Name: rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner tilgangen til strålingslab levert av vertsinstituttet og BRIT for radioisotop. PVS-laboratoriet støttes av National Center for Biological Sciences, Tata Institute for Fundamental Research and grants (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/Swiss/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) fra Institutt for bioteknologi, Regjeringen i India. MP anerkjenner DBT-Research Associateship, DBT, regjeringen i India.

1. Utarbeidelse av en 15% denaturing polyakrylamid gel
<ol><li>Vei og tilsett 4,8 g urea, tilsett 3,75 ml 40 % akrylamid: bisakrylamid (19:1) oppløsning og 1 ml 10x TBE pH 8.2 i et sterilt 50 ml rør.</li>
	<li>Løs opp urea ved hjelp av et vannbad satt til 60 °C i en klar oppløsning.</li>
	<li>Sminke volumet til 10 ml ved hjelp av nyautoklavt sterilt vann og avkjøl gelblandingen til romtemperatur.</li>
	<li>Forbered frisk 10% (w / v) ammonium persulfat løsning.</li>
</ol>2. Montering av glas...

<ol>
	<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li><li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis.">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li><li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis.">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li><li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants.">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li><li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs.">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li><li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs.">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li><li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species.">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li><li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes.">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li><li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization.">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li><li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing.">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li></ol>

Denne metoden kan brukes mye til deteksjon og kvantifisering av små RNA-er, inkludert mindre rikelig miRNAer. Protokollen beskriver hovedsakelig trinnene for å denaturere den totale RNA i en lasting buffer, størrelse separasjon av gel elektroforese, overføring av RNA til en membran, kryss-koble RNA på membran og hybridisere ved hjelp av ønskede radiomerkede oligo prober.
Det kritiske trinnet for ethvert blottingeksperiment er bruk av RNA av god kvalitet for prøveforberedelse. Før du la...

Den nylige oppdagelsen av små regulatoriske RNA-er, microRNAs, har ledet forskning i å forstå dem og deres rolle i planter og dyr1. Lange forløpere av miRNAs behandles i 21 til 24 nt modne miRNAs av HYL1 og spesifikke terninger-lignende proteiner2,3. En 22 nt miRNA kan starte kaskade deaktivering ved å generere sekundære siRNAs4. Studier har vist rollen som miRNAs og sekundære siRNAs i utvikling, celle skjebne og stress svar5,6.
Northern hybridization er en eksperimentell metode rutinemessig ansatt for å oppdage spesifikke RNA molekyler. Denne metoden tilpasser bruken ved påvisning av ca. 19 -24 nt lange små RNA-er fra et utvalg av totalt RNA7. I denne demonstrasjonen illustrerer vi bruken av denne teknikken for deteksjon og kvantifisering av miRNAer. Denne metoden bruker merking av sonder ved hjelp av radioisotoper; MiRNA-nivåene i prøven kan derfor oppdages med økt følsomhet. I motsetning til PCR-baserte metoder sikrer denne metoden kvantifisering av uttrykk samt størrelsesbestemmelse av miRNAer. I denne protokollen viser vi viktige trinn som forbedrer miRNA-deteksjon. Vi har endret trinn i blotting og hybridisering for å oppnå høyoppløselig signaldeteksjon av miRNAer. Denne teknikken kan også brukes til påvisning av andre endogene små RNA-er som siRNA-er, tasi-sekundære RNA-er og snoRNAer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide-bisacrylamide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>whatmann blotting paper I</td>
			<td>1001-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary loading tips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>2239915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+nylon membrane</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374792-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1211V79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7024-25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager</td>
			<td>GE- Typhoon scanner</td>
			<td>29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager screen and cassette</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, models: P20 and P10</td>
			<td>FA10002M, FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658003EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>27532501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20-548-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinwin</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transblot apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRAHyb hybridization buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>NEOLAB</td>
			<td>D-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas

MicroRNAs (miRNAs) er en klasse av endogene uttrykt ikke-koding, ~ 21 nt små RNAs involvert i regulering av genuttrykk i både planter og dyr. De fleste miRNAer fungerer som negative brytere av genuttrykk rettet mot viktige gener. I planter genereres primære miRNAs (pri-miRNAs) transkripsjoner av RNA polymerase II, og de danner varierende lengder av stabile stem-loop strukturer kalt pre-miRNAs. En endonuclease, Dicer-lignende1, behandler pre-miRNAs i miRNA-miRNA * duplekser. En av trådene fra miRNA-miRNA* duplex er valgt og lastet på Argonaute 1 protein eller dets homologer for å megle spalting av mål mRNAs. Selv om miRNAer er viktige signalmolekyler, utføres deres deteksjon ofte av mindre enn optimale PCR-baserte metoder i stedet for en sensitiv nordlig blotanalyse. Vi beskriver en enkel, pålitelig og ekstremt følsom nordlig metode som er ideell for kvantifisering av miRNA-nivåer med svært høy følsomhet, bokstavelig talt fra ethvert plantevev. I tillegg kan denne metoden brukes til å bekrefte størrelsen, stabiliteten og overfloden av miRNAer og deres forløpere.

I denne demonstrasjonen har vi oppdaget og kvantifisert uttrykket av miR397 i forskjellige vev av indica ris var whiteponni (Figur 1). miR397 er en 22 nt miRNA og bevart miRNA. Uttrykket miR397 kan oppdages i alle testede prøver. I henhold til neste generasjons sekvenseringsdata har prøve 1 (frøplantevev) miR397 på 5 leser per million (turtall). Vi oppdaget signalet komfortabelt, noe som indikerer at metoden er svært følsom og kan brukes til å oppdage selv svært lav...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Denne metoden demonstrerer bruk av den nordlige hybridiseringsteknikken for å oppdage miRNAer fra totalt RNA-ekstrakt.

RNA Blot Analyse for deteksjon og kvantifisering av plante microRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

hei der. Så dette er en liten RNA nordlig protokoll. Det er et derivat av protokollen opprinnelig optimalisert av Dr.Rashid Akbergenov.I denne metoden kan man oppdage småRNA-er hvor som helst mellom 20-24 nukleotid i lengde, veldig presist og med svært høy oppløsning. Protokollen er i utgangspunktet en modifisert form for tradisjonell nordlig analyse, men her er prosentandelen av akrylamid ganske høy, den er 15 prosent. Denne nordlige kan brukes til å oppdage allerede kjent liten RNA, enten mikro RNA eller andre sett med små RNA, når sekvensen er kjent eller den kan brukes til bekreftelse av overflod av små RNA som kommer fra neste generasjon sekvensering datasett.Fordelen med denne metoden er at man ikke bare kan se på mikro RNA overflod, men også overflod av forløpere, for eksempel mikro RNA kan utelate en forløper som er rundt 30 til kan være noen hundre nukleotid lang, dette kan også oppdages samtidig, sammen med mikro RNA. Protokollen er veldig enkel, veldig rett frem, men man må være svært forsiktig mens du utfører noen kritiske skritt som er oppført på slutten av denne protokollen. For fremstilling av 10 ml gelblanding, tilsett 4,8 gram urea, 3,75 ml 40% akrylamidoppløsning og 1 ml nylaget 10X TBE, pH 8,2 og bland forsiktig oppløsningen.Oppløs urea helt, ved å varme blandingen i et vannbad, til løsningen ser klar ut. Gjør opp volumet til 10 ml, ved hjelp av sterilt MilliQ vann og avkjøl gelblandingen til romtemperatur. Vask det nødvendige apparatet med vaskemiddel, skrubb dem forsiktig for å fjerne gjenværende TBE og Akrylamid.Skyll dem ytterligere med MilliQ-vann og la det tørke. Sett sammen glassplaten, sørg for at begge er på samme nivå. Plasser dem godt på svampen.Tilsett 8 mikro liter TEMED og 80 mikro liter 10% nylaget APS til gelblandingen. Bland forsiktig og hell gelblandingen til de monterte platene. Pass på at gelen ikke lekker.Plasser kammen forsiktig. La gelen polymerisere i ca. 45 minutter. Etter polymerisering av gelen, fjern glassplatene fra enheten.Vask glassplatene med MilliQ-vann. Og plasser dem i løpekassetten. Plasser løpekassetten inne i tanken.Hell nylaget 1X TBE, pH 8.2. Fjern kammen forsiktig. Vask gelens brønner grundig ved å pipe til bufferen.Dette trinnet fjerner utfellinger av urea fra brønnen og letter RNA til å løpe jevnt over gelen. Lukk lokket på apparatet og forhåndsdrevne den tomme gelen på 80 volt i 30 minutter, for å se etter bufferlekkasje. For fremstilling av 10 ml lasting fargestoff, veie 5 mg bromophenol blå, 5 mg xylen cyanol og tilsett 10 ml deioinisert formamid og bland dem godt.Aliquot fargestoffet og lagre på 4 grad for videre bruk. Aliquot 10 mikrogram totalt RNA i sterile 1,5 ml rør. Pass på at kvaliteten på RNA, det vil si260:230-forholdet er større enn eller nærmere to. Plasser røret inne i en speedVac og støvsug tørke prøvene. Re-suspendere de tørkede RNA-prøvene i 8 mikro liter lasting fargestoff.Varm prøvene ved 98 grader i to minutter. Avkjøl dem i ett minutt ved romtemperatur. Vortex de avkjølte RNA-prøvene for å sikre riktig re-suspensjon i lastefargen.Spinn rørene. Gjenta trinnene for oppvarming, kjøling og vortex i tre ganger for å få gratis flytende RNA. Stopp førkjøringen av gelen.Vask brønnene grundig, før du laster prøven, for å fjerne forekomster av urea inne i brønnene. Varm opp de re-suspenderte RNA-prøvene ved 98 grader i ett minutt. Last prøvene varmes opp i brønnene ved hjelp av kapillære spisser.Unngå å innføre luftbobler. Fullfør lasting av alle prøvene og monter lokket. Kjør gelen på 80 volt i tre timer eller til bromofenolblå går helt.Bruk positivt ladet nylonmembran for overføringen. Klipp den til dimensjonene på glassplaten. Merk membranen øverst til høyre.Plasser membranen forsiktig på overflaten av sterilt MilliQ-vann, sørg for å plassere etikettsiden nedover, vendt mot vannoverflaten. Ta et rent brett og lag gelsandwich for elektrooverføring. Plasser den grå siden av kassetten ned.Hell 1X TBE litt over nivået på kassetten. Før den ytr fibreputen i 1X TBE og klem den for å fjerne luftbobler. Klipp to stykker blotting papir til størrelsen på fiber pad.Forfukt et stykke blotting papir i 1X TBE og plasser den over fiberputen. Fjern luftbobler ved å rulle en plastpipette over papiret. Forfukt et annet stykke blotting papir i 1X TBE og legg den over kassetten.Rull over for å fjerne luftbobler. Nå er sandwichoppsettet klart for elektrooverføring. Etter ferdigstillelse av elektroforesen, stopp løpet og fjern lokket fra apparatet.Fjern løpekassetten fra oppsettet. Ta ut glassplatene fra løpekassetten. Fjern gelen forsiktig fra enheten.Legg den over blotting papiret slik at den første ladde RNA prøven er mot høyre. Dypp forsiktig den forfuktede membranen i 1X TBE og legg den over gelen, vendt mot den merkede siden ned. Ikke la membranen og gelen tørke.Rull forsiktig over for å fjerne luftboblen. Dypp ett stykke blotting papir i 1X TBE og legg den over membranen. Fjern luftbobler.Legg et annet stykke blotting papir og fjerne luftbobler. Fullfør smørbrødet ved å legge fiberputen over enheten. Lukk kassetten godt.Plasser trans-blot kassetten i modulen. Fyll tanken med 1X TBE, pH 8.2, opp til blottingmerket. Lukk lokket på apparatet og overfør på 10 volt over natten ved 4 grader eller i et kaldt rom.Hold UV-krysskoblingen klar og sett den til 1200, like før ferdigstillelse av elektrooverføring. Når overføringen er fullført, fjerner du kassetten fra modulen. Plasser den fuktige membranen på et A4-ark, og plasser den merkede siden oppover.Kryss-koble RNA til membranen ved bestråling med 254 nanometer UV-lys på 120 milli joule. Den krysskoblede flekken kan lagres på fire grader eller brukes til hybridisering. Design en sonde som er helt gratis for den lille RNA som må oppdages.Avslutt etiketten sonden på sin fem prime end ved hjelp av PNK enzymet og kombinere komponentene som vist. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 grader i 30 minutter. Etter 30 minutter med inkubasjon bruk G-25 kolonner for å skille umerkede sonder fra reaksjonsblandingen.For bedre merking av sonden, klargjør G-25-kolonnen før bruk. Plasser flekken, RNA-siden vendt toppen, inne i en hybridiseringsflaske. Bland hybridiseringsbufferen kraftig før bruk.Legg til 10 ml hybridiseringsbuffer inne og plasser hybridiseringsflasken inne i hybridiseringsovnen, vedlikehold ved 35 grader med rotasjon. Utfør pre-hybridisering i 20 til 30 minutter. Etter pre-hybridisering fjerne flasken fra ovnen.Legg den merkede sonden forsiktig i hybridiseringsbufferen. Kontroller at luftbobler ikke opprettes. Inkuber blot inne i ovnen ved 35 grader med rotasjon i 12 timer.Etter hybridisering fjerner du hybridiseringsbufferen fra flasken. Utfør en rask vask av blots, ved hjelp av vaskebuffer-I. Dette trinnet utføres for å fjerne overflødig hybridiseringsløsning fra flekkene.Ytterligere inkubere blots ved 35 grader i 30 minutter ved hjelp av vaskebuffer-I. Utfør en ny vask ved hjelp av buffer-II ved 35 grader i 30 minutter. Etter vask av flekken, legg den inne i et hybridiseringsdeksel, fjern overflødig buffer og forsegle den.Plasser den inne i en kassett og utsett den for en strålingsfri fosfo-imagerskjerm i 12 timer. Oppdag hybridiseringssignalet ved hjelp av tyfonbiomolekylær imager og analyser resultatene ved hjelp av ImageJ-programvaren. For hybridisering av flekken med andre sonder, utfør stripping trinn som illustrert.Med denne teknikken kan man anslå overflod av mikro RNA, samt det er lengde. Fra dette bildet kan uttrykk for mikro RNA 397 oppdages i alle prøvene. I denne flekken er overfloden av prøve en ca. 5 leser per million, i henhold til neste generasjons sekvenseringsdata, noe som tyder på at vår teknikk også kan oppdage mindre rikelig mikro-RNA.I denne flekken er overfloden av prøve én ca. 5 leser per million, i henhold til neste generasjons sekvenseringsdata, noe som tyder på at vår teknikk også kan oppdage mindre rikelig mikro-RNA-er.I tillegg, ved hjelp av ImageJ kvantifisering programvare, kan man kvantifisere uttrykket av micro 397 blant prøvene. Her har vi brukt U6 og micro RNA 168 som lastekontroller. Jeg vil snakke om noen viktige skritt som må vurderes mens du utfører eksperimentet.Sørg for å bruke RNA av god kvalitet for prøveklargjøring. Mens vakuum tørking prøvene, unngå over tørking dem. Re-suspensjon av RNA i lasting fargestoff er kritisk.Sørg for å forberede en gratis flytende prøve. Det må tas hensyn til når du laster gelen. Brønnene i gelen må vaskes og prøven må lastes i en rett linje inne i brønnene.Under elektrooverføringen er spredning av membranen i vann, like før du dypper den i 1X TBE viktig, det forbedrer overføringen. Hybridiseringen av blot må utføres ved 35 grader. Opprettholde temperaturen på hybridiseringovnen.For gjentatt bruk av blots må membraner lagres ved 4 grader. De bør holdes fuktige i 2X SSE. I motsetning til andre PCR-baserte metoder sikrer denne metoden kvantifisering av uttrykket, samt bestemmelse av størrelsen på mikro-RNAene.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Isolering av high-density lipoproteiner for Non-koding små RNA Kvantifisering

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimental Design for Laser mikrodisseksjon RNA-Seq: Lærdommer fra en analyse av Mais Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraksjonert ekstraksjonsmetode for den omfattende analysen av metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese for forbedret deteksjon av protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Musen fettvev samling og bearbeiding for RNA analyse

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse av oversettelse innvielsen komplekse formasjon på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...