Name: rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

Die Autoren bestätigen den Zugang zum Strahlenlabor des Gastinstituts und BRIT für Radioisotope. PVS-Labor wird unterstützt vom National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research und Stipendien (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) vom Department of Biotechnology, Government of India. MP erkennt DBT-Research Associateship, DBT, Regierung von Indien.

1. Herstellung eines 15% denaturierenden Polyacrylamid-Gels
<ol><li>4,8 g Harnstoff wiegen und hinzufügen, 3,75 ml 40% Acrylamid: Bisacrylamid (19:1) Lösung und 1 ml 10x TBE pH 8,2 in ein steriles 50 ml-Rohr geben.</li>
	<li>Den Harnstoff mit einem bei 60 °C eingestellten Wasserbad in eine klare Lösung auflösen.</li>
	<li>Make-up das Volumen auf 10 ml mit frisch autoklaviertem sterilem Wasser und kühlen Sie die Gelmischung auf Raumtemperatur.</li>
	<li>Bereiten Sie frische 10% (w/v) Ammoniumpersulfatlösung vor.<...

<ol>
	<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li><li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis.">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li><li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis.">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li><li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants.">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li><li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs.">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li><li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs.">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li><li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species.">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li><li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes.">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li><li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization.">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li><li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing.">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li></ol>

Diese Methode kann ausgiebig für die Detektion und Quantifizierung kleiner RNAs einschließlich weniger reichlich vorhandener miRNAs verwendet werden. Das Protokoll beschreibt hauptsächlich die Schritte zur Denaturierung der gesamten RNA in einem Ladepuffer, Größentrennung durch Gelelektrophorese, Übertragung von RNA auf eine Membran, Vernetzung der RNA auf Membran und Hybridisierung mit gewünschten radioaktiv markierten Oligosonden.
Der entscheidende Schritt für jedes Blotting-Experime...

Die jüngste Entdeckung kleiner regulatorischer RNAs, microRNAs, hat die Forschung dazu geführt, sie und ihre Rolle bei Pflanzen und Tieren zu verstehen1. Lange Vorläufer von miRNAs werden von HYL1 und spezifischen dicer-ähnlichen Proteinen2,3zu 21 bis 24 nt reifen miRNAs verarbeitet. Eine 22 nt miRNA kann Kaskaden-Silencing initiieren, indem sekundäre siRNAs4generiert wird. Studien haben die Rolle von miRNAs und sekundären siRNAs bei der Entwicklung, dem Zellschicksal und den Stressreaktionen5,6gezeigt.
Die Nordhybridisierung ist eine experimentelle Methode, die routinemäßig zum Nachweis bestimmter RNA-Moleküle eingesetzt wird. Diese Methode passt ihre Verwendung bei der Erkennung von ca. 19 -24 nt langen kleinen RNAs aus einem Pool von RNAsinsgesamt 7an. In dieser Demo veranschaulichen wir den Einsatz dieser Technik zur Detektion und Quantifizierung von miRNAs. Bei dieser Methode werden Sonden mit Radioisotopen gekennzeichnet; daher können miRNA-Spiegel in der Probe mit erhöhter Empfindlichkeit nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu PCR-basierten Methoden gewährleistet diese Methode die Quantifizierung der Expression sowie die Größenbestimmung der miRNAs. In diesem Protokoll zeigen wir entscheidende Schritte zur Verbesserung der miRNA-Erkennung. Wir haben Schritte in Derblotting und Hybridisierung modifiziert, um eine hochauflösende Signalerkennung von miRNAs zu erhalten. Diese Technik kann auch für den Nachweis anderer endogener kleiner RNAs wie siRNAs, tasi-sekundäre RNAs und snoRNAs verwendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide-bisacrylamide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>whatmann blotting paper I</td>
			<td>1001-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary loading tips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>2239915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+nylon membrane</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374792-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1211V79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7024-25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager</td>
			<td>GE- Typhoon scanner</td>
			<td>29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager screen and cassette</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, models: P20 and P10</td>
			<td>FA10002M, FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658003EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>27532501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20-548-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinwin</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transblot apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRAHyb hybridization buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>NEOLAB</td>
			<td>D-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse endogen exprimierter nicht-kodierender, 21 nt kleiner RNAs, die an der Regulierung der Genexpression sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren beteiligt sind. Die meisten miRNAs fungieren als negative Schalter der Genexpression, die auf Schlüsselgene abzielen. In Pflanzen werden primäre miRNAs (pri-miRNAs) Transkripte durch RNA-Polymerase II erzeugt und bilden unterschiedliche Längen stabiler Stammschleifenstrukturen, die als pre-miRNAs bezeichnet werden. Eine Endonuklease, Dicer-like1, verarbeitet die pre-miRNAs zu miRNA-miRNA*-Duplexen. Einer der Stränge aus miRNA-miRNA* Duplex wird ausgewählt und auf das Argonaute 1-Protein oder dessen Homologe geladen, um die Spaltung von Ziel-mRNAs zu vermitteln. Obwohl miRNAs wichtige Signalmoleküle sind, wird ihre Detektion oft mit weniger als optimalen PCR-basierten Methoden anstelle einer empfindlichen Nordfleckanalyse durchgeführt. Wir beschreiben eine einfache, zuverlässige und extrem empfindliche nordeuropäische Methode, die ideal für die Quantifizierung von miRNA-Spiegeln mit sehr hoher Empfindlichkeit ist, buchstäblich aus jedem Pflanzengewebe. Zusätzlich kann diese Methode verwendet werden, um die Größe, Stabilität und die Fülle von miRNAs und ihren Vorläufern zu bestätigen.

In dieser Demonstration haben wir die Expression von miR397 in verschiedenen Geweben von Indica-Reis var whiteponni nachgewiesen und quantifiziert (Abbildung 1). miR397 ist eine 22 nt miRNA und konservierte miRNA. Die Expression von miR397 kann in allen getesteten Proben nachgewiesen werden. Gemäß den Sequenzierungsdaten der nächsten Generation hat Probe 1 (Seedling Tissue) miR397 bei 5 Lesevorgängen pro Million (rpm). Wir haben sein Signal bequem erkannt, was darauf hi...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Diese Methode demonstriert die Verwendung der nördlichen Hybridisierungstechnik, um miRNAs aus dem gesamten RNA-Extrakt zu detektieren.

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Hallo. Dies ist also ein kleines RNA-Nordprotokoll. Es ist ein Derivat des Protokolls, das ursprünglich von Dr.Rashid Akbergenov optimiert wurde.Bei dieser Methode kann man kleine RNAs von 20-24 Nukleotid in der Länge, sehr präzise und mit sehr hoher Auflösung erkennen. Das Protokoll ist im Grunde eine modifizierte Form der traditionellen Nordanalyse, aber hier ist der Acrylamidanteil ziemlich hoch, er liegt bei 15 Prozent. Dieser Norden kann zum Nachweis bereits bekannter kleiner RNA, entweder Mikro-RNA oder anderer kleiner RNA verwendet werden, wenn die Sequenz bekannt ist, oder es kann zur Bestätigung der Fülle kleiner RNA verwendet werden, die aus Sequenzierungsdatensätzen der nächsten Generation stammt.Der Vorteil dieser Methode besteht darin, dass man nicht nur die Mikro-RNA-Fülle betrachten kann, sondern auch die Fülle von Vorläufern, z.B. Mikro-RNAs können einen Vorläufer auslassen, der etwa 30 ist, um ein paar hundert Nukleotid lang zu sein, dies kann auch gleichzeitig erkannt werden, zusammen mit der Mikro-RNA. Das Protokoll ist sehr einfach, sehr geradlinig, aber man muss sehr vorsichtig sein, während man einige kritische Schritte ausführt, die am Ende dieses Protokolls aufgeführt sind. Zur Herstellung der 10 ml Gelmischung 4,8 g Harnstoff, 3,75 ml 40%Acrylamidlösung und 1 ml frisch zubereitete 10X TBE, pH 8,2 hinzufügen und die Lösung vorsichtig mischen.Harnstoff vollständig auflösen, indem man die Mischung in einem Wasserbad erhitzt, bis die Lösung klar aussieht. Machen Sie das Volumen auf 10 ml, mit sterilem MilliQ-Wasser und kühlen Sie die Gelmischung auf Raumtemperatur. Waschen Sie das benötigte Gerät mit Reinigungsmittel, schrubben Sie sie vorsichtig, um Reste VonBE und Acrylamid zu entfernen.Spülen Sie sie weiter mit MilliQ-Wasser ab und lassen Sie es trocknen. Montieren Sie die Glasplatte zusammen, stellen Sie sicher, dass beide auf dem gleichen Niveau sind. Legen Sie sie fest auf den Schwamm.Fügen Sie 8 Mikroliter TEMED und 80 Mikroliter 10% frisch zubereiteten APS in die Gelmischung. Mischen und gießen Sie die Gelmischung sanft auf die montierten Platten. Stellen Sie sicher, dass das Gel nicht austritt.Legen Sie den Kamm vorsichtig. Lassen Sie das Gel ca. 45 Minuten polymerisieren. Entfernen Sie nach der Polymerisation des Gels die Glasplatten aus der Baugruppe.Waschen Sie die Glasplatten mit MilliQ-Wasser. Und legen Sie sie in die laufende Kassette. Legen Sie die lauflaufende Kassette in den Tank.Frisch zubereitet 1X TBE, pH 8,2 gießen. Entfernen Sie den Kamm vorsichtig. Waschen Sie die Brunnen des Gels gründlich, indem Sie den Puffer pipetieren.Dieser Schritt entfernt Harnstoffausscheidungen aus dem Brunnen und erleichtert die RNA, gleichmäßig über das Gel zu laufen. Schließen Sie den Deckel des Geräts und führen Sie das leere Gel 30 Minuten lang bei 80 Volt vor, um pufferleckage zu überprüfen. Zur Herstellung von 10 ml Ladefarbstoff 5 mg Bromphenolblau, 5 mg Xylolcyanol wiegen und 10 ml deioinisiertes Formamid hinzufügen und gut vermischen.Aliquot den Farbstoff und speichern bei 4 Grad für die weitere Verwendung. Aliquot 10 Mikrogramm gesamter RNA in sterile 1,5 ml-Röhren. Stellen Sie sicher, dass die Qualität der RNA, d.h.das Verhältnis 260:230 ist größer oder näher an zwei. Legen Sie das Rohr in eine SpeedVac und Vakuum trocknen Sie die Proben. Die getrockneten RNA-Proben in 8 Mikroliter Ladefarbstoff wieder aufhängen.Die Proben bei 98 Grad zwei Minuten erhitzen. Kühlen Sie sie für eine Minute bei Raumtemperatur. Wirbeln Sie die gekühlten RNA-Proben, um eine ordnungsgemäße Wiedersuspension im Ladefarbstoff zu gewährleisten.Drehen Sie die Rohre. Wiederholen Sie die Schritte des Erhitzens, Kühlens und Wirbels dreimal, um frei fließende RNA zu erhalten. Beenden Sie die Vorlauf des Gels.Waschen Sie die Brunnen gründlich, vor dem Verladen der Probe, um Ablagerungen des Harnstoffs in den Brunnen zu entfernen. Erhitzen Sie die wieder suspendierten RNA-Proben bei 98 Grad für eine Minute. Die Proben mit Kapillarspitzen heiß in die Brunnen laden.Vermeiden Sie das Einführen von Luftblasen. Komplette Beladung aller Proben und Montage des Deckels. Führen Sie das Gel bei 80 Volt für drei Stunden oder bis das Bromphenol blau vollständig läuft.Verwenden Sie positiv geladene Nylonmembran für den Transfer. Schneiden Sie es auf die Abmessungen der Glasplatte. Beschriften Sie die Membran in der rechten oberen Ecke.Legen Sie die Membran vorsichtig auf die Oberfläche des sterilen MilliQ-Wassers und stellen Sie sicher, dass sie die Etikettenseite nach unten mit Blick auf die Wasseroberfläche aufstellt. Nehmen Sie ein sauberes Tablett und bereiten Gel-Sandwich für Elektro-Transfer. Legen Sie die graue Seite der Kassette nach unten.Gießen Sie 1X TBE leicht über dem Niveau der Kassette. Das Faserpad in 1X TBE vorbefeuchten und drücken, um Luftblasen zu entfernen. Schneiden Sie zwei Stücke Blotpapier auf die Größe der Faserpad.Ein Stück Blotting-Papier in 1X TBE vorbefeuchten und über das Faserpad legen. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie eine Kunststoffpipette über das Papier rollen. Ein weiteres Stück Blotting-Papier in 1X TBE vorbefeuchten und über die Kassette legen.Überrollen, um Luftblasen zu entfernen. Jetzt ist das Sandwich-Setup bereit für den Elektrotransfer. Nach Abschluss der Elektrophorese den Lauf stoppen und den Deckel aus dem Gerät entfernen.Entfernen Sie die laufende Kassette aus dem Setup. Nehmen Sie die Glasplatten aus der laufenden Kassette heraus. Entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Baugruppe.Legen Sie es über das Blotting-Papier, so dass die erste geladene RNA-Probe zu Ihrer Rechten ist. Tauchen Sie die vorgetränkte Membran vorsichtig in 1X TBE und legen Sie sie über das Gel, mit Blick auf die beschriftete Seite nach unten. Lassen Sie die Membran und das Gel nicht trocknen.Rollen Sie vorsichtig über, um Luftblase zu entfernen. Tauchen Sie ein Stück Blotpapier in 1X TBE und legen Sie es über die Membran. Entfernen Sie Luftblasen.Legen Sie ein weiteres Stück Blotting-Papier und entfernen Sie die Luftblasen. Vervollständigen Sie das Sandwich, indem Sie das Faserpad über die Baugruppe legen. Schließen Sie die Kassette fest.Legen Sie die Trans-Blot-Kassette in das Modul. Füllen Sie den Tank mit 1X TBE, pH 8,2, bis zur Blotting-Marke. Schließen Sie den Deckel des Geräts und übertragen Sie bei 10 Volt über Nacht bei 4 Grad oder in einem kalten Raum.Halten Sie den UV-Kreuzlinker bereit und stellen Sie ihn kurz vor Abschluss des Elektrotransfers auf 1200 ein. Entfernen Sie nach Abschluss der Übertragung die Kassette aus dem Modul. Legen Sie die feuchte Membran auf ein A4-Blatt und platzieren Sie die markierte Seite nach oben.Kreuzen Sie die RNA mit der Membran durch Bestrahlung mit 254 Nanometer UV-Licht bei 120 Milli Joule. Der vernetzte Fleck kann bei vier Grad gelagert oder zur Hybridisierung verwendet werden. Entwerfen Sie eine Sonde, die völlig komplementär zu der kleinen RNA ist, die nachgewiesen werden muss.Beenden Sie die Sonde am fünf Hauptende mit PNK-Enzym und kombinieren Sie die Komponenten wie gezeigt. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 37 Grad für 30 Minuten. Nach 30 Minuten Inkubation verwenden Sie G-25-Säulen, um unbeschriftete Sonden vom Reaktionsgemisch zu trennen.Für eine verbesserte Kennzeichnung der Sonde bereiten Sie die G-25-Säule vor dem Gebrauch vor. Legen Sie den Fleck, RNA-Seite nach oben, in eine Hybridisierungsflasche. Mischen Sie den Hybridisierungspuffer vor der Verwendung kräftig.Fügen Sie 10 ml Hybridisierungspuffer innen und legen Sie die Hybridisierungsflasche in den Hybridisierungsofen, halten Sie bei 35 Grad mit Rotation. Führen Sie die Vorhybridisierung für 20 bis 30 Minuten durch. Nach der Vorhybridisierung die Flasche aus dem Ofen nehmen.Fügen Sie den beschrifteten Prüfpunkt vorsichtig in den Hybridisierungspuffer ein. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen entstehen. Inkubieren Sie den Fleck im Ofen bei 35 Grad mit Rotation für 12 Stunden.Entfernen Sie nach der Hybridisierung den Hybridisierungspuffer aus der Flasche. Führen Sie eine schnelle Wäsche der Flecken, mit Waschpuffer-I. Dieser Schritt wird ausgeführt, um überschüssige Hybridisierungslösung aus den Blots zu entfernen.Die Flecken 30 Minuten lang mit Waschpuffer-I bei 35 Grad weiter bebrüten. Führen Sie eine weitere Wäsche mit Puffer-II bei 35 Grad für 30 Minuten. Nach dem Waschen des Flecks, legen Sie es in eine Hybridisierungsabdeckung, entfernen Sie überschüssigepuffer und versiegeln Sie es.Legen Sie es in eine Kassette und setzen Sie es 12 Stunden lang einem strahlungsfreien Phospho-Imager-Bildschirm aus. Erkennen Sie das Hybridisierungssignal mit dem biomolekularen Imager des Taifuns und analysieren Sie die Ergebnisse mit der ImageJ-Software. Führen Sie für die Hybridisierung des Blots mit anderen Sonden Strippingschritte durch, wie dargestellt.Mit dieser Technik kann man die Fülle der Mikro-RNA abschätzen, sowie ihre Länge. Aus diesem Bild kann die Expression von Micro-RNA 397 in allen Proben nachgewiesen werden. In diesem Blot beträgt die Fülle der Stichprobe eine etwa 5 Lesevorgänge pro Million, wie pro Sequenzierungsdaten der nächsten Generation, was darauf hindeutet, dass unsere Technik auch weniger reichliche Mikro-RNAs erkennen kann.Darüber hinaus kann man mit Hilfe der ImageJ-Quantifizierungssoftware die Expression von Micro 397 unter den Proben quantifizieren. Hier haben wir U6 und micro RNA 168 als Ladesteuerungen verwendet. Ich werde über einige entscheidende Schritte sprechen, die bei der Durchführung des Experiments berücksichtigt werden müssen.Achten Sie darauf, gute RNA-Qualität für die Probenvorbereitung zu verwenden. Vermeiden Sie beim Vakuumtrocknen der Proben eine Übertrocknung. Eine Erneutsuspension der RNA im Ladefarbstoff ist entscheidend.Stellen Sie sicher, dass Sie eine frei fließende Probe vorbereiten. Beim Beladen des Gels ist Vorsicht geboten. Die Brunnen des Gels müssen gewaschen und die Probe in einer geraden Linie in die Brunnen geladen werden.Während der Elektroübertragung ist die Verteilung der Membran in Wasser, kurz vor dem Eintauchen in 1X TBE, wichtig, es verbessert den Transfer. Die Hybridisierung des Blots muss bei 35 Grad erfolgen. Halten Sie die Temperatur des Hybridisierungsofens aufrecht.Für die wiederholte Verwendung der Flecken müssen Membranen bei 4 Grad gelagert werden. Sie sollten in 2X SSE feucht gehalten werden. Im Gegensatz zu anderen PCR-basierten Methoden stellt diese Methode die Quantifizierung des Ausdrucks sowie die Bestimmung der Größe der Mikro-RNAs sicher.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Forschung

Biochemie

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimentelles Design für Laser Mikrodissektion RNA-Seq: Lehren aus einer Analyse von Maisblattentwicklung

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Eine effiziente Methode zur Isolierung von Highly Purified RNA aus Samen für die Verwendung in Quantitative Transkriptomanalyse

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horizontale Gel-Elektrophorese zur verbesserten Nachweis von Protein-RNA-Komplexen

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Maus Fettgewebe Erhebung und Verarbeitung für die RNA-Analyse

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: Affinitätsreinigung für die parallele Analyse von Protein-Protein und Protein-Metabolit komplexe in einem Schritt

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...