲洗，让其干燥。将玻璃板组装在一起，确保两者处于同一水平。把它们牢牢地放在海绵上。将 8 微升 TEMED 和 80 微升 10% 新鲜准备的 APS 添加到凝胶混合物中。轻轻混合，将凝胶混合物倒入组装的板中。确保凝胶不泄漏。小心地放置梳子。让凝胶聚合约 45 分钟。凝胶聚合后，从组件中取下玻璃板。用米利克水清洗玻璃板。把它们放在运行的盒式磁带。将运行盒放在油箱内。倒新准备的 1X TBE，pH 8.2。小心拆下梳子。通过移液缓冲液彻底清洗凝胶的孔。此步骤从井中去除尿素沉淀物，使 RNA 易于均匀地穿过凝胶。关闭设备盖，以 80 伏特预运行空凝胶 30 分钟，以检查是否有缓冲液泄漏。对于制备10 mL的装料染料，重5毫克的布罗莫酚蓝色，5毫克的二甲醇，并加入10 mL的去氧酰胺，并混合好。等分染料，储存在4度，供进一步使用。将总RNA的10微克分成无菌的1.5 mL管。确保RNA的质量，即260：230 比率大于或接近 2。将管子放在 speedVac 内，真空干燥样品。将干燥的RNA样品重新悬浮在8微升的装载染料中。将样品加热98度两分钟。在室温下冷却一分钟。涡流冷却的RNA样品，以确保在装载染料中正确重新悬浮。旋转管子。重复加热、冷却和涡流三次的步骤，获得自由流动的RNA。停止凝胶的预运行。在装载样品之前，彻底清洗油井，以清除井内尿素的沉积物。将重新悬浮的RNA样品在98度加热一分钟。使用毛细管尖端将热装样品放入井中。避免引入气泡。完成所有样品的装载并组装盖子。以 80 伏运行凝胶三小时，或直到布罗莫酚蓝色完全运行。使用带正带的尼龙膜进行传输。切入玻璃板的尺寸。在右上角标记膜。轻轻地将膜放在无菌 MilliQ 水的表面，确保将标签侧朝下，朝向水面。拿一个干净的托盘，并准备凝胶三明治进行电传输。放下盒式磁带的灰色面。倒 1X TBE 略高于盒式磁带的水平。在 1X TBE 中预湿纤维垫，然后挤压它以去除气泡。将两块印迹纸切成纤维垫的大小。在 1X TBE 中预润一张印迹纸，并放在纤维垫上。通过将塑料移液器滚动到纸张上，去除气泡。在 1X TBE 中预湿另一张印迹纸，然后放在盒式磁带上。滚过来去除气泡。现在三明治设置已准备好进行电传输。电泳完成后，停止运行，从设备上取下盖子。从设置中删除正在运行的盒式磁带。从运行盒中拿出玻璃板。小心地从组件中取下凝胶。将它放在印迹纸上，使第一个加载的RNA样本朝向您的右侧。将预浸泡膜轻轻浸入 1X TBE 中，并放在凝胶上，朝向标记的一侧朝下。不要让膜和凝胶干燥。轻轻翻滚以去除气泡。在1X TBE中浸入一张印迹纸，放在膜上。清除气泡。放置另一张印迹纸并清除气泡。通过将纤维垫放在组件上来完成三明治。牢牢合上盒式磁带。将跨印布盒放在模块中。向油箱加注 1X TBE，pH 8.2，高达印迹标记。关闭设备盖，在 4 度或冷室中以 10 伏电压通宵传输。在完成电传输之前，请准备好 UV 交叉链接器并将其设置为 1200。传输完成后，从模块中卸下盒式磁带。将湿膜放在 A4 片上，将标记的侧面向上放置。通过照射将RNA与膜交叉连接，以120毫焦耳照射254纳米紫外线。交链接的印迹可以储存在四度或用于杂交。设计一个完全与必须检测的小RNA完全互补的探针。使用 PNK 酶将探针的五个素端标记，并如图所示组合其成分。在37度下孵育反应混合物30分钟。孵育30分钟后，使用G-25柱将未标记的探头与反应混合物分离。为了改进探头的标签，请使用前准备 G-25 列。将污点、RNA 侧朝顶放在杂交瓶内。使用前大力混合杂交缓冲区。在杂交炉内加入10 mL的杂交缓冲液，将杂交瓶放入杂交炉内，旋转保持35度。执行 20 到 30 分钟的预杂交。预杂交后，将瓶子从烤箱中取出。轻轻地将标记的探针添加到杂交缓冲区中。确保未产生气泡。在35度下孵育烤箱内的污点，旋转12小时。杂交后，从瓶子中取出杂交缓冲液。使用洗涤缓冲器-I快速清洗印迹。执行此步骤以从印迹中删除多余的杂交解决方案。使用洗涤缓冲液-I，在35度下进一步孵育印迹30分钟。使用缓冲液-II在35度下再次进行洗涤30分钟。洗涤印迹后，将其放在杂交盖内，取出多余的缓冲液并密封。将其放在盒式磁带内，将其暴露在无辐射磷成像器屏幕上 12 小时。使用台风生物分子成像器检测杂交信号，使用 ImageJ 软件分析结果。对于将印迹与其他探头混合，请执行如图所示的剥离步骤。通过这项技术，可以估计微RNA的丰度，以及它的长度。从此图像中，可以在所有样品中检测到微RNA 397的表达。根据下一代测序数据，在这个印迹中，样本一的丰度大约是每百万次读取 5 次，这表明我们的技术也可以检测出不太丰富的微RNA。此外，通过使用 ImageJ 定量软件，可以量化样本中微397的表达。在这里，我们使用U6和微RNA168作为负载控制。我将讨论一些关键步骤，在进行实验时必须考虑。确保使用优质RNA进行样品制备。真空干燥样品时，避免过度干燥。在装载染料中重新悬浮RNA至关重要。确保准备自由流动的样品。装载凝胶时必须小心。必须清洗凝胶的孔，样品必须用一条直线装入井内。在电传输过程中，膜在水中扩散，在浸入1X TBE之前是必不可少的，它改善了传输。必须在 35 度下进行印迹的杂交。保持杂交炉的温度。对于反复使用印迹，膜必须储存在4度。它们应在 2X SSE 中保持潮湿。与其他基于PCR的方法不同，此方法可确保表达式的量化，以及确定微RNA的大小。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

高密度脂蛋白的分离的非编码小RNA定量

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

科研

生物化学

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

激光显微切割RNA测序实验设计：从玉米叶片发展的经验分析

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

对于高度纯化RNA的种子定量转录组分析的隔离中使用的有效方法

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

一种简单的分级提取方法，用于从单个样品中综合分析代谢物，脂质和蛋白质

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

水平凝胶电泳用于增强蛋白质 -  RNA复合物的检测

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

高通量, 用定量斑点杂交分析法绝对测定组织层中选定蛋白质的含量 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

小鼠脂肪组织的采集和 RNA 分析处理

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

哺乳动物基因翻译起始复合体形成的 Toeprinting 分析

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2在 1: 一步亲和纯化为蛋白质蛋白质和蛋白质代谢物的平行的分析

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

利用体外荧光共振能量转移研究毫秒时间尺度蛋白质配合物的动力学

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...