Name: rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

De auteurs erkennen de toegang tot stralingslab die door het gastinstituut en BRIT voor radio-isotoop wordt verstrekt. PVS laboratorium wordt ondersteund door National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) van het Department of Biotechnology, Regering van India. MP erkent DBT-Research Associateship, DBT, Regering van India.

1. Voorbereiding van een 15% denaturering polyacrylamide gel
<ol><li>Weeg en voeg 4,8 g ureum toe, voeg 3,75 mL acrylamide toe van 40% acrylamide: bisacrylamide (19:1) oplossing en 1 mL van 10x TBE pH 8.2 in een steriele 50 mL buis.</li>
	<li>Los het ureum op met een waterbad van 60 °C tot een duidelijke oplossing.</li>
	<li>Maak het volume op tot 10 mL met vers automatisch geautolaveerd steriel water en koel het gelmengsel af tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereid verse 10% (w/v) ammonium persulfate oplossing.</li>
<...

<ol>
	<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li><li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis.">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li><li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis.">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li><li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants.">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li><li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs.">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li><li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs.">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li><li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species.">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li><li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes.">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li><li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization.">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li><li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing.">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li></ol>

Deze methode kan op grote schaal worden gebruikt voor detectie en kwantificering van kleine RNAs, waaronder minder overvloedige miRNAs. Het protocol beschrijft voornamelijk de stappen voor het denatureren van het totale RNA in een laadbuffer, groottescheiding door gel elektroforese, overdracht van RNA naar een membraan, kruis-link het RNA op membraan en hybridiseren met behulp van de gewenste radiolabeled oligo sondes.
De cruciale stap voor elk blotting experiment is het gebruik van goede kwal...

De recente ontdekking van kleine regulerende RNAs, microRNAs, heeft geleid tot onderzoek in het begrijpen van hen en hun rol in planten en dieren1. Lange voorlopers van miRNAs worden verwerkt tot 21 tot 24 nt volwassen miRNAs door HYL1 en specifieke dicer-achtige eiwitten2,3. Een miRNA van 22 nt kan cascade-uitschakeling initiëren door secundaire siRNAs4te genereren. Studies hebben aangetoond dat de rol van miRNAs en secundaire siRNAs in ontwikkeling, cellot en stress reacties5,6.
Noordelijke hybridisatie is een experimentele methode die routinematig wordt gebruikt om specifieke RNA-moleculen te detecteren. Deze methode past het gebruik ervan aan bij de detectie van ongeveer 19-24 nt lange kleine RNAs uit een pool van totale RNAs7. In deze demonstratie illustreren we het gebruik van deze techniek voor de detectie en kwantificering van miRNAs. Deze methode maakt gebruik van de etikettering van sondes met behulp van radio-isotopen; zo kunnen miRNA-niveaus in het monster worden gedetecteerd met een verhoogde gevoeligheid. In tegenstelling tot pcr-gebaseerde methoden, deze methode zorgt voor kwantificering van de expressie, alsmede de grootte bepaling van de miRNAs. In dit protocol laten we cruciale stappen zien die de miRNA-detectie verbeteren. We hebben stappen in blotting en hybridisatie aangepast voor het verkrijgen van hoge resolutie signaaldetectie van miRNAs. Deze techniek kan ook worden gebruikt voor de detectie van andere endogene kleine RNAs zoals siRNAs, tasi-secundaire RNAs en snoRNAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide-bisacrylamide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>whatmann blotting paper I</td>
			<td>1001-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary loading tips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>2239915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+nylon membrane</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374792-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1211V79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7024-25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager</td>
			<td>GE- Typhoon scanner</td>
			<td>29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager screen and cassette</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, models: P20 and P10</td>
			<td>FA10002M, FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658003EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>27532501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20-548-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinwin</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transblot apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRAHyb hybridization buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>NEOLAB</td>
			<td>D-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas

MicroRNAs (miRNAs) zijn een klasse van endogene uitgedrukte niet-codering, ~ 21 nt kleine RNAs die betrokken zijn bij de regulering van genexpressie in zowel planten als dieren. De meeste miRNAs fungeren als negatieve schakelaars van genexpressie gericht op belangrijke genen. In planten worden primaire miRNAs (pri-miRNAs) transcripties gegenereerd door RNA polymerase II, en ze vormen verschillende lengtes van stabiele stam-lusstructuren genaamd pre-miRNAs. Een endonuclease, Dicer-like1, verwerkt de pre-miRNAs tot miRNA-miRNA* duplexen. Een van de strengen van miRNA-miRNA* duplex wordt geselecteerd en geladen op Argonaute 1-eiwit of de homologs ervan om het decolleté van doelmrnas te bemiddelen. Hoewel miRNAs belangrijke signaalmoleculen zijn, wordt hun detectie vaak uitgevoerd door minder dan optimale PCR-gebaseerde methoden in plaats van een gevoelige noordelijke vlekanalyse. We beschrijven een eenvoudige, betrouwbare en uiterst gevoelige noordelijke methode die ideaal is voor de kwantificering van miRNA-niveaus met een zeer hoge gevoeligheid, letterlijk van elk plantweefsel. Bovendien kan deze methode worden gebruikt om de grootte, stabiliteit en de overvloed aan miRNAs en hun precursoren te bevestigen.

In deze demonstratie hebben we de expressie van miR397 ontdekt en gekwantificeerd in verschillende weefsels van indica rijst var whiteponni (figuur 1). miR397 is een 22 nt miRNA en geconserveerd miRNA. De expressie van miR397 kan worden gedetecteerd in alle geteste monsters. Volgens de volgende generatie sequencing gegevens, monster 1 (zaailing weefsel) heeft miR397 op 5 leest per miljoen (rpm). We ontdekten het signaal comfortabel, wat aangeeft dat de methode zeer gevoelig...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Deze methode toont het gebruik van de noordelijke hybridisatie techniek om miRNAs te detecteren van de totale RNA extract.

RNA Blot Analyse voor de detectie en kwantificering van Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Hoi. Dit is een klein RNA noordelijk protocol. Het is een afgeleide van het protocol oorspronkelijk geoptimaliseerd door Dr.Rashid Akbergenov.In deze methode kan men kleine RNA's detecteren van ergens tussen 20-24 nucleotide in lengte, zeer nauwkeurig en bij zeer hoge resolutie. Het protocol is eigenlijk een gewijzigde vorm van traditionele noordelijke analyse, maar hier is het percentage acrylamide vrij hoog, het is 15 procent. Deze noordelijke kan worden gebruikt voor het opsporen van reeds bekende kleine RNA, hetzij micro RNA of andere set van kleine RNA, wanneer de sequentie bekend is of het kan worden gebruikt voor de bevestiging van overvloed van kleine RNA afkomstig van de volgende generatie sequencing datasets.Voordeel van deze methode is dat men niet alleen kan kijken naar micro RNA overvloed, maar ook de overvloed aan precursoren, bijvoorbeeld micro RNAs kan weglaten een voorloper die ongeveer 30 tot een paar honderd nucleotide lang kan zijn, dit kan ook gelijktijdig worden gedetecteerd, samen met de micro RNA. Het protocol is zeer eenvoudig, zeer rechttoe rechtaan, maar men moet zeer voorzichtig zijn tijdens het uitvoeren van een aantal kritische stappen die worden vermeld in het einde van dit protocol. Voeg voor de bereiding van 10 mL gelmix 4,8 gram ureum, 3,75 mL van 40%Acrylamide-oplossing en 1 mL vers bereide 10X TBE, pH 8.2 en meng de oplossing voorzichtig.Los ureum volledig op, door het mengsel in een waterbad te verwarmen, totdat de oplossing er helder uitziet. Maak het volume op tot 10 mL, gebruik steriel MilliQ water en koel het gelmengsel af tot kamertemperatuur. Was het benodigde apparaat met wasmiddel, schrob ze voorzichtig om resterende TBE en Acrylamide te verwijderen.Spoel ze verder af met MilliQ water en laat het drogen. Monteer de glasplaat samen, zorg ervoor dat beide op hetzelfde niveau zijn. Leg ze stevig op de spons.Voeg 8 micro liter TEMED en 80 micro liter 10% vers bereide APS toe aan de gelmix. Meng en giet de gelmix voorzichtig naar de geassembleerde platen. Zorg ervoor dat de gel niet lekt.Plaats de kam voorzichtig. Laat de gel ongeveer 45 minuten polymeriseren. Verwijder na de polymerisatie van de gel de glasplaten uit de montage.Was de glasplaten met MilliQ water. En plaats ze in de lopende cassette. Plaats de lopende cassette in de tank.Giet vers bereide 1X TBE, pH 8.2. Verwijder de kam voorzichtig. Was de putten van de gel grondig door de buffer te pipetten.Deze stap verwijdert neerslag van ureum uit de put en vergemakkelijkt het RNA om gelijkmatig over de gel te lopen. Sluit het deksel van het apparaat en voer de lege gel gedurende 30 minuten uit op 80 volt om te controleren op eventuele bufferlekkage. Voor de bereiding van 10 mL ladingkleurstof weegt u 5 mg bromofenolblauw, 5 mg xyleencyanol en voeg 10 mL gedeioiniseerde formamide toe en meng ze goed.Aliquot de kleurstof en op te slaan op 4 graden voor verder gebruik. Aliquot 10 microgram totaal RNA in steriele 1,5 mL buizen. Zorg ervoor dat de kwaliteit van het RNA, d.w.z.de verhouding 260:230 is groter dan of dichter bij twee. Plaats de buis in een speedVac en vacuüm droog de monsters. Schort de gedroogde RNA-monsters opnieuw op in 8 microliter ladingskleurstof.Verwarm de monsters op 98 graden gedurende twee minuten. Koel ze voor een minuut op kamertemperatuur. Vortex de gekoelde RNA monsters om een goede re-schorsing in de lading kleurstof te garanderen.Draai aan de buizen. Herhaal de stappen van verwarming, koeling en vortex voor drie keer voor het krijgen van vrij stromend RNA. Stop de pre-run van de gel.Was de putten grondig, voordat u het monster laadt, om afzettingen van de ureum in de putten te verwijderen. Verwarm de opnieuw opgehangen RNA-monsters op 98 graden gedurende een minuut. Laad de monsters heet in de putten met capillaire tips.Vermijd de invoering van luchtbellen. Volledige belasting van alle monsters en monteer het deksel. Laat de gel drie uur lang op 80 volt lopen of tot het bromofolblauw volledig loopt.Gebruik positief geladen nylon membraan voor de overdracht. Snijd het aan de afmetingen van de glasplaat. Label het membraan in de rechterbovenhoek.Plaats het membraan voorzichtig op het oppervlak van steriel MilliQ-water en zorg ervoor dat u de etiketzijde naar beneden plaatst, met uitzicht op het wateroppervlak. Neem een schone lade en bereiden gel sandwich voor electro transfer. Plaats de grijze kant van de cassette naar beneden.Giet 1X TBE iets boven het niveau van de cassette. Maak het vezelpad voor nat in 1X TBE en knijp erin om luchtbellen te verwijderen. Snijd twee stukken blotting papier ter grootte van vezel pad.Maak een stuk blottingpapier voor in 1X TBE en leg het over het vezelpad. Verwijder luchtbellen door het rollen van een plastic pipet over het papier. Voorweten een ander stuk blotting papier in 1X TBE en leg het over de cassette.Rol om om luchtbellen te verwijderen. Nu is de sandwich setup klaar voor electro transfer. Na voltooiing van de elektroforese, stop de run en verwijder het deksel van het apparaat.Verwijder de lopende cassette uit de setup. Haal de glasplaten uit de lopende cassette. Verwijder de gel voorzichtig uit de montage.Leg het over de blotting papier zodanig dat de eerste geladen RNA monster is naar rechts. Dompel het voorweekte membraan voorzichtig onder in 1X TBE en plaats het over de gel, met de gelabelde zijkant naar beneden. Laat het membraan en de gel niet drogen.Rol voorzichtig om luchtbel te verwijderen. Dompel een stuk blotting papier in 1X TBE en leg het over het membraan. Verwijder luchtbellen.Plaats een ander stuk blotting papier en verwijder de luchtbellen. Maak de sandwich compleet door het vezelpad over de montage te leggen. Sluit de cassette stevig.Plaats de trans-vlek cassette in de module. Vul de tank met 1X TBE, pH 8.2, tot aan de blotting merk. Sluit het deksel van het apparaat en breng 's nachts op 10 volt bij 4 graden of in een koude kamer.Houd de UV-kruis linker klaar en zet het op 1200, net voor de voltooiing van de elektrooverdracht. Verwijder na voltooiing van de overdracht de cassette uit de module. Plaats het vochtige membraan op een A4-vel en plaats de gemarkeerde zijde naar boven.Kruis het RNA met het membraan door bestraling met 254 nanometer UV-licht op 120 milli joules. De kruisgebonden vlek kan worden opgeslagen op vier graden of worden gebruikt voor hybridisatie. Ontwerp een sonde die volledig gratis is voor het kleine RNA dat moet worden gedetecteerd.Einde label van de sonde op het vijf prime end met behulp van PNK enzym en combineren de componenten zoals afgebeeld. Incubeer het reactiemengsel op 37 graden gedurende 30 minuten. Na 30 minuten incubatie gebruik G-25 kolommen om niet-gelabelde sondes te scheiden van het reactiemengsel.Voor een betere etikettering van de sonde moet u de G-25-kolom voor gebruik voorbereiden. Plaats de vlek, RNA kant naar boven gericht, in een hybridisatie fles. Meng de hybridisatiebuffer krachtig voor gebruik.Voeg 10 mL hybridisatiebuffer binnen toe en plaats de hybridisatiefles in de hybridisatieoven, houd op 35 graden met rotatie. Voer pre-hybridisatie uit gedurende 20 tot 30 minuten. Haal na de voorverbridering de fles uit de oven.Voeg de gelabelde sonde voorzichtig toe aan de hybridisatiebuffer. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Incubeer de vlek in de oven op 35 graden met rotatie gedurende 12 uur.Verwijder na hybridisatie de hybridisatiebuffer uit de fles. Voer een snelle wasbeurt van de vlekken, met behulp van wasbuffer-I. Deze stap wordt uitgevoerd om overtollige hybridisatieoplossing uit de vlekken te verwijderen.Verder incubeer de vlekken op 35 graden gedurende 30 minuten met behulp van wasbuffer-I. Voer een andere was met behulp van buffer-II op 35 graden gedurende 30 minuten. Na het wassen van de vlek, plaats het in een hybridisatie deksel, verwijder overtollige buffer en verzegelen.Plaats het in een cassette en bloot te stellen aan een stralingsvrije fosfo-imager scherm voor 12 uur. Detecteer het hybridisatiesignaal met behulp van tyfoon biomoleculaire imager en analyseer de resultaten met behulp van ImageJ software. Voor hybridisatie van de vlek met andere sondes voert u strippensstappen uit zoals afgebeeld.Met deze techniek kan men de overvloed aan micro-RNA schatten, evenals zijn lengte. Uit deze afbeelding kan expressie van micro RNA 397 worden gedetecteerd in alle monsters. In deze vlek, de overvloed van monster een is ongeveer 5 leest per miljoen, volgens de volgende generatie sequencing gegevens, wat suggereert dat onze techniek kan detecteren minder overvloedige micro RNAs ook.Bovendien kan men met behulp van ImageJ kwantificeringssoftware de expressie van micro 397 onder de monsters kwantificeren. Hier hebben we U6 en micro RNA 168 gebruikt als laadregelaars. Ik zal het hebben over een aantal cruciale stappen die moeten worden overwogen tijdens het uitvoeren van het experiment.Zorg ervoor dat u RNA van goede kwaliteit gebruikt voor de voorbereiding van het monster. Tijdens het vacuüm drogen van de monsters, vermijd dan drogen. Re-schorsing van RNA in de lading kleurstof is van cruciaal belang.Zorg ervoor dat u een vrij stromend monster voorbereidt. Let op bij het laden van de gel. De putten van de gel moeten worden gewassen en het monster moet in een rechte lijn in de putten worden geladen.Tijdens de elektrooverdracht is het verspreiden van het membraan in water, vlak voordat het in 1X TBE dompelt essentieel, het verbetert de overdracht. De hybridisatie van de vlek moet worden uitgevoerd op 35 graden. Houd de temperatuur van de hybridisatieoven in stand.Voor herhaald gebruik van de vlekken moeten membranen worden opgeslagen op 4 graden. Ze moeten vochtig worden gehouden in 2X SSE. In tegenstelling tot andere PCR-gebaseerde methoden, deze methode zorgt voor kwantificering van de uitdrukking, evenals de bepaling van de grootte van de micro RNAs.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolatie van lipoproteïnen met hoge dichtheid voor niet-coderende RNA kwantificering Klein

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel Electroforese voor Verbeterde Detectie van Proteïne-RNA Complexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

High Throughput, Absolute bepaling van het gehalte van een geselecteerde eiwit op weefsel niveaus met behulp van kwantitatieve Dot analyse (QDB) van de vlek

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Muis adipeus weefsel verzameling en verwerking voor RNA analyse

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...