Name: rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

Yazarlar radyoizotop için ev sahibi enstitü ve BRIT tarafından sağlanan radyasyon laboratuvarına erişim kabul. PVS laboratuvarı Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi, Tata Temel Araştırma Enstitüsü ve hibeler tarafından desteklenir (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/IN/İsviçre/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü'nden. MP DBT-Araştırma Associateship, DBT, Hindistan Hükümeti kabul eder.

1. %15 denaturing poliakrilamid jelin hazırlanması
<ol><li>Tartmak ve üre 4.8 g ekleyin, % 40 akrilamid 3.75 mL ekleyin: bisacrylamide (19:1) çözeltisi ve 1 mL 10x TBE pH 8.2 steril 50 mL tüp içine.</li>
	<li>60 °C'de bir su banyosu seti kullanarak üreyi berrak bir çözelti ye doğru çözün.</li>
	<li>Taze otoklavlı steril su kullanarak hacmi 10 mL'ye kadar makyajlayın ve jel karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun.</li>
	<li>Taze %10 (w/v) amonyum persülfat çözeltisi hazırlayın.</li>
</ol...

<ol>
	<li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+silencing+in+plants.">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li><li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis.">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li><li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis.">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li><li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants.">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li><li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs.">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li><li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs.">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li><li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species.">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li><li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes.">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li><li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization.">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li><li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing.">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li></ol>

Bu yöntem, daha az bol miRNA'lar da dahil olmak üzere küçük RNA'ların saptanması ve ölçülmesi için yaygın olarak kullanılabilir. Protokol esas olarak bir yükleme tamponunda toplam RNA'nın denatife, jel elektroforezinin boyut ayrımına, RNA'nın bir membrana aktarılmasına, RNA'nın membrana çapraz bağlanmasına ve istenilen radyoetiketli oligo probları kullanılarak hibridize edilmesine yönelik adımları açıklar.
Herhangi bir lekeleme deneyi için kritik adım, numune h...

Küçük düzenleyici RNA'lar, mikroRNA'lar, son keşif onları ve bitki vehayvanlardakirollerini anlamak araştırma yol açmıştır 1 . MiRNA'ların uzun öncüleri HYL1 ve spesifik dicer benzeri proteinler2,3ile 21-24 nt olgun miRNA'lara işlenir. Bir 22 nt miRNA ikincil siRNA'lar4oluşturarak basamaklı susturma başlatabilirsiniz. Çalışmalar gelişme miRNA'lar ve ikincil siRNA'ların rolünü göstermiştir, hücre kaderi ve stres yanıtları5,6.
Kuzey hibridizasyonu belirli RNA moleküllerini tespit etmek için rutin olarak kullanılan deneysel bir yöntemdir. Bu yöntem, toplam RNA7bir havuzdan yaklaşık 19 -24 nt uzun küçük RNA tespitinde kullanımını özelleştirmektedir. Bu gösteride, miRNA'ların saptanması ve ölçülmesi için bu tekniğin kullanımını gösteriyoruz. Bu yöntem, radyoizotoplar kullanarak probların etiketlenmesi kullanır; böylece numunedeki miRNA düzeyleri artan hassasiyetle saptayabilir. PCR tabanlı yöntemlerden farklı olarak, bu yöntem ifadenin nicelemesini ve miRNA'ların boyut tayinini sağlar. Bu protokolde miRNA tespitini geliştiren önemli adımlar gösteriyoruz. MiRNA'ların yüksek çözünürlüklü sinyal algılaması için lekeleme ve hibridizasyon adımlarını değiştirdik. Bu teknik aynı zamanda siRNA, tasi-sekonder RNA ve snoRNA gibi diğer endojen küçük RNA'ların saptanması için de kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide-bisacrylamide solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate (APS)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper</td>
			<td>whatmann blotting paper I</td>
			<td>1001-125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B5525-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary loading tips</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>2239915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized formamide</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Eppendorff</td>
			<td>5350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybond N+nylon membrane</td>
			<td>GE</td>
			<td>RPN203B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization bottle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z374792-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1211V79</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7024-25ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager</td>
			<td>GE- Typhoon scanner</td>
			<td>29187194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphorImager screen and cassette</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>GE28-9564-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson, models: P20 and P10</td>
			<td>FA10002M, FA10003M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipette</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide gel apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658003EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephadex G-25 column</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>27532501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac Concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>20-548-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinwin</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (PNK)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transblot apparatus</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1703946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ULTRAHyb hybridization buffer</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-crosslinker</td>
			<td>UVP</td>
			<td>CL-1000L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Tarsons</td>
			<td>3020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>NEOLAB</td>
			<td>D-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna blot analysis for the detection and quantification of plant micrornas

MicroRNA'lar (miRNA'lar) hem bitkilerde hem de hayvanlarda gen ekspresyonunun düzenlenmesinde rol oynayan endojen olarak ifade edilen kodlamayan, ~21 nt küçük RNA'lar sınıfıdır. MiRNA'ların çoğu, anahtar genleri hedefleyen gen ekspresyonunun negatif anahtarları olarak hareket eder. Bitkilerde, birincil miRNA 'lar (pri-miRNA'lar) transkriptleri RNA polimeraz II tarafından oluşturulur ve pre-miRNA adı verilen kararlı kök-döngü yapılarının değişen uzunluklarını oluştururlar. Bir ensonükleaz, Dicer benzeri1, miRNA-miRNA* dublekslerine pre-miRNA'ları işler. MiRNA-miRNA* dubleks iplikçiklerinden biri seçilir ve hedef mRNA'ların bölünmesine aracılık etmek için Argonaute 1 proteinine veya homologlarına yüklenir. MiRNA'lar anahtar sinyal molekülleri olmasına rağmen, bunların tespiti genellikle hassas bir kuzey leke analizi yerine optimal PCR tabanlı yöntemlerden daha az yöntemle gerçekleştirilir. Biz çok yüksek hassasiyet ile miRNA düzeylerinin sayısallaştırılması için ideal basit, güvenilir ve son derece hassas kuzey yöntemi tarif, kelimenin tam anlamıyla herhangi bir bitki dokusundan. Ayrıca, bu yöntem boyutu, kararlılık ve miRNA ve öncüllerinin bolluğunu onaylamak için kullanılabilir.

Bu gösteride indica rice var whiteponni'nin farklı dokularında miR397 ifadesini tespit ettik ve ölçtük (Şekil 1). miR397 22 nt miRNA ve korunmuş miRNA olduğunu. Test edilen tüm örneklerde miR397 ifadesi saptanabilir. Yeni nesil sıralama verilerine göre, örnek 1 (fide dokusu) milyonda 5 okuma (rpm) miR397'ye sahiptir. Sinyalini rahatça tespit ettik, bu yöntemin çok hassas olduğunu ve çok düşük miktardaki miRNA'ları bile tespit etmek için kullanılabil...

Watch this Scientific Journal Video about RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs at JoVE.com

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA'ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Selam. Yani bu küçük bir RNA kuzey protokolü. Dr. Rashid Akbergenov tarafından optimize edilmiş bir protokol türevi.Bu yöntemde, bir uzunluğu 20-24 nükleotit arasında herhangi bir yerde küçük RNA'lar tespit edebilirsiniz, çok hassas ve çok yüksek çözünürlükte. Protokol temelde geleneksel Kuzey analizinin değiştirilmiş bir şekli, ama burada, akrilamid yüzdesi oldukça yüksek, yüzde 15. Bu kuzey zaten bilinen küçük RNA algılamak için kullanılabilir, mikro RNA veya küçük RNA diğer kümesi, sırası bilindiğinde ya da yeni nesil sıralama veri kümeleri gelen küçük RNA bolluğu onayı için kullanılabilir.Bu yöntemin avantajı, bir sadece mikro RNA bolluk bakamaz, ama aynı zamanda öncüllerin bolluğu, örneğin mikro RNA birkaç yüz nükleotit uzun olabilir yaklaşık 30 bir öncül dışarı bırakabilir, bu da aynı anda tespit edilebilir, mikro RNA ile birlikte. Protokol çok basit, çok yalındır, ancak bu protokolün sonunda listelenen bazı kritik adımları gerçekleştirirken çok dikkatli olmak gerekir. 10 mL jel karışımının hazırlanması için 4,8 gram üre, 3,75 mL %40 Akrilamid çözeltisi ve 1 mL taze hazırlanmış 10X TBE, pH 8,2 ve çözeltiyi hafifçe karıştırın.Çözelti temiz görünene kadar karışımı bir su banyosunda ısıtarak üreyi tamamen çözün. Steril MilliQ su kullanarak hacmi 10 mL'ye çıkarın ve jel karışımını oda sıcaklığına kadar soğutun. Gerekli cihazı deterjanla yıkayın, artık TBE ve Akrilamid'i çıkarmak için hafifçe fırçalayın.Daha fazla MilliQ su ile durulayın ve kurumasını bekleyin. Cam plakayı bir araya getirin, her ikisinin de aynı seviyede olduğundan emin olun. Süngerin üzerine sıkıca yerleştirin.Jel karışımına 8 mikro litre TEMED ve %10 taze hazırlanmış APS'yi 80 mikro litre ekleyin. Yavaşça karıştırın ve monte plakalar için jel karışımı dökün. Jelin sızdırmaz olduğundan emin olun.Taramayı dikkatlice yerleştirin. Jel yaklaşık 45 dakika polimerize sağlar. Jelin polimerizasyonundan sonra cam plakaları montajdan çıkarın.Cam tabakları MilliQ su ile yıkayın. Ve onları çalışan kasete koy. Çalışan kaseti tankın içine yerleştirin.Taze hazırlanmış 1X TBE, pH 8.2 dökün. Taramayı dikkatlice çıkarın. Tampon boruları borulayarak jel kuyularını iyice yıkayın.Bu adım, üre çökeltilerini kuyudan uzaklar ve RNA'nın jel üzerinde düzgün çalışmasını kolaylaştırır. Herhangi bir tampon sızıntısı kontrol etmek için, cihazın kapağını kapatın ve 30 dakika boyunca 80 volt boş jel önceden çalıştırın. 10 mL yükleme boyası hazırlanması için, bromofenol mavisi 5 mg, ksilen siyanol 5 mg ağırlığında ve deioinised formamid 10 mL ekleyin ve iyice karıştırın.Aliquot boya ve saklamak 4 derece daha fazla kullanım için. Aliquot 10 mikrogram toplam RNA steril 1.5 mL tüpler içine. RNA'nın kalitesinin260:230 oranı ikiden büyük veya daha yakındır. Tüpü speedVac'ın içine yerleştirin ve numuneleri vakumlayın kurulayın. 8 mikro litrelik yükleme boyasında kurutulmuş RNA numunelerini yeniden askıya alın.Örnekleri 98 derecede iki dakika ısıtın. Oda sıcaklığında bir dakika soğutun. Yükleme boyasında uygun yeniden süspansiyon sağlamak için soğutulmuş RNA numunelerini girdap.Tüpleri çevirin. Serbest akan RNA almak için ısıtma, soğutma ve girdap adımlarını üç kez tekrarlayın. Jelin ön çalışmasını durdurun.Kuyuların içindeki üre tortularını gidermek için, numuneyi yüklemeden önce kuyuları iyice yıkayın. Yeniden askıya alınan RNA örneklerini 98 derecede bir dakika ısıtın. Kılcal uçlu uçları kullanarak numuneleri sıcak olarak kuyulara yükleyin.Hava kabarcıkları tanıtmaktan kaçının. Tüm numunelerin tam yükleme ve kapağı monte. Bromofenol mavisi tamamen çalışana kadar jeli 80 voltta üç saat veya çalıştırın.Transfer için pozitif yüklü naylon membran kullanın. Cam plakanın boyutlarına kadar kesin. Sağ üst köşedeki membranı etiketle.Membranı steril MilliQ su yüzeyine hafifçe yerleştirin, etiket tarafını su yüzeyine bakacak şekilde aşağıya doğru yerleştirdiğinden emin olun. Temiz bir tepsi alın ve elektro transfer için jel sandviç hazırlamak. Kasetin gri tarafını aşağı yerleştirin.1X TBE'yi kaset seviyesinin biraz üzerine dökün. Lif yastığını 1X TBE'de önceden ıslavetin ve hava kabarcıklarını temizlemek için sıkın. İki parça lekekağıdını fiber ped boyutuna kadar kesin.Bir parça leke kağıdını 1X TBE'de önceden ıslatın ve fiber pedin üzerine yerleştirin. Kağıt üzerinde plastik bir pipet haddeleme hava kabarcıkları çıkarın. Önceden 1X TBE içinde leke kağıt başka bir parça ıslatın ve kaset üzerine koydu.Hava kabarcıkları kaldırmak için üzerinde rulo. Şimdi sandviç kurulumu elektro transfer için hazır. Elektroforez tamamlandıktan sonra, çalıştırmayı durdurun ve kapağı cihazdan çıkarın.Çalışan kaseti kurulumdan çıkarın. Çalışan kasetteki cam plakaları çıkarın. Jeli dikkatlice montajdan çıkarın.İlk yüklenen RNA numunesi saağınıza doğru olacak şekilde lekekağıdının üzerine tökezle. Önceden ıslatılmış membranı 1X TBE'ye yavaşça batırın ve etiketlenmiş tarafa bakacak şekilde jelin üzerine yerleştirin. Membran ve jelin kurumasını izin vermeyin.Hava kabarcığı kaldırmak için yavaşça üzerinde rulo. 1X TBE içinde lekeleme kağıt bir parça Daldırma ve membran üzerine yatıyordu. Hava kabarcıkları kaldırın.Leke kağıt başka bir parça yerleştirin ve hava kabarcıkları kaldırın. Lif yastığını montajın üzerine sererek sandviçi tamamlayın. Kaseti sıkıca kapatın.Trans-blot kasetini modüle yerleştirin. Tankı 1X TBE, pH 8.2 ile doldurun. Cihazın kapağını kapatın ve 4 derece veya soğuk bir odada bir gecede 10 volt transfer.UV çapraz bağlantı hazır tutun ve elektro transferi tamamlanmadan hemen önce, 1200 ayarlayın. Aktarım tamamlandıktan sonra kaseti modülden çıkarın. Nemli membranı bir A4 levhaüzerine yerleştirin ve işaretli tarafı yukarı doğru yerleştirin.120 mili joule'de 254 nanometre UV ışığı ile ışınlama ile RNA'yı membrana çapraz bağla. Çapraz bağlı leke dört derece de saklanabilir veya hibridizasyon için kullanılabilir. Tespit edilmesi gereken küçük RNA'ya tamamen ücretsiz bir sonda tasarla.PNK enzimini kullanarak son etiket son beş asal ucunda probu etiket ve gösterildiği gibi bileşenleri birleştirmek. Reaksiyon karışımını 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka 30 dakika sonra reaksiyon karışımı ndan etiketsiz probları ayırmak için G-25 sütunkullanın.Sondanın daha iyi etiketlemiiçin, g-25 sütunu kullanılmadan önce hazırlayın. Bir hibridizasyon şişesi içinde, üst bakan leke, RNA tarafı yerleştirin. Kullanmadan önce hibridizasyon arabelleği şiddetle karıştırın.Içine hibridizasyon tampon 10 mL ekleyin ve hibridizasyon fırın içine hibridizasyon şişesi yerleştirin, rotasyon ile 35 derece korumak. 20 ila 30 dakika için ön hibridizasyon gerçekleştirin. Ön hibridizasyondan sonra şişeyi fırından çıkarın.Etiketli sondayı melezleştirme arabelleğine yavaşça ekleyin. Hava kabarcıklarının oluşturulmadığından emin olun. 12 saat boyunca rotasyon ile 35 derece fırın içinde leke kuluçka.Melezlemeden sonra, şişeden hibridizasyon arabelleği kaldırın. Yıkama tampon-I kullanarak lekeleri hızlı bir yıkama gerçekleştirin. Bu adım, fazla hibritleştirme çözümlerini lekelerden kaldırmak için gerçekleştirilir.Daha fazla yıkama tampon-I kullanarak 30 dakika boyunca 35 derece lekeler kuluçka. 30 dakika boyunca 35 derece tampon-II kullanarak başka bir yıkama gerçekleştirin. Lekeyı yıkadıktan sonra, bir hibridizasyon kapağının içine yerleştirin, fazla tamponu çıkarın ve mühürleyin.Bir kasetin içine yerleştirin ve 12 saat boyunca radyasyonsuz fosfo-imager ekranına maruz bırakın. Tayfun biyomoleküler görüntüleyici kullanarak hibridizasyon sinyalini algıla ve ImageJ yazılımını kullanarak sonuçları analiz edin. Lekenin diğer problarla melezlenmesi için, resimli olduğu gibi sıyırma adımları gerçekleştirin.Bu teknik ile bir mikro RNA bolluğu tahmin edebilirsiniz, hem de uzunluğu. Bu görüntüden, mikro RNA 397 ifadesi tüm örneklerde tespit edilebilir. Bu lekede, örnek bir bolluk milyonda yaklaşık 5 okur, yeni nesil sıralama verilerine göre, tekniğimizin de daha az bol mikro RNA'ları tespit edebildiğinizi düşündürmektedir.Buna ek olarak, ImageJ niceleme yazılımı kullanarak, bir örnekler arasında mikro 397 ifadesini ölçebilirsiniz. Burada yükleme kontrolleri olarak U6 ve mikro RNA 168 kullandık. Deneyi yaparken göz önünde bulundurulması gereken bazı önemli adımlardan bahsedeceğim.Numune hazırlama için kaliteli RNA kullandığınızdan emin olun. Numuneleri vakumlarken, fazla kurutmaktan kaçının. Yükleme boyasında RNA'nın yeniden askıya alınması çok önemlidir.Serbest akan numune hazırladığından emin olun. Jel yüklenirken dikkatli olunmalıdır. Jel kuyuları yıkanmalı ve numune kuyuların içine düz bir çizgide yüklenmelidir.Elektro transferi sırasında, membranın suya yayılması, 1X TBE daldırma hemen önce esastır, bu transferi artırır. Lekenin hibridizasyonu 35 derecede yapılmalıdır. Hibridizasyon fırınSıcaklığını koruyun.Lekelerin tekrar tekrar kullanımı için membranlar 4 derece olarak saklanmalıdır. 2X SSE'de nemli tutulmalıdır. Diğer PCR tabanlı yöntemlerden farklı olarak, bu yöntem ifadenin niceliğini ve mikro RNA'ların boyutunun belirlenmesini sağlar.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

Küçük RNA miktarının belirlenmesi Sigara kodlama için yüksek yoğunluklu lipoproteinler izolasyonu

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Fare yağ dokusu toplama ve işleme RNA analizi için

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...